CC BY
27
■ И I II II
■ I I I
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Rubio D., Garcia Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65(8): 3035 9.
2. Miura М., Miura Y., Padilla Nash H.M. et al. Accumulated chromosomal
instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2006; 24(4): 1095 103.
3. Wang Y., Huso D.L., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherapy 2005; 7(6): 509 19.
Подготовила B.C. Мелихова По материалам: Stem Cells online Oct, 12,2006
Клетки костного мозга могут являться источником разнообразных типов новообразований
Внедрение в клиническую практику методов трансплан тации клеток для лечения негематологических заболеваний наряду с удивительными возможностями таит в себе и ряд потенциальных угроз. Дефицит клеточного материала при водит к попыткам экспансии необходимых популяций клеток in vitro. В процессе культивирования клетки находятся вне физиологического окружения. Использование факторов ро ста, отсутствие контроля со стороны иммунной системы и, возможно, факторов, контролирующих клеточную пролифе рацию и апоптоз, могут являться причиной повышенного риска злокачественной трансформации. Подобные рассуж дения подкреплены экспериментальными исследованиями, в которых наблюдалась спонтанная злокачественная транс формация различных популяций стволовых и прогенитор ных клеток костного мозга в культуре [1 3]. В настоящий момент уже получены первые данные, что культивируемые клетки могут являться источником опухолей при трансплан тации экспериментальным животным [4]. Таким образом, риск возникновения новообразований у человека при транс плантации клеток представляет собой реальную угрозу. Со ответственно, все аспекты процессов злокачественной трансформации исследуемых популяций клеток должны под вергнуться тщательному изучению.
В журнале «Neoplasia» исследовательской группой Liu опубликована работа, посвященная изучению опухолевого потенциала способных к адгезии клеток костного мозга мыши.
Изучаемую популяцию клеток в течение 7 дней подвер гали обработке канцерогеном 3-метилхолантреном. По истечении 8 недель после обработки наблюдались все при знаки злокачественной трансформации клеток: характерные морфологические изменения, быстрый рост, утрата адгезии к пластику и контактного торможения. При культивировании в полутвердой среде около 18 из 4000 трансформирован ных клеток в течение 8 недель образовали колонии.
Исследование in vitro на наличие тканеспецифичных маркеров показало, что в стандартных условиях культиви рования (DMEM и 10% FBS) трансформированные клетки костного мозга характеризуются высокой степенью эксп рессии маркеров клеток эпителия, эндотелия, глии, нейро нов и мышечных тканей.
Трансплантация трансформированных клеток мужских особей под кожу самок иммунодефицитных мышей приводи ла к появлению опухолей в месте инъекции у всех животных. При исследовании тканевых срезов наблюдались признаки злокачественных новообразований: атипия клеток, патоло гический митоз, гигантские опухолевые клетки, а в некото рых случаях и инвазивный рост в окружающие ткани. Трансплантация клеток опухолей вторичным животным при водила к появлению аналогичных новообразований.
Гистологический и иммуноцитохимический анализ выявил следующие типы опухолей: опухоли из мышечных тканей, опу холи из эндотелия кровеносных сосудов, фибробластоподоб ные опухоли, эпителиальные опухоли, нейральные и малодиф ференцированные опухоли. Кроме того, встречались опухоли, в которых обнаружены дериваты разных зародышевых лист ков. Клетки всех новообразований содержали Y хромосому и, следовательно, имели донорское происхождение.
Могут ли разные типы опухолей являться производными одной мультипотентной опухоль инициирующей клетки? Для ответа на этот вопрос с помощью метода серийных разве дений авторы клонировали трансформированные клетки. Отдельные клетки могли пассироваться не менее 10 раз без какой либо потери способности к формированию колоний. Анализ наличия критических факторов транскрипции, не обходимых для поддержания самообновления и плюрипо тентности у эмбриональных стволовых клеток [5, 6], пока зал, что клонированные клетки характеризуются высокой степенью экспрессии 0СТ4, S0X2 и NANOG.
В свою очередь, трансплантация клонированных клеток иммунодефицитным мышам приводила к формированию опухолей у всех животных. В одной из опухолей обнаружены дериваты трех зародышевых слоев, включая мышцы, хрящи, кератиноциты, плоский эпителий, однослойный эпителий, эле менты глии и сходные с нейронами клетки. Следовательно, данное новообразование по всем формальным признакам являлось тератомой. В других новообразованиях обнаруже ны дериваты 1 2 зародышевых листков.
Таким образом, в данном исследовании показано, что от дельные трансформированные клетки были способны к само обновлению и формированию колоний (клонов). Клетки подоб ных колоний характеризовались высокой степенью экспрессии ключевых эмбриональных транскрипционных факторов 0СТ4, S0X2 и NANOG, а также многих тканеспе цифичных маркеров. Кроме того, клонированные клетки мо гут являться источником разных типов новообразований и даже тератом при трансплантации иммунодефицитным мышам. По всем формальным признакам описанные выше трансформи рованные клетки костного мозга соответствуют определению мультипотентных опухоль инициирующих клеток.
Остается неясным, какая популяция клеток костного моз га может являться источником мультипотентных опухоль инициирующих клеток. Ранее разные исследовательские группы описали среди клеток костного мозга клетки с ши рокой потенцией к дифференцировке. В частности, группа М. Kucia описала популяцию клеток VSEL (very small embryonic like) [7], группа С. Verfaillie описала МАРС (multipotent adult progenitor cells) [8]. Тем не менее, не ис ключено, что способность опухоль инициирующих клеток к
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
І І І І І І
■ І І І
Новости клеточных технологий
дифференцировке в производные трех зародышевых листков обусловлено мутациями и хромосомными перестройками, зат рагивающими функционирование соответствующих генов.
Исследование І_іи еі аі. является очередной работой, данные которой предостерегают нас от поспешных клини ческих испытаний. В настоящий момент мы не обладаем
достаточной информацией для оценки риска и профилак тики возникновения новообразований, источником которых могут являться вводимые клетки. Этот аспект клеточной трансплантологии, несомненно, находится только в началь ной фазе своего изучения и требует дальнейших крупномас штабных исследований.
Смесь коммитированных опухолевых клеток-предшественников
1
(*)(*) * МХА %
Мультипотентная
опухоль-инициирующая клетка
■/ МХА Ж (*) Щ
• • •
Трансформация культивируемых клеток костного мозга
Трансплатация трансформированных клеток иммунодефицитным мышам
• •
Формирование смешанных типов опухолей (в т.ч. и тератомы)
2
Схема происхождения смешанных типов опухолей при трансплантации трансформированных клеток костного мозга иммунодефицитным мышам может быть объяснено двумя причинами:
1. Согласно первой гипотезе, среди трансформированных клеток костного мозга находятся коммитированные в разных направлениях дифференцировки опухолевые клетки-предшественники. Трансплантация смеси таких клеток иммунодефицитным мышам приводит к развитию смешанных типов опухолей
2. Согласно второй гипотезе, среди трансформированных клеток костного мозга существуют мультипотентные опухоль-инициирующие клетки, которые имеют аналогичные эмбриональным стволовым клеткам потенции к дифференцировке. Экспериментальные данные, полученные путем клонирования единичных трансформированных клеток, свидетельствуют
в пользу второй гипотезы. МХА - 3-метилхолантрен
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Rubio D., Garcia Castro J., Martin M. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65(8): 3035 9.
2. Miura М., Miura Y., Padilla Nash H. et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stem cells leads to malignant transformation. Stem Cells 2006; 24(4): 1095 103.
3. Wang Y., Huso D., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherapy 2005; 7(6): 509 19.
4. Tolar J., Nauta A., Osborn M. et al. Sarcoma Derived from Cultured
Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells online 2006; Oct. 12.
5. Boyer L., Lee T., Cole M. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122: 947 56.
6. Orkin S. Chipping away at the embryonic stem cell network. Cell 2005; 122: 828 30.
7. Kucia M., Reca R., Campbell F. et al. A population of very small embryonic like (VSEL) CXCR4nSSEA 1 [~)Qct4~ stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia 2006; 20(5): 857 69.
8. Reyes M., Verfaillie C. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001; 938: 231 3.
Подготовил B.C. Сергеев По материалам: Neoplasia 2006: 8/9: 716-724
Трансплантация фоторецепторных клеток для коррекции слепоты в эксперименте
Среди причин частичной или полной утраты зрения зна чительная доля приходится на патологию фоторецепторного аппарата врожденных аномалий, отслойку сетчатки различ ного генеза, пигментную дистрофию сетчатки и др. К сожале нию, существующие способы лечения не всегда эффективны, а при ряде заболеваний радикальные методы коррекции вообще отсутствуют. Вместе с тем, установлено, что 80 90% информации о состоянии внешнего мира человек получает посредством зрения. Утрата этого чувства или его суще ственное ослабление приводит к стойкой инвалидизации, почти полной социальной дезадаптации.
Сетчатая оболочка глаза сложно устроенная структура, по своему гистогензу вполне соответствующая части голов ного мозга, вынесенной на периферию организма. На 4 5 й неделях эмбриогенеза происходит выпячивание глазного пузыря из материала выстилки переднего отдела будущего мозга. На этой стадии будущая сетчатка представлена дву мя слоями нейробластов.
В дальнейшем происходит увеличение количества клеток и их дивергентная дифференцировка, которая приводит к тому, что к 8 му месяцу внутриутробного развития челове ка формируется морфологически дефинитивная сетчатка. Функциональное «созревание» фоторецепторного аппара та происходит и после рождения. В сетчатке выделяют 10 слоев, три из которых представляют собой уровни располо жения последовательно соединенных нейронов.
Слой, в котором расположены первые нейроны зритель ного анализатора, граничит с пигментными клетками. Возбуж дение, возникшее в фоторецепторных нейронах палочках и колбочках, передается на второй нейрон биполярный; в дальнейшем их отростки переключаются на ганглионарные клетки, чьи аксоны и формируют зрительный нерв. Таким образом, фоторецепторные клетки палочки и колбочки, расположенные в наружном ядерном слое, являются видо измененными нейронами, интегрированными в сложную нейронную сеть сетчатки, и, как свойственно подавляюще му большинству нейронов, камбиальные элементы для кле точной регенерации сетчатки практически отсутствуют.
Еще в 20 х годах прошлого века исследователи пред принимали попытки трансплантации фоторецепторного ап парата (у земноводных). Первая успешная пересадка сет чатки млекопитающего датируется 1959 годом, когда были трансплантированы части сетчатки. Будучи помещенными
в глазные среды, они не погибали сразу, но и не интегриро вались в сетчатку реципиента [1].
В дальнейшем реципиентам пересаживали нейроблас ты предшественники палочек и колбочек, полученные из фетального материала. Предпринимались попытки осуще ствлять трансплантации после этапа культивирования in vitro: трансплантировались фоторецепторы взрослых особей, одна ко результаты этих исследований были весьма противоречи вы и не получили существенного дальнейшего развития [2, 3]. Одним из критериев успешной трансплантации является формирование синаптических связей между фоторецепто рами и нейронами реципиента, чего удавалось добиться лишь в единичных случаях [4, 5]. Однако, настоящих успехов уда лось добиться только исследовательской группе R. MacLaren и R.R. Ali, о чем сообщил журнал Nature 9 ноября 2006 г.
Исследователи из Британии считают, что пересаживать следует не ранние предшественники палочек и колбочек, а постмитотические прекурсоры на стадии начала образо вания межклеточных синаптических связей. В ходе экспери мента, выполненного на мышах, страдающих генетическим дефектом дегенерацией сетчатки, показано, что переса женные клетки, полученные от трансгенных [GFP , CFPi ре ципиентов на сроках от 1 до 15 дня постнатальной жизни, способны колонизировать сетчатку в пределах наружного ядерного слоя и дифференцироваться в фоторецепторы. Наибольший успех был достигнут с применением клеток, полученных от мышат в возрасте 3 5 дней. Реципиентам инъецировали от 300 до 10ОО клеток в субретинальный слой. Пересаженные клетки дифференцировались в мор фологически идентифицируемые палочки и колбочки. Они формировали функционирующие синаптические связи с биполярными клетками, что было доказано возникновени ем и проведением электрических потенциалов в ответ на освещение и поведением ранее слепых мышей.
Вероятность слияния пересаженных клеток с фоторецеп торами реципиента была сведена к минимуму посредством пересадки GFP^ клеток CFP^ реципиентам. При конфокаль ной микроскопии кофлюоресценция не была обнаружена ни в одном из наблюдений. Кроме того, ядра пересаженных клеток были маркированы Brdll, что также подтвердило до норское происхождение сформированных фоторецепторных клеток в сетчатке реципиента. Показано, что клетки, полу ченные от животных в возрасте до 3 х дней, еще способны
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
