CC BY
47
■■■ ■ I I I I I I I -ф- I ■ ■ TT1
Новости клеточных технологий
НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ К вопросу о спонтанной онкогенетической трансформации мультипотентных мезенхимальных стромальных стволовых клеток
Способность мультипотентных мезенхимальных стро мальных клеток (ММСК) костного мозга к дифференцировке в ткани мезенхимального происхождения (костную, хряще вую, мышечную, жировую) делает их одним из самых при влекательных источников материала для регенеративной медицины [1, 2]. Однако, в последние годы появились иссле дования, предостерегающие от преждевременного широко го применения ММСК, в связи с риском онкогенетической трансформации этих клеток. Так, несколькими группами ис следователей было показано, что при определённых услови ях in vitro или индукции онкогенами, после трансплантации in vivo у реципиентов развиваются опухоли из ММСК [4 8]. Однако, ставить знак равенства между ММСК, исследуемыми в эксперименте, и коммерческими «продуктами» на основе ММСК человека, которые находятся на разных стадиях кли нических испытаний [3], не совсем корректно. С другой сторо ны, нельзя игнорировать поток работ по этой тематике, указы вающий на огромный интерес и неизученность проблемы.
В недавнем исследовании, выполненном в Johns Hopkins University School of Medicine (USA), результаты которого опубликованы в журнале Cancer Research, более детально изучается спонтанный канцерогенез из ММСК мыши. Это не первая работа, демонстрирующая онконтрансформацию ММСК мыши (6, 8] и человека (5, 7] в культуре, без воздей ствия каких либо индуцирующих факторов. Группа Daniel Rubio после выхода работы по спонтанной онкотрансфор мации ММСК (5) указывала, что необходимо проведение более широкомасштабных (в разных лабораториях) и де тальных исследований, поскольку трансформация в их экс периментах не являлась универсальной и наблюдалась не во всех образцах. Поэтому каждое новое исследование и сопоставление результатов, полученных разными лабора ториями, крайне важно для понимания механизмов онкоге неза и клинического будущего данной технологии.
Изначальной целью работы было изучение реваскуля ризации ишемизированных мышц с помощью введения ММСК. Исследователи изолировали клетки костного мозга и культивировали адгезивную фракцию мононуклеаров для получения ММСК. Уже на третьем пассаже клетки начина ли формировать трехмерные структуры, что свидетельство вало об утрате контактного ингибирования. В эти же сроки исследователи наблюдали возникновение хромосомных аномалий (в основном анеуплоидии). На седьмом пассаже фенотип клеток сильно отличался от исходного и отвечал описанному для человеческих ММСК с характерной высо кой экспрессией Sea 1 и CD44, повышенной экспрессией CXCR4 и CD105. При этом гемопоэтические и эндотелиаль ные маркёры не экспрессировались (CD45, CD34, CD31 , CD11 b, с kit, Flk 1 , VEGFR2 ). Эти данные согласуются с работой Wang Y., выполненной на ММСК человека и демон стрирующей потерю контактного ингибирования и изменение
морфологии клеток также на третьем пассаже, а первые хромосомные аномалии - на пятом (7).
Для реализации исходной задачи (реваскуляризации ишемизированных мышц) внутривенно или внутримышеч но вводили миллион клеток иммунодефицитным nude или SCID мышам, которым предварительно удаляли участок ар терии левого бедра. Через 35 дней после трансплантации животных умерщвляли и анализировали новообразования, возникновение которых наблюдали уже через 3 4 недели с момента инъекций. В последующих экспериментах также использовали животных без нарушения кровообращения и получали аналогичный результат. У контрольных животных (введение физиологического раствора) образования опухо лей не наблюдали. Клетки опухолей, представляющих из себя саркому, давали такие же опухоли через 2 недели после их пересадки вторичным реципиентам сингенным иммуноком петентным мышам. Интересно, что при внутримышечном введении наблюдали возникновение сарком мягких тканей у всех животных, а при внутривенном введении опухоли так же обнаруживали в лёгких с очагами оссификации.
Авторы подчеркивают, что возникновение опухолей, по их мнению, не связано с лотами фетальной бычьей сыво ротки, которые использовалась в экспериментах. Также под черкивается, что наблюдаемый канцерогенез не связан с линией мышей (линии ММСК, дающие опухоли, были изо лированы от 2 х разных линий мышей). Кроме того, экспе рименты повторяли разные исследователи в разное время. Интересно, что попытки исследователей повторить получен ные результаты на клетках костного мозга крысы не увенча лись успехом. Тем не менее, ученые предостерегают о воз можной клинической релевантности полученных данных.
Перспективным направлением, которое обозначают сами исследователи, является поиск специфичных маркеров МСК, позволяющих выделять чистую популяцию клеток без пред варительного культивирования. Тем самым возможно будет избежать риска онкотрансформации одним только фактом отсутствия культивирования. Однако, следует отметить, что сами исследователи формально работали не с идентичными и гетерогенными популяциями, ведь фенотип определяли на седьмом пассаже, после потери контактного ингибирования (пассаж 3), детекции тотальной тетраплоидии (пассаж 6), а инъекцию реципиентам выполняли на шестом пассаже. Кро ме того, для характеристики клеточной популяции как «ММСК» исследователи применили только фенотипический анализ кле ток, без проверки функциональных характеристик in vitro, что рекомендуется делать группой экспертов (9).
Из настоящей работы и ряда предшествующих исследо ваний следует несколько важных выводов:
факт спонтанной онкогенетической трансформации ММСК костного мозга мыши и человека присутствует, т.к. это было чётко продемонстрировано в нескольких независимых
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
лабораториях в разное время; этот феномен универсален для разных линий ММСК, выделенных из разных линий мышей, а также для клеток ММСК подкожного жира [5] и костного мозга [7] человека;
скорость такой трасформации в культуре, по видимо му, гораздо выше, чем ожидалось, поскольку уже на 3 м пассаже (3 недели) ММСК мыши и человека [7] начинают приобретать хромосомные мутации и теряют контактное ингибирование роста;
мутантные ММСК почти в 100% дают опухоли у имму нодефицитных мышей при их пересадке на 6 м пассаже
(5 7 недель культивирования); для человеческих ММСК са мое раннее формирование опухолей было показано на 5 м пассаже [7];
в клинических испытаниях, использующих ММСК чело века, размноженных в культуре, по видимому, необходимо ввести обязательный анализ кариотипа для контроля хро мосомных аномалий перед введением клеток; однако еле дует отметить, что все исследования по онкогенности ММСК до этого были проведены на иммунодефицитных аллогенных или сингенных моделях, что не соответствует клинической ситуации.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Caplan A.I., Dennis J.E.Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. Cell Biochem. 2006; 98(5): 1076 84.
2. Caplan A.I., Bruder S.P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21 st century. Trends Mol. Med. 2001; 7(6): 259 64.
3. http://www.osiristx.com/clinicaLtrials.php.
4. Riggi N., Cironi L., Provero P. et al. Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow derived mesenchymal progenitor cells. Cancer Res. 2006; 65: 11459 68.
5. Rubio D., Garcia Castro J., Martin MC, de la Fuente R. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65(8): 3035 9.
6. Miura M., Miura Y., Padilla Nash H.M. et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2006; 24(4): 1095 103.
7. Wang Y., Huso D.L., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherapy 2005; 7(6): 509 19.
8. Tolar J., Nauta A.J., Osborn M.J. et al. Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells. Stem Cells 2007; 25(2): 371 9.
9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315 7.
Подготовили О. Дорошенко и AB, Берсенев По материалам: Cancer fíes. 2006; 66(22): 10849-54
Спонтанный мутагенез и образование сарком -ф- из мезенхимальных стромальных клеток -ф-
костного мозга
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) являются одним из самым привлекательных кан дидатов для клеточной терапии различных заболеваний. Однако серия недавних экспериментальных работ свидель ствует о потенциальном риске канцерогенеза при транс плантации этого вида взрослых стволовых клеток (1 3].
В недавней работе, опубликованной в онлайн версии жур нала Stem Cells, описывается образование сарком у мышей после введения культивированных ММСК. Аллогенные ММСК на 9 м пассаже трансфецировали генетической конструкци ей и сортировали по яркости метки. Меченые клетки переса живали вместе с костным мозгом летально облучённым мы шам. В качестве генетической конструкции для идентификации клеток использовали невирусные транспозоны (мобильных элементов генома).
Неожиданно мыши, у которых была выявлена наибольшая активность метки, погибли. Основной причиной смерти слу жила дыхательная недостаточность, которая развилась у жи вотных в связи с образованием в лёгких оссификатов (2 8 очагов у каждого животного) и опухолей. У двух из них, кроме того, были обнаружены такие же опухоли в конечностях. После гистологического анализа новообразования были классифи цированы как саркомы (опухоли мезенхимального происхож дения).
Клетки из опухолей были выделены и проанализированы на наличие генетических аберраций. Авторы проверили как нетрансфецированные пассированные ММСК, так и транс фецированные клетки. Во всех типах клеток были выявлены спонтанные необратимые хромосомные мутации. Кроме того,
исследователи показали, что спонтанный мутагенез первич ных ММСК в культуре не зависит от линии мышей.
Генетическое картирование того сайта, куда был встро ен транспозон, свидетельствовало о независимости прояв ления активации онкогенов и экспрессии трансгена. Не было зафиксировано и экспрессии р53 одного из наиболее изу ченных опухолевых супрессоров клетки. Нетрансформирован ные пассированные ММСК, использованные в аналогичных экспериментах ¡n vivo, дали сходные результаты. Это свиде тельствует о том, что опухолевая трансформация не была сопряжена с действием транспозонов.
При серийных трансплантациях эти клетки также давали злокачественные опухоли. Авторы выделили отдельную линию переродившихся клеток (S1), способных к самообновлению. Цитогенетический профиль линии S1 напоминает клетки че ловеческой саркомы и может использоваться в модельных экспериментах по противоопухолевому иммунному ответу. Возможно, образование опухолей ¡n vivo связано с иммуно модулирующими свойствами ММСК, которые, по мнению авторов, вызывая иммуносупрессию, создают благоприят ные условия для развития опухоли. Однако, основные события, связанные с мутагенезом происходят в процессе культивиро вания и исследователи пока не могут объяснить образова ние генетических аномалий при пассировании ММСК.
В связи с началом клинических испытаний ММСК сегодня возникает острая необходимость в разработке требований и протоколов (в том числе с использованием генетического и хромосомного анализа) по тестированию клеток на предмет онкогенетической безопасности перед их введением.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
