CC BY
97. Brans R., Dicker H., Bruckner T. et al. // Toxicology.
2005. 212. P. 148—154.
8. Rendic S, DiCarlo F.J. // Drug Metab. Rev. 1997. 29. P. 413—580.
9. Schnuch A, Westphal G.A, Muller M.M. et al. // Contact Dermatitis. 1998. 38. P. 209—11.
10. Smith C.D.A., Harrison D.J. // Lancet. 1997. Vol. 350. P. 630—633.
11. Westphal G.A, Reich K, Schulz T.G. et al. // J. Dermatol. 2000. 142. P. 1121—1127.
Поступила 28.03.11
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Кузьмина Людмила Павловна,
зав. лабораторией биохимии и молекулярной диагностики с группой иммунологических исследований, докт. биол. наук, проф. E-mail: [email protected] Измерова Наталия Ивановна,
зав. клиническим отделом, докт. мед. наук, проф. E-mail: [email protected] Коляскина Мария Михайловна,
аспирант, мл. нучн. сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной диагностики с группой иммунологических исследований. E-mail: [email protected]
УДК 613.62:622.411.52
А.Г. Жукова, Е.В. Уланова, Д.В. Фоменко, А.С. Казицкая, Т.К. Ядыкина
СПЕЦИФИЧНОСТЬ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА НА ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ТОКСИКАНТОВ
НИИ комплексных проблем гигиены и профзаболеваний СО РАМН, г. Новокузнецк
Работа посвящена изучению влияния угольно-породной пыли и высоких концентраций фтора на энергетический обмен и окислительно-восстановительные реакции в лейкоцитах крови экспериментальных крыс. Показано, что существуют различия в ответной реакции клеток на длительное воздействие угольно-породной пыли и высоких концентраций фтора.
Ключевые слова: угольно-породная пыль, хроническая фтористая интоксикация, лейкоциты, гипоксия, энергетический обмен.
A.G. Zhukova, E.V. Ulanova, D.V. Fomenko, A.S. Kazitskaya, T.K. Yadykina. Specificity of cellular response to various occupational toxicants
Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medicine, Novokuznetsk
The article covers study concerning influence of coal rock dust and high fluorine concentrations on energy metabolism and oxidation-reduction reactions in blood WBC of experimental rats. The authors demonstrated that the cells vary in response to long action of coal rock dust and high fluorine concentrations.
Key words: coal rock dust, chronic fluorine intoxication, WBC, hypoxia, energy metabolsim.
Формирование устойчивости к действию повреждающих факторов обеспечивается высокой активностью компенсаторно-приспособительных процессов, направленных на поддержание гомео-стаза и сохранение нормальной жизнедеятельности организма. Однако истощение приспособительных механизмов приводит к формированию специфических патологических состояний, обусловленных свойствами повреждающего фактора. К числу агентов, вызывающих специфическую патологию, относятся вредные производственные факторы, например действие высоких концентраций фтора, угольно-породной пыли (УПП) на организм, приводящие к развитию
хронической фтористой интоксикации (ХФИ) и антракосиликоза, соответственно.
Показано, что сопутствующими факторами патогенеза ХФИ и антракосиликоза являются гипоксические состояния [1, 9]. Среди наиболее значимых механизмов развития гипоксических состояний выделяют нарушения энергетического баланса клетки [2], изменение работы АТФ-зависимых ионных каналов и связанных с ними путей внутриклеточной сигнализации, в том числе и редокс-сигнальной системы, действие которой опосредовано активацией свободнора-дикальных процессов в клетке [5, 6].
Известно, что при гипоксических состояниях
и различных заболеваниях клеточные элементы крови претерпевают определённые изменения, которые отражают состояние всего организма в целом и эффективность применяемого лечения [4]. Поэтому в данной работе оценили особенности реакции лейкоцитов периферической крови на длительное действие высоких концентраций УПП и фтора в эксперименте.
М а т е р и а л ы и м е т о д и к и. Работа выполнена на белых крысах-самцах массой 200—250 г. Для затравки УПП крыс помещали в пылевую камеру цилиндрической формы объёмом 130 л. Крысы вдыхали УПП (уголь марки ГЖ) ежедневно в течение 2 нед (средняя концентрация пыли 50 мг/м3). ХФИ моделировалась путём пассивного запаивания среднеток-сической дозой фторида натрия в течение 6 нед (ежедневно с питьевой водой в концентрации 10 мг/л, что соответствует суточной дозе 0,5 мг/кг массы тела). Содержание животных и проведение экспериментов проводилось в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals».
Функциональное состояние лейкоцитов крови оценивали по изменению активности сукцинатде-гидрогеназы (СДГ), цитоплазматической и ми-тохондриальной а-глицерофосфатдегидрогеназ (а-ГФДГ) цитохимическим методом.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 согласно рекомендациям по проведению биомедицинской статистики [3]. Для сравнения независимых выборок использовали непараметрический Mann-Whitney U Test. Различия между выборками считались достоверными при р < 0,05 или, в ряде случаев, р < 0,01. Результаты исследований в таблицах представлены в виде тройки цифр — нижний квартиль (25 % персентиль) — медиана — верхний квартиль (75 % персентиль), дающих представление о центральной тенденции, ширине и асимметрии распределения результатов.
Р е з у л ь т а т ы и и х о б с у ж д е н и е. Воздействие производственных факторов в частности, высокие концентрации УПП или фтора
может приводить либо к развитию адаптивной реакции организма, либо вызывать снижение функциональной активности органов и систем, то есть дизадаптацию. Однако существуют некоторые различия в развитии компенсаторных реакций организма в ответ на длительное воздействие УПП или высоких концентраций фтора, что обусловлено природой действующих факторов.
Влияние УПП на активность СДГ, цитоплазматической и митохондриальной Ъ-ГФДГ в лейкоцитах крови крыс. Из табл. 1 видно, что длительное вдыхание УПП приводило к активации гликолиза и сукцинатоксидазного пути окисления субстратов в лейкоцитах экспериментальных крыс. Так, через две недели действия УПП на организм повышалась активность СДГ, цитоплазматической и митохондриальной 5-ГФДГ на 35, 18 и 11 % соответственно.
Известно, что анаэробный путь образования энергии — гликолиз — активируется при гипоксии, что позволяет рассматривать его как компенсаторный механизм, способствующий поддержанию энергетического статуса клеток в условиях нарушения функции аэробного окисления. Кроме того, выявленная активация сук-цинатоксидазного пути в период длительного действия УПП необходима для формирования срочных защитных механизмов организма от кислородной недостаточности, которые способствуют увеличению резистентности организма. Ключевая роль в этом процессе принадлежит специфическому белковому фактору, индуцируемому при гипоксии — HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor).
Показано, что индукция HIF-1 или его подавление определяются состоянием дыхательной цепи митохондрий и в частности состоянием митохондриальных ферментных комплексов (МФК) I и II [2]. При нормальном уровне кислорода содержание HIF-1 в клетке минимально. Такой низкий уровень HIF-1 регулируется за счёт его протеасомной деградации в цитозоле клеток с помощью гидроксилирования ферментами пролил-4-гидроксилазами. Важную роль в регуляции активности ферментов пролил-
Т а б л и ц а 1
Изменение активности ферментов в лейкоцитах крови крыс на ранних стадиях антракосиликоза
Серия СДГ а-ГФДГ цит а-ГФДГ мит
Контроль, n = 10 9,17—9,33—9,36 7,47—7,98—8,32 7,81—8,25—8,3
Антракосиликоз, n = 15 12,2—12,57—12,98 *р < 0,01 8,9—9,43—9,65 *р < 0,01 9,72—9,13—10,39 *р < 0,01
* Здесь и в табл. 2 — достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann—Whitney U Test).
4-гидроксилаз играет уровень кислорода, Ре2+,
5-кетоглутарата и аспартата. 5-Кетоглутарат синтезируется в реакциях цикла трикарбоно-вых кислот и поступает в цитозоль через малат-аспартатный шунт. Окисляется 5-кетоглутарат в реакциях субстратного фосфорилирования и в НАД-зависимых реакциях, катализируемых МФК I. При гипоксии перенос электронов в дыхательной цепи на участке МФК I и работа малат-аспартатного шунта ингибируются. В результате этого в цитозоле создаётся дефицит 5-кетоглутарата и аспартата. На фоне ингибиро-вания МФК I начинается усиление образования сукцината, окисление которого в дыхательной цепи при гипоксии имеет термодинамические преимущества. Дефицит 5-кетоглутарата и увеличение уровня сукцината в клетке приводит к инактивации ферментов пролил-4-гидроксилаз и стабилизации И1Р-1, что способствует его аккумуляции в ядре и активации транскрипции Независимых генов [10]. Продукты регулируемых И1Р-1 генов участвуют в поддержании важных физиологических функций в организме, таких как ангиогенез, эритропоэз, гликолиз, транспорт железа, клеточная пролиферация.
Одним из важных следствий активации И1Р-1 при гипоксии является синтез защитных белков семейства ИБР, например стрессиндуцибельного белка ИБР70 и ряда белков с антиоксидантной активностью, как прямой — ферменты антиоксидантной защиты, так и опосредованной — гем-оксигеназа-1 (ИОх-1). В наших экспериментах показано, что изменение уровня этих защитных белков при гипоксии имеет тканеспецифичный характер и коррелирует с индукцией И1Р-1. Так, обнаружены корреляционные взаимосвязи между индукцией И1Р-1 и ИОх-1 в сердце, лёгких и печени, но не в головном мозге, а также И1Р-1 и ИБР70 во всех четырёх органах. При этом в лёгких степень активации ИОх-1 была максимальной, а ИБР70 минимальной по сравнению с сердцем, печенью и головным мозгом.
Недавно показано увеличение уровня конститутивных форм белков семейства ИБР — ИБС73 и ИОх-2 в лимфоцитах крови шахтёров с пылевой патологией органов дыхания [11]. На-
копление этих белков в клетке свидетельствует об углублении тканевой гипоксии.
Таким образом, при длительном вдыхании УПП основной составляющей компенсаторных реакций является гипоксическая компонента, что подтверждается достоверным увеличением активности СДГ и а-ГФДГ в лейкоцитах экспериментальных крыс. Об этом же свидетельствуют двукратное увеличение количества эритроцитов и гемоглобина в крови через шесть недель затравки УПП.
Влияние ХФИ на активность СДГ, цито-плазматической и митохондриальной а-ГФДГ в лейкоцитах крови крыс. Известно, что для интоксикации фтором характерно разнообразное воздействие на обменные процессы — фтор выступает в качестве регулятора активности ферментов в клетке. Так, показана способность ионов фтора ин-гибировать ферменты гликолиза [8], дыхательной цепи митохондрий, в частности СДГ [7].
Из табл. 2 видно, что ХФИ не изменяла активность СДГ в лейкоцитах экспериментальных крыс. Однако достоверно снижала активность цитоплазматической и митохондриальной а-ГФДГ на 30 и 15 % соответственно.
Изменение активности митохондриальных ферментов при ХФИ в конечном итоге проявляется снижением продукции макроэргов, уменьшением соотношения АТФ/АДФ. Так, показано, что через 4 нед ХФИ в эритроцитах крови крыс значительно снижается уровень АТФ и АДФ на фоне повышения АМФ. Через 8 нед ХФИ уровень АДФ ещё больше снижается. Эти данные свидетельствует о снижении энергетического потенциала клетки и нарушении функций митохондрий. Такая направленность метаболических изменений коррелирует с данными литературы [1], согласно которым поражающий эффект высоких концентраций фтора обусловлен снижением активности системы антиоксидантной защиты, разобщением окисления и фосфорили-рования, вызывающими нарушения энергетического метаболизма и развитие тканевой гипоксии.
Кроме того, отсутствие активации сукци-натоксидазного пути окисления (МФК II) в митохондриях клеток может сопровождаться
Т а б л и ц а 2
Влияние хронической фтористой интоксикации на изменение активности ферментов в лейкоцитах крови крыс
Серия СДГ а-ГФДГ цит а-ГФДГ мит
Контроль, n = 10 3,9—4,25—4,38 6,65—6,9—7,08 4,23—4,55—5,18
ХФИ, n = 6 3,9—4,25—4,6 4,55—4,8—4,9 *р < 0,01 3,58—3,85—4,05 *р < 0,05
снижением экспрессии HIF-1 в клетках. Так, было показано снижение уровня мРНК HIF-1 в лейкоцитах людей с ХФИ [8]. Сохранение высокой активности сукцинатоксидазного пути окисления имеет принципиальное значение для формирования резистентности к действию повреждающих факторов. Имеются корреляционные связи между интенсивностью экспрессии HIF-1, интенсивностью активации сукцина-токсидазного пути окисления и способностью организма формировать в условиях действия повреждающих факторов адаптивные реакции.
В настоящее время известно, что универсальным ответом на воздействие повреждающих факторов среды является развитие окислительного стресса и нарушение структуры и функции биологических мембран. Поэтому существует многокомпонентная система антиоксидантной защиты, которая позволяет поддерживать интенсивность свободнорадикальных процессов на оптимальном уровне, без угрозы их резкой активации и участия в развитии различных патологических состояний. Показано, что синтез белков срочного ответа, обладающих прямой антиоксидантной активностью — СОД, каталаза, глутатионпе-роксидаза регулируется фактором транскрипции HIF-1 [5]. В связи с этим снижение экспрессии HIF-1 при ХФИ может приводить к подавлению синтеза ферментов антиоксидантной защиты. Действительно, на экспериментальной модели ХФИ у крыс показано снижение уровня антиоксидантной защиты — активность каталазы и глутатионпероксидазы была снижена на 35 и 53 %, соответственно. Нарушение баланса между про- и антиоксидантными процессами приводило к снижению резистентности мембранных структур эритроцитов и клеток печени [1].
Таким образом, для ХФИ характерно нарушение энергетического обмена и развитие тканевой гипоксии, что подтверждается отсутствием активации сукцинатоксидазного пути окисления субстратов и снижением активности цитоплазма-тической и митохондриальной а-ГФДГ.
В ы в о д ы. 1. Существуют различия в клеточном ответе на длительное воздействие угольно-породной пыли и высоких концентраций фтора. 2. Длительное воздействие угольно-породной пылью вызывает активацию сукцинатдегидрогеназы и цитоплазматической и митохондриаль-ной а-глицерофосфатдегидрогеназы в лейкоцитах экспериментальных крыс. 3. Для длительного воздействия высоких концентраций фтора характерно отсутствие активации сукцинатоксидазного пути окис-
ления субстратов и снижение активности цитоплазматической и митохондриальной а-глицерофосфатдегидрогеназы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Конык У.В., Гжегоцкий М.Р., Коваленко Е.А. и др. // Hyp. Med. J. 2001. Т. 9, № 1—2. С. 6—8.
2. Лукьянова Л.Д. // Патогенез. 2008. № 3. С. 4—12.
3. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: Изд-во РАМН, 2000.
4. Пшенникова М.Г., Хоменко И.П., Круглов С.В. и др. // Бюл. эксп. биол. и мед. 2008. Т. 146, № 10. С. 391—395.
5. Сазонтова Т.Г., Анчишкина Н.А., Архипенко Ю.В., Жукова А.Г. // Вестн. РАМН. 2007. № 2. С. 17—25.
6. Турпаев К.Т. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 339— 352.
7. Dabrowska E., Balunowska M., Letko R. // Ann. Acad. Med. Stetin. 2006. Vol. 52, Suppl 1. P. 9—15.
8. Otsuki S., Morshed S.R., Chowdhury S.A. et al. // J. Dent. Res. 2005. Vol. 10, № 84. P. 919—923.
9. Schins R.P.F., Borm P.J.A. // Ann. Occup.Hyg. 1999. Vol.43, № 1. P. 7—33.
10. Semenza G.L. // Biochem. Pharmacol. 2002. Vol. 64. P. 993—998.
11. Xing J.C, Chen W.H, Wang F. et al. // Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 2006. Vol. 9, № 24. P. 540—543.
Поступила 17.07.09
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Жукова Анна Геннадьевна,
вед. научн. сотрудник лаборатории экспериментальных гигиенических исследований, докт. биол. наук. E-mail: [email protected] Уланова Евгения Викторовна,
ст. научн. сотрудник лаборатории экспериментальных гигиенических исследований, канд. мед. наук. E-mail: [email protected] Фоменко Диана Валерьевна,
ст. научн. сотрудник лаборатории экспериментальных гигиенических исследований, канд. мед. наук. E-mail: [email protected] Казицкая Анастасия Сергеевна,
биолог лаборатории популяционной генетики. E-mail: [email protected] Ядыкина Татьяна Константиновна,
мл. научн. сотрудник лаборатории популяционной генетики. E-mail: [email protected]
