CC BY
34
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
лабораториях в разное время; этот феномен универсален для разных линий ММСК, выделенных из разных линий мышей, а также для клеток ММСК подкожного жира [5] и костного мозга [7] человека;
скорость такой трасформации в культуре, по видимо му, гораздо выше, чем ожидалось, поскольку уже на 3 м пассаже (3 недели) ММСК мыши и человека [7] начинают приобретать хромосомные мутации и теряют контактное ингибирование роста;
мутантные ММСК почти в 100% дают опухоли у имму нодефицитных мышей при их пересадке на 6 м пассаже
(5 7 недель культивирования); для человеческих ММСК са мое раннее формирование опухолей было показано на 5 м пассаже [7];
в клинических испытаниях, использующих ММСК чело века, размноженных в культуре, по видимому, необходимо ввести обязательный анализ кариотипа для контроля хро мосомных аномалий перед введением клеток; однако еле дует отметить, что все исследования по онкогенности ММСК до этого были проведены на иммунодефицитных аллогенных или сингенных моделях, что не соответствует клинической ситуации.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Caplan A.I., Dennis J.E.Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. Cell Biochem. 2006; 98(5): 1076 84.
2. Caplan A.I., Bruder S.P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21 st century. Trends Mol. Med. 2001; 7(6): 259 64.
3. http://www.osiristx.com/clinicaLtrials.php.
4. Riggi N., Cironi L., Provero P. et al. Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow derived mesenchymal progenitor cells. Cancer Res. 2006; 65: 11459 68.
5. Rubio D., Garcia Castro J., Martin MC, de la Fuente R. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65(8): 3035 9.
6. Miura M., Miura Y., Padilla Nash H.M. et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2006; 24(4): 1095 103.
7. Wang Y., Huso D.L., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherapy 2005; 7(6): 509 19.
8. Tolar J., Nauta A.J., Osborn M.J. et al. Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells. Stem Cells 2007; 25(2): 371 9.
9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315 7.
Подготовили О. Дорошенко и AB, Берсенев По материалам: Cancer fíes. 2006; 66(22): 10849-54
Спонтанный мутагенез и образование сарком -ф- из мезенхимальных стромальных клеток -ф-
костного мозга
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) являются одним из самым привлекательных кан дидатов для клеточной терапии различных заболеваний. Однако серия недавних экспериментальных работ свидель ствует о потенциальном риске канцерогенеза при транс плантации этого вида взрослых стволовых клеток [1 3].
В недавней работе, опубликованной в онлайн версии жур нала Stem Cells, описывается образование сарком у мышей после введения культивированных ММСК. Аллогенные ММСК на 9 м пассаже трансфецировали генетической конструкци ей и сортировали по яркости метки. Меченые клетки переса живали вместе с костным мозгом летально облучённым мы шам. В качестве генетической конструкции для идентификации клеток использовали невирусные транспозоны (мобильных элементов генома).
Неожиданно мыши, у которых была выявлена наибольшая активность метки, погибли. Основной причиной смерти слу жила дыхательная недостаточность, которая развилась у жи вотных в связи с образованием в лёгких оссификатов (2 8 очагов у каждого животного) и опухолей. У двух из них, кроме того, были обнаружены такие же опухоли в конечностях. После гистологического анализа новообразования были классифи цированы как саркомы (опухоли мезенхимального происхож дения).
Клетки из опухолей были выделены и проанализированы на наличие генетических аберраций. Авторы проверили как нетрансфецированные пассированные ММСК, так и транс фецированные клетки. Во всех типах клеток были выявлены спонтанные необратимые хромосомные мутации. Кроме того,
исследователи показали, что спонтанный мутагенез первич ных ММСК в культуре не зависит от линии мышей.
Генетическое картирование того сайта, куда был встро ен транспозон, свидетельствовало о независимости прояв ления активации онкогенов и экспрессии трансгена. Не было зафиксировано и экспрессии р53 одного из наиболее изу ченных опухолевых супрессоров клетки. Нетрансформирован ные пассированные ММСК, использованные в аналогичных экспериментах ¡n vivo, дали сходные результаты. Это свиде тельствует о том, что опухолевая трансформация не была сопряжена с действием транспозонов.
При серийных трансплантациях эти клетки также давали злокачественные опухоли. Авторы выделили отдельную линию переродившихся клеток (S1), способных к самообновлению. Цитогенетический профиль линии S1 напоминает клетки че ловеческой саркомы и может использоваться в модельных экспериментах по противоопухолевому иммунному ответу. Возможно, образование опухолей ¡n vivo связано с иммуно модулирующими свойствами ММСК, которые, по мнению авторов, вызывая иммуносупрессию, создают благоприят ные условия для развития опухоли. Однако, основные события, связанные с мутагенезом происходят в процессе культивиро вания и исследователи пока не могут объяснить образова ние генетических аномалий при пассировании ММСК.
В связи с началом клинических испытаний ММСК сегодня возникает острая необходимость в разработке требований и протоколов (в том числе с использованием генетического и хромосомного анализа) по тестированию клеток на предмет онкогенетической безопасности перед их введением.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
■ И I II II
■ III
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Rubio D., Garcia Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65(8): 3035 9.
2. Miura M., Miura Y., Padilla Nash H.M. et al. Accumulated chromosomal
instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2006; 24(4): 1095 103.
3. Wang Y., Huso D.L., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherapy 2005; 7(6): 509 19.
Подготовила B.C. Мелихова По материалам: Stem Cells online Oct, 12,2006
Клетки костного мозга могут являться источником разнообразных типов новообразований
Внедрение в клиническую практику методов трансплан тации клеток для лечения негематологических заболеваний наряду с удивительными возможностями таит в себе и ряд потенциальных угроз. Дефицит клеточного материала при водит к попыткам экспансии необходимых популяций клеток In vitro. В процессе культивирования клетки находятся вне физиологического окружения. Использование факторов ро ста, отсутствие контроля со стороны иммунной системы и, возможно, факторов, контролирующих клеточную пролифе рацию и апоптоз, могут являться причиной повышенного риска злокачественной трансформации. Подобные рассуж дения подкреплены экспериментальными исследованиями, в которых наблюдалась спонтанная злокачественная транс формация различных популяций стволовых и прогенитор ных клеток костного мозга в культуре [1 3]. В настоящий момент уже получены первые данные, что культивируемые клетки могут являться источником опухолей при трансплан тации экспериментальным животным [4]. Таким образом, риск возникновения новообразований у человека при транс плантации клеток представляет собой реальную угрозу. Со ответственно, все аспекты процессов злокачественной трансформации исследуемых популяций клеток должны под вергнуться тщательному изучению.
В журнале «Neoplasia» исследовательской группой Liu опубликована работа, посвященная изучению опухолевого потенциала способных к адгезии клеток костного мозга мыши.
Изучаемую популяцию клеток в течение 7 дней подвер гали обработке канцерогеном 3-метилхолантреном. По истечении 8 недель после обработки наблюдались все при знаки злокачественной трансформации клеток: характерные морфологические изменения, быстрый рост, утрата адгезии к пластику и контактного торможения. При культивировании в полутвердой среде около 18 из 4000 трансформирован ных клеток в течение 8 недель образовали колонии.
Исследование In vitro на наличие тканеспецифичных маркеров показало, что в стандартных условиях культиви рования (DMEM и 10% FBS) трансформированные клетки костного мозга характеризуются высокой степенью эксп рессии маркеров клеток эпителия, эндотелия, глии, нейро нов и мышечных тканей.
Трансплантация трансформированных клеток мужских особей под кожу самок иммунодефицитных мышей приводи ла к появлению опухолей в месте инъекции у всех животных. При исследовании тканевых срезов наблюдались признаки злокачественных новообразований: атипия клеток, патоло гический митоз, гигантские опухолевые клетки, а в некото рых случаях и инвазивный рост в окружающие ткани. Трансплантация клеток опухолей вторичным животным при водила к появлению аналогичных новообразований.
Гистологический и иммуноцитохимический анализ выявил следующие типы опухолей: опухоли из мышечных тканей, опу холи из эндотелия кровеносных сосудов, фибробластоподоб ные опухоли, эпителиальные опухоли, нейральные и малодиф ференцированные опухоли. Кроме того, встречались опухоли, в которых обнаружены дериваты разных зародышевых лист ков. Клетки всех новообразований содержали Y хромосому и, следовательно, имели донорское происхождение.
Могут ли разные типы опухолей являться производными одной мультипотентной опухоль инициирующей клетки? Для ответа на этот вопрос с помощью метода серийных разве дений авторы клонировали трансформированные клетки. Отдельные клетки могли пассироваться не менее 10 раз без какой либо потери способности к формированию колоний. Анализ наличия критических факторов транскрипции, не обходимых для поддержания самообновления и плюрипо тентности у эмбриональных стволовых клеток [5, 6], пока зал, что клонированные клетки характеризуются высокой степенью экспрессии 0СТ4, S0X2 и NANOG.
В свою очередь, трансплантация клонированных клеток иммунодефицитным мышам приводила к формированию опухолей у всех животных. В одной из опухолей обнаружены дериваты трех зародышевых слоев, включая мышцы, хрящи, кератиноциты, плоский эпителий, однослойный эпителий, эле менты глии и сходные с нейронами клетки. Следовательно, данное новообразование по всем формальным признакам являлось тератомой. В других новообразованиях обнаруже ны дериваты 1 2 зародышевых листков.
Таким образом, в данном исследовании показано, что от дельные трансформированные клетки были способны к само обновлению и формированию колоний (клонов). Клетки подоб ных колоний характеризовались высокой степенью экспрессии ключевых эмбриональных транскрипционных факторов 0СТ4, S0X2 и NANOG, а также многих тканеспе цифичных маркеров. Кроме того, клонированные клетки мо гут являться источником разных типов новообразований и даже тератом при трансплантации иммунодефицитным мышам. По всем формальным признакам описанные выше трансформи рованные клетки костного мозга соответствуют определению мультипотентных опухоль инициирующих клеток.
Остается неясным, какая популяция клеток костного моз га может являться источником мультипотентных опухоль инициирующих клеток. Ранее разные исследовательские группы описали среди клеток костного мозга клетки с ши рокой потенцией к дифференцировке. В частности, группа М. Kucia описала популяцию клеток VSEL (very small embryonlc like) [7], группа С. Verfaillie описала МАРС (multipotent adult progenitor cells) [8]. Тем не менее, не ис ключено, что способность опухоль инициирующих клеток к
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
