CC BY
39УДК 636:612.014.4:576.809.33:619:579.861.2.
DOI 10.33632/1998-698Х.2020-4-4-8
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДБОР ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА И ПОЛНУЮ ИНАКТИВАЦИЮ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА
Гайнутдинов Т.Р. - кандидат биологических наук
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, e-mail: [email protected])
Эксперименты по изучению радиорезистентности культуры золотистого стафилококка были проведены в отделе радиобиологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Гамма-облучение исследуемого материала проводили на установке «Исследователь» с источником излучения 60Со и мощностью экспозиционной дозы 3,7 кГр/час, в дозах 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 кГр. Степень инактивации гамма-облученных микроорганизмов определяли путем высева их в среду Китт-Тароцци с добавлением сыворотки крупного рогатого скота и на солевой мясопептонный агар с последующим термостатированием в течение 7 суток и регистрацией наличия или отсутствия роста микроорганизмов. Проведенными исследованиями показано, что гамма-облучение взвеси микроорганизмов Staphylococcus aureus в диапазонах доз от 20 до 65 кГр вызывает задержку роста, полная инактивация культуры наступает при облучении в дозе 70 кГр.
Ключевые слова: ионизирующее излучение, диапазоны доз, золотистый стафилококк, полная инактивация.
Открытие рентгеновских лучей и явления радиоактивности способствовали созданию совершенно новых направлений в науке, военной и промышленной сферах, энергетике, медицине, биологии, сельском хозяйстве и прочих отраслях народного хозяйства [2].
Основную радиационную нагрузку на биосферу, включая представителей простейших, флоры и фауны, а также человека оказывают последствия испытаний и применения ядерного оружия (Хиросима и Нагасаки), техногенных аварий на АЭС (Чернобыль, Фукусима), космические излучения - естественный радиационный фон [3, 4].
В настоящее время установлены точные диапазоны доз, ионизирующего излучения, вызывающие различные степени лучевых поражений, включая летальные у человека и всех видов лабораторных, сельскохозяйственных животных и птиц, разрабатываются методы и средства их лечения [5, 7, 8].
Относительно микроорганизмов, виды которых по количеству многократно превосходят представителей теплокровных, то их радиочувствительность варьирует в довольно широком спектре доз [1, 6, 12].
Под радиочувствительностью
организмов следует понимать величину поглощенной дозы, способствующей формированию определенного, количественно учитываемого радиобиологического эффекта. В радиационной микробиологии в качестве такого эффекта используют репродуктивную гибель микроорганизмов, т.е. потерю способности их размножаться [9].
На радиочуствительность микроорганизмов влияет множество факторов, зависящих от условий, при которых проводится облучение, а также генетической детерминированности самой клетки. К факторам, изменяющим чувствительность клетки к воздействию ионизирующей радиации, относятся: температурный режим, присутствие кислорода или других газов, состав и свойства питательных сред, в которых производится облучение, мощность дозы и вид облучательной техники и т.д. [10].
Все микроорганизмы по
чувствительности к излучениям могут быть расположены в следующем порядке. Наиболее чувствительны бактерии, затем следуют дрожжи, споры бактерий и, наконец, вирусы. Однако, такое распределение следует считать условным, ввиду того, что среди бактерий существуют виды,
значительно более устойчивые к воздействию ионизирующей радиации, чем споры или вирусы [11].
Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы, является определение дозы ионизирующего излучения, при которой происходит полная инактивация золотистого стафилококка.
Материалы и методы. В качестве объекта исследований был отобран патогенный штамм 209 Staphylococcus aureus, культуру которого выращивали на жидкой питательной среде Китт-Тароцци с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, и на плотной -мясопептонном агаре (МПА) с добавлением 10% хлорида натрия. Спустя 3 сут термостатирования, выращенную на плотной среде культуру смывали физиологическим раствором. Культуру золотистого стафилококка, выращенную на жидкой питательной среде, как и смыв с солевого МПА осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 40 мин, надосадочную жидкость сливали, осадок доводили дистиллированной водой используя эталон стандарта мутности по Л.А. Тарасевичу до 10 ед. (1 млрд/мл) и колориметрически при помощи КФК-2 (светофильтр с длиной волны 540 нм), параллельно готовили мазки и окрашивали
их по Граму для определения чистоты и идентичности выращенной культуры.
Полученные взвеси культуры разливали в стерильные флаконы емкостью 10, 50 или 100 мл, укупоривали их резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками, маркируя с указанием дозы облучения и даты.
Облучение микробного материала проводили на гамма-установке «Исследователь», с источником излучения Со и мощностью экспозиционной дозы 3,7 кГр/час, в диапазоне доз от 20 до 70 кГр с междозовым интервалом 5 кГр.
Степень инактивации гамма-облученных микроорганизмов определяли путем высева их в среду Китт-Тароцци и на солевой мясопептонный агар. Учет наличия или отсутствия роста и его интенсивность вели в течение 7 суток. С выращенных культур делали мазки, окрашивали по Граму, микроскопировали под иммерсией с 90-кратным увеличением.
Результаты исследований.
Результаты микробиологических исследований по определению интенсивности роста микроба в среде Китт-Тароцци представлены в таблице 1, на солевом мясопептонном агаре - в таблице 2.
Таблица 1- Интенсивность роста облученной культуры St. аureus на жидкой питательной среде
Доза облучения (кГр) Срок исследования (часы)
24 48 72 96 120 144 168
20 + ++ +++ +++ +++ +++ +++
25 + ++ ++ +++ +++ +++ +++
30 + ++ ++ ++ ++ ++ ++
35 + ++ ++ ++ ++ ++ ++
40 + + + + + ++ ++
45 + + + + + ++ ++
50 + + + + + ++ ++
55 + + + + + ++ ++
60 + + + + + + +
65 — + + + + + +
70
Контроль (не облученная культура) +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Условные обозначения: ( - ) - отсутствие роста; ( + ) - слабый рост; ( ++ ) - умеренный рост; ( +++ ) - обильный рост.
Из таблицы 1 видно, что гамма-облучение в диапазоне доз от 20 до 70 кГр по-разному влияло на жизнеспособность золотистого стафилококка. Зависимость
интенсивности роста исследуемого биоматериала от дозы отчетливо проявлялась при облучении в дозах от 20 до 35 кГр. Так, если через 24 ч после радиационного воздействия в
указанных дозах рост стафилококка был слабым, то через 48 ч - умеренным, а при дозах от 40 до 60 кГр - слабым, при дозах 65 и 70 кГр не выявлялся. Интенсивность роста облученного материала через 96 часов инкубации проявлялась как обильная для культуры, подвергнутой воздействию ионизирующей радиации в дозах 20 и 25 кГр, умеренной - 30, 35 кГр, слабой в диапазоне от 40 до 65 кГр, при 70 кГр рост отсутствовал. Дальнейшая инкубация микроорганизма
( +++ ) - обильный рост.
Данные таблицы 2 свидетельствуют, что в первые 3 сут после воздействия ионизирующей радиации в дозах от 20 до 45 кГр отмечали слабый рост по сравнению с необлученным контролем. На 4-е сут после высева образцов, облученных в дозах от 50 до 70 кГр, рост микроорганизмов не регистрировался, спустя 120 ч инкубирования отсутствие роста отмечалось в более узком диапазоне доз (60, 65 и 70 кГр). На данный срок исследований в интервале доз от 30 до 55 кГр фиксировался слабый рост посеянной культуры. На 7 сут эксперимента (конец срока исследований) отсутствие роста наблюдалось лишь в образце, облученном в дозе 70 кГр, при наличии такового слабого в пределах доз от 45 до 65 кГр, умеренного 35, 40 кГр и обильного при дозах 20, 25, 30 кГр.
Проведенными исследованиями
показа-но, что вид питательной среды оказывает влияние на динамику роста облученной культуры St. aureus. Так, в жидкой питательной среде Китт-Тароцци с
характеризовалась обильным ростом культуры в пробах, подвергнутых гамма-облучению в дозах 20, 25 кГр, умеренным на 5-е сут 30, 35 кГр, слабым при облучении в диапазонах доз от 40 до 65 кГр, в дозе 70 кГр рост отсутствовал. На 6-е и 7-е сут культивирования обильный рост наблюдали в образцах проб облученных в дозах 20 и 25 кГр, умеренный при 30, 35, 40, 45, 50, 55 кГр, слабый 60, 65 кГр и не отмечали при 70 кГр.
добавлением сыворотки отсутствие роста St. aureus наблюдали в первые сутки инкубации культуры, облученной в дозе 65 кГр. В солевом МПА отсутствие роста фиксировали при дозах облучения 50, 55 кГр в первые 4 сут и на 5-е сут в дозах 60, 65 кГр. Рост исследуемой культуры не отмечали при облучении ее в дозе 70 кГр, независимо от вида и состава питательной среды. Следовательно, питательная среда Китт-Тароцци с добавле-нием сыворотки крупного рогатого скота является более благоприятной для роста облученного материала.
При микроскопии мазков, приготовленных из облученного материала, в поле зрения отчетливо обнаруживали грамм-положительные одиночные и парные кокки в виде несимметричных виноградных гроздей, характерные для данной культуры.
Заключение. Экспериментально, с использованием широкого диапазона доз гамма-облучения культуры золотистого стафилококка установлено, что полная инактивация его наступает при поглощенной
Таблица 2 - Интенсивность роста облученной культуры St. аш^ш на солевом агаре
Доза облучения (кГр) Срок исследования (час)
24 48 72 96 120 144 168
20 + + ++ ++ +++ +++ +++
25 + + + ++ ++ +++ +++
30 + + + + + ++ +++
35 + + + + + ++ ++
40 + + + + + + ++
45 + + + + + + +
50 — — — — + + +
55 — — — — + + +
60 + +
65 + +
70
Контроль (необлученная культура) ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Условные обозначения: ( - ) - отсутствие роста; ( + ) - слабый рост; ( ++ ) - умеренный рост;
дозе 70 кГр. Питательная среда оказывает влияние на интенсивность роста облученной культуры St. аигеш, отчетливое
ингибирование ее наблюдается в диапазоне доз от 40 до 65 кГр в среде Китт-Тароцци и 20-65 кГр - в солевом мясопептонном агаре.
Литература
1. Алексахин, Р.М. Перспективы использования радиационных технологий в агропромышленном комплексе Российской Федерации / Р.М. Алексахин, Н.И. Санжарова, Г.В. Козьмин, С.А. Гераськин, А.Н. Павлова // Вестник РАЕН. - 2014.- № 1. - С. 65.
2. Алексахин, Р.М. Проблемы радиоэкологии: Эволюция идей. Итоги / Р.М. Алексахин. -М.: Россельсхозакадемия, 2006. - 880 с.
3. Алексахин, Р.М. Ядерная энергия и биосфера / Р.М. Алексахин. - М.: Энергоиздат, 1982. -
215 с.
4. Бондаренко, А.П. Основы радиационной экологии: учебно пособие / А.П. Бондаренко -Павлодар, 2006. - 124 с.
5. Васин, М.В. Средства профилактики и лечения лучевых поражений / М.В. Васин. - М., 2004. - 329 с.
6. Гайнутдинов, Т.Р. Влияние гамма-облучения на резистентность возбудителя некробактериоза / Т.Р. Гайнутдинов, Н.Б. Тарасова, В.П. Шашкаров, А.М. Идрисов // Вопросы современной науки: проблемы, тенденции и перспективы: X Междунар. научн. - практ. конф., г. Москва, 13 марта 2017.- М., 2017. - С. 5.
7. Гайнутдинов, Т.Р. Способ лечения радиационных поражений организма / Т.Р. Гайнутдинов, Р.Н. Низамов, В.П. Шашкаров, А.И. Никитин, А.М. Идрисов, Г.В. Конюхов, Н.Б. Тарасова // Патент № 2675598 С1 Рос. Федерация, МПК А61К 35/74, А61Р 43/00; заявитель и патентообладатель ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - № 2018123061; заявл. 25.06.2018; опубл. 20.12.2018, Бюл. № 35.
8. Иванов, А.В. Радиовакцины: проблемы и перспективы / А.В. Иванов, Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов. - Казань.: Изд-во Казан. гос. ун.-та, 2008. - 499 с.
9. Клемпарская, Н.Н. Антибактериальный иммунитет и радиорезистентность / Н.Н. Клемпарская, Н.В. Раева, В.Ф. Сысоева. - М.: Медгиз, 1963. - 120 с.
10. Козьмин, Г.В. Радиационные технологии в сельском хозяйстве и пищевой промышленности / Г.В. Козьмин, С.А. Гераськин, Н.И. Санжарова. - Обнинск: ВНИИ РАЭ, 2015. - 400 с.
11. Патент РФ № 2682712 С1, МПК А61К 35/74, А61К 39/085, А61Р 43/00 Способ лечения радиационных поражений организма / Т.Р. Гайнутдинов, Р.Н. Низамов, В.П. Шашкаров, А.И. Никитин,
A.М. Идрисов, Г.В. Конюхов, Н.М. Василевский; заявитель и патентообладатель ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - № 2018123042; заявл. 25.06.2018; опубл. 21.03.2019, Бюл. № 9.
12. Шашкаров, В.П. Использование ионизирующего излучения для инактивации возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных: Методические рекомендации /
B.П. Шашкаров, Т.Р. Гайнутдинов, А.М. Идрисов, В.А. Гурьянова, К.Н. Вагин, Н.М. Василевский, К.Т. Ишмухаметов, М.И. Гулюкин - Москва: РАН, 2019. - 17 с.
EXPERIMENTAL SELECTION OF DOSES OF IONIZING RADIATION CAUSING GROWTH INHIBITION AND FULL INACTIVATION OF GOLDEN STAFILOKOK
Gaynutdinov T.R. - Сandidate of Biological Sciences
FSBSI "Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety", (420075, Kazan, Nauchny gorodok-2, e-mail: [email protected])
Experiments to study the radioresistance of Staphylococcus aureus culture were carried out in the Department of Radiobiology of the Federal State Budgetary Scientific Institution "FCTRBS-RRVI". Gamma irradiation of the test material was carried out on the Researcher installation with a 60Co radiation source and an exposure dose of 3.7 kGy/hour, at doses of20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 kGy. The degree of inactivation of gamma-irradiated microorganisms was determined by plating them on Kitt-Tarozzi medium with the addition of cattle serum and salt meat and peptone agar, followed by incubation for 7 days and recording the presence or absence of microorganism growth. Studies have shown that gamma irradiation of a suspension of Staphylococcus aureus microorganisms in dose ranges from 20 to 65 kGy causes growth retardation, complete inactivation of the culture occurs when irradiated at a dose of 70 kGy.
Keywords: ionizing radiation, dose ranges, Staphylococcus aureus, complete inactivation.
Refenerces
1. Aleksakhin, R.M. Prospects for the use of radiation technologies in the agricultural sector of the Russian Federation / R.M. Aleksakhin, N.I. Sanzharova, G.V. Kozmin, S.A. Geraskin, A.N. Pavlova // Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences. - 2014, No. 1. - P. 65.
2. Aleksakhin, R.M. Problems of Radioecology: The Evolution of Ideas. Results / R.M. Aleksakhin. -Moscow: Russian Agricultural Academy, 2006. - 880 p.
3. Aleksakhin, R.M. Nuclear Energy and the Biosphere / R.M. Aleksakhin. - M.: Energoizdat, 1982. -
215 p.
4. Bondarenko, A.P. Fundamentals of radiation ecology: textbook / A.P. Bondarenko - Pavlodar, 2006. - 124 p.
5. Vasin, M.V. Means of prevention and treatment of radiation injuries / M.V. Vasin. - M., 2004 . -
329 p.
6. Gaynutdinov, T.R. The effect of gamma radiation on the resistance of the causative agent of necrobacteriosis / T.R. Gaynutdinov, NB Tarasova, V.P. Shashkarov, A.M. Idrisov // Questions of modern science: problems, trends and prospects: X Intern. scientific - prakt. conf., Moscow, March 13, 2017. -M., 2017.- 5 p.
7. Patent RF No. 2675598 C1, IPC A61K 35/74, A61P 43/A method for the treatment of radiation injuries of the body / T.R. Gaynutdinov, R.N. Nizamov, V.P. Shashkarov, A.I. Nikitin, A.M. Idrisov, G.V. Konyukhov, N.B. Tarasova; Applicant and patent holder of the Federal State Budgetary Institution "«FCTRBS-ARRVI". - No. 2018123061; declared 06/25/2018; publ. 12/20/2018, Bull. Number 35.
8. Gaynutdinov, T.R. A method for the treatment of radiation injuries of the body / T.R. Gaynutdinov, R.N. Nizamov, V.P. Shashkarov, A.I. Nikitin, A.M. Idrisov, G.V. Konyukhov, N.M. Vasilevsky // Patent No. 2682712 C1 Ros. Federation, IPC A61K 35/74, A61K 39/085, A61P 43/00; Applicant and patent holder of the Federal State Budgetary Institution "FTsTRB-VNIVI". - No. 2018123042; declared 06/25/2018; publ. 03/21/2019, Bull. Number 9.
9. Ivanov, A.V. Radio vaccines: problems and prospects / A.V. Ivanov, R.N. Nizamov, G.V. Grooms. - Kazan .: Kazan publishing house. state Univ., 2008. - 499 p.
10. The use of ionizing radiation for the inactivation of pathogens of infectious diseases of farm animals: Guidelines / V.P. Shashkarov, T.R. Gaynutdinov A.M. Idrisov, V.A. Guryanova, K.N. Vagin, N.M. Vasilevsky, K.T. Ishmukhametov, M.I. Gulyukin - Moscow: RAS, 2019 .- 17 p.
11. Klemparskaya, N.N. Antibacterial immunity and radioresistance / N.N. Klemparskaya, N.V. Raeva, V.F.Sysoeva. - M .: Medgiz, 1963 .- 120 p.
12. Kozmin, G.V. Radiation technologies in agriculture and food industry / G.V. Kozmin, S.A. Geraskin, N.I. Sanzharova. - Obninsk: VNII RAE, 2015. - 400 p.
УДК:619:617.711/.713-002-022.6:636.2 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-4-8-14
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ MORAXELLA BOVOCULI В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ИФА
Дуплева Л.Ш. - кандидат биологических наук, Спиридонов Г.Н. - доктор биологических наук, Хусаинов И.Т. - мл. н. с.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, Казань, Научный городок-2, e-mail: [email protected]).
Приведены результаты исследования по созданию иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета. В качестве основных компонентов в иммуноферментной тест-системе использованы антиген, изготовленный из штамма «СХ-Ч6№-ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi путем разрушения бактериальных клеток на ультразвуковом дезинтеграторе, а также положительная и отрицательная к бактериям Moraxella bovoculi сыворотки крупного рогатого скота. По результатам шахматного титрования антигена, контрольных сывороток и пероксидазного конъюгата установлены их оптимальные рабочие дозы. Проведено лабораторное испытание специфичности и чувствительности иммуноферментной тест-системы. В результате исследований установлено, что все компоненты набора чувствительны, специфичны и активны. С использованием «Набора
