CC BY
41
экспериментальные исследования в Биологии и медицине
УДК 615.244-322
т.А. Ажунова1, С.в. лемза1, А.г. Мондодоев1, Э.А. Алексеева2
специфическая фармакологическая активность комплексного растительного средства «гепатон»
1 Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ) 2 ГОУ ВПО Бурятский государственный университет (Улан-Удэ)
В работе представлены данные по фармакологической активности комплексного растительного средства «Гепатон». Установлено, что «Гепатон» обладает, выраженной антиоксидантной, мембраностабилизирующей и желчегонной активностью.
Ключевые слова: «Гепатон», антиоксидантная активность, мембраностабилизирующая активность, желчегонное действие
SpEciFic pHARMAcoLoGicAL AcTMTiES oF complex pLANT pREpARATioN «hepaton»
T.A. Azhunova1, S.V. Lemza1, A.G. Mondodoev1, E.A. Alekseyeva2 11nstitute of General and Experimental Biology BSC SB RAS (Ulan-Ude)
2 Buryat State University (Ulan-Ude)
Data on pharmacological activities of complex plant preparation are presented. It has been found that «Hepaton» shows strong antioxidant, membrane stabilizing and choleretic activities.
Key words: «Hepaton», antioxidant activity, membrane stabilizing activity, choleretic effect
Поражения печени являются широко распространенной патологией и занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения. Причинами развития заболеваний печени могут быть вирусы, токсические вещества, гормональные и метаболические нарушения, неправильное питание, хронические болезни пищеварительной системы и др. Болезни органов пищеварения также занимают одно из ведущих мест, уступая заболеваниям органов дыхания и системы кровообращения. Среди них болезни желчного пузыря и желчевыводящих путей (холецистит, желчнокаменная болезнь, билиарная дисфункция) являются наиболее распространенными: их частота колеблется от 26,6 до 45,5 на 1000 населения. В настоящее время среди заболевших преобладают молодые люди и подростки, тогда как в 70 — 80-х годах прошлого века 50 % заболевших приходилось на лиц старше 40 — 50 лет [6, 7, 11, 14].
В наши дни увеличению производства и продаж растительных препаратов способствуют экологический настрой населения развитых стран, стремящегося предупреждать и лечить болезни с помощью витаминных, иммуномодулирующих и других средств природного происхождения. Так, если в 1990 г. растительные лекарственные средства приобретали лишь 2,5 % американцев, то в 1997 г. их использовали уже 12,1 % жителей США
[15]. Сходная тенденция наблюдается и в других западных странах, не говоря уже о странах Востока, где издавна отдавалось предпочтение препаратам природного происхождения.
В связи с этим возрастает актуальность поиска новых лекарственных препаратов, обладающих гепатопротекторными свойствами, в частности, фитопрепаратов, которые имеют широкий диапазон действия и обладают такими важными преимуществами, как малая токсичность, высокая эффективность, доступность, взаимозаменяемость и возможность длительного применения без побочных проявлений. [13]. Преимущественная фармакотерапевтическая и профилактическая эффективность многокомпонентных средств обусловлена не только их воздействием на патологический процесс, но и их регулирующим влиянием на различные функциональные системы с повышением резистентности организма в целом.
Цель работы — изучение специфической фармакологической активности комплексного растительного средства с условным названием «Гепатон», в состав которого входят цветки ромашки аптечной (Matricaria recutita L.), листья мяты перечной (Mentha piperita L.), плоды шиповника (Rosa sp.), плоды боярышника (Crataegus sp.), трава зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), корни солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis
Fisch.), корневища и корни девясила высокого (Inula helenium L.).
материалы и методы
Исследования проводились на крысах обоего пола линии Wistar с исходной массой 180 — 200 г (n = 7). В зависимости от условия эксперимента животным опытной группы вводили водный раствор «Гепатона» однократно внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг в объеме 10 мл/кг (подробнее смотрите в соответствующих разделах статьи). Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Влияние «Гепатона» на желчеобразовательную и желчевыделительную функцию печени оценивали по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, в которой определяли содержание основных ее ингредиентов: желчных кислот [4], билирубина [9], холестерина [3]. Активность глу-татионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), каталазы (КАТ) и пируваткиназы (ПК) определяли по [8]. Активность каспазы-3 определяли согласно методическим рекомендациям к набору реактивов (Caspase-3 Assay Kit, Sigma).
Значимость различий между сравниваемыми группами оценивали по t-критерию Стьюдента с использованием пакета статистических программ Biostat-6. Различия считались достоверными при P < 0,05.
результаты и обсуждение
Влияние «Гепатона» на желчегонную и желчеобразовательную функцию печени Как следует из данных, приведенных в таблице
1, наиболее выраженная желчегонная активность была у крыс, получавших «Гепатон» в дозе 50 мг/кг. Так, скорость секреции желчи через 1—2 часа после введения испытуемого средства в указанной дозе возрастала на 42 % и 32 % по сравнению с аналогичными данными в контрольной группе.
Холеретическая реакция сохранялась на высоком уровне в течение 5 часов. При этом «Гепатон» стимулировал выделение желчных кислот, суммарная концентрация которых превышала таковую у крыс контрольной группы на 42,5 %. Кроме этого, испытуемое средство заметно повышает выделение с желчью билирубина и холестерина.
Мембраностабилизирующая активность «Гепатона»
Эксперименты проведены с использованием 1% суспензии донорских эритроцитов. Оценку мембраностабиизирующей активности «Гепатона» осуществляли по степени гемолиза эритроцитов, который вызывали реактивом Фентона (перекис-ный гемолиз) и добавлением дистиллированной воды (осмотический гемолиз) [2]. «Гепатон» исследовали в концентрациях, соответствующих 25, 50 и 100 мг/кг. Степень гемолиза измеряли через 24 часа по поглощению при 420 нм. Действие «Гепатона» на степень гемолиза эритроцитов оценивали в процентах по отношению к поглощению в контроле (без добавления экстракта в инкубационную среду). Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2.
Как следует из таблицы, «Г епатон» в указанных дозах оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие, о чем свидетельствует уменьшение степени перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов. При этом показано, что наиболее высокая мембраностабилизирующая активность «Гепатона» отмечается при использовании его в дозе 50 мг/кг, в этом случае гемолиз эритроцитов уменьшается в 2,2 раза по сравнению с контролем. Увеличение дозы испытуемого фитоэкстракта до 100 мг/кг сопровождается снижением устойчивости мембран эритроцитов к действию реагента Фентона. Установлено также, что испытуемое фитосредство в дозах 50 и 100 мг/кг уменьшает осмотический гемолиз эритроцитов.
Таблица 1
Влияние «Гепатона» на скорость секреции и биохимический состав желчи у интактных белых крыс
Условия опыта Скорость секреции желчи в течение 5 ч, мг/мин на 100 г Общее кол-во желчи за 2-5 ч, мг/100 г Желчные кислоты Билирубин Холестерин
1-й час 2-й час 3-й час 4-й час 5-й час за 2-5 ч мг %
Контроль (Н20) 5,7 ± 0,1 5.2 ± 0,1 5,0 ± 0,1 4,9 ± 0.3 4,5 ± 0,2 1176 ± 29 2221 23 42,65
50 мг/кг 5,8 ± 0,4 7,4 ± 0,1* 6,6 ± 0,4* 5,8 ± 0,1* 5,2 ± 0,1* 1500± 30* 3165 47 72,3
примечание: * - здесь и далее, различия достоверны по сравнению с контролем при Р < 0,05.
Таблица 2
Мембраностабилизирующее действие «Гепатона» на перекисный и осмотический гемолиз эритроцитов
Условия опыта Доза, мг/мл Перекисный гемолиз, % Осмотический гемолиз, %
Контроль (гемолиз) - 0,84 ± 0,02 0,82 ± 0,03
25 0,51 ± 0,02* 0,79 ± 0,04
Опыт (гемолиз + «Гепатон») 50 0,38 ± 0,03* 0,59 ± 0,02*
100 0,71 ± 0,03* 0,66 ± 0,04*
Влияние «Гепатона» на активность ферментов антиоксидантной защиты и углеводного обмена
Эксперименты проведены с использованием модельных биохимических тест-систем, в которых в качестве субстратов использовали: глутатион окисленный, глутатион восстановленный, фосфое-нолпируват, гидроксибутил, аденозинди- и трифос-фаты, р-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный и р-никотинамидадениндинуклеотид фосфат (Sigma). Концентрация ферментов в инкубационной среде составляла 0,3 — 0,5 мкг/мл, испытуемое средство в пробу добавляли в концентрациях 1,0; 5,0; 10,0; 50,0 и 100,0 мкг/мл. Полученные данные представлены в таблице 3.
Как следует из данных, приведенных в таблице, введение в инкубационную среду «Гепатона» в указанных концентрациях сопровождается повышением активности ферментов антиоксидантной защиты: глутатионредуктазы и глутатионперок-сидазы. При этом отмечается дозозависимый эффект: с увеличением концентрации испытуемого средства его эффективность повышается до определенных значений, при дальнейшем повышении концентрации — снижается. Более выраженное активирующее влияние «Гепатон» в концентрациях 50 мкг/мл оказывает в отношении глутатиопероксидазы, увеличивая ее активность на 31 % по сравнению с контролем. В то же время испытуемый фитоэкстракт в концентрациях 10 и 50 мкг/мл оказывает значительное активирующее влияние на активность пируваткиназы, ускоряя ферментативную реакцию в среднем на 30 % по сравнению с контролем. При этом также отмечается дозозависимый эффект: дальнейшее увеличение концентрации средства в модельной
системе приводит к угнетению активности этого фермента.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что «Гепатон» в концентрациях, соответствующих экспериментально-терапевтическим дозам, оказывает выраженное стимулирующее влияние на активность ферментов антиокси-дантной защиты организма, а также активность ключевого фермента энергетического обмена
— пируваткиназы, повышая антиоксидантный и энергетический потенциал клеток.
Влияние «Гепатона» на кинетику
Fe 2+-индуцированной хемилюминесценции
Исследование влияния «Гепатона» на кинетику железоиндуцированной хемилюминесценции (ХЛ) проведено с использованием 1 % суспензии липосом яичного желтка [1] по общепринятому методу [4]. Водный раствор «гепатона» в инкубационную среду добавляли в концентрациях: 0,05;
0,10 и 0,20 мг/мл. Определяли интенсивность быстрой вспышки (1бв) и скорость ХЛ на начальной экспоненциальной стадии медленной вспышки (ст), а также производили расчет антиоксидантной активности (АОА) «Гепатона». Полученные данные приведены в таблице 4.
Из приведенных данных следует, что «Гепа-тон» в исследованных концентрациях оказывает существенное ингибирующее влияние на кинетику Бе2+- индуцированной хемилюминесценции липосом, о чем свидетельствует уменьшение амплитуды «быстрой вспышки» и снижение скорости ХЛ. При этом выявлен дозозависимый эффект. Так, при внесении в инкубационную среду испытуемого средства в концентрации 0,05 мг/мл отмечалось
Таблица 3
Влияние «Гепатона» на скорость ферментативных реакций
Условия опыта Концентрация, мкг/мл Активность ферментов, мкг/мл/мин
ГР гп ПК
Контроль - 13,4 ± 0,17 3,5 ± 0,03 3,8 ± 0,30
Гепатон 5,0 13,4 ± 1,05 3,5 ± 0,32 4,5 ± 0,35*
- « - 10,0 13,5 ± 0,38 3,6 ± 0,12 5,0 ± 0,38*
- « - 50,0 15,1 ± 0,09* 4,1 ± 0,29* 5,1 ± 0,30*
- « - 100,0 14,7 ± 0,39* 4,6 ± 0,39* 2,7 ± 0,24*
- «- 1000,0 14,5 ± 0,40* 2,0 ± 0,15* 1,5 ± 0,09*
Таблица 4
Влияние «гепатона» на параметры Fe^-индуцированной хемилюминесценции суспензии липосом
Условия опыта Концентрация, мг/мл Показатели
I ¡¡.в,, уел. ед. а, уел. ед.
Контроль - 7,1 ± 0,49 0,94 ± 0,072
Опыт («Гепатон») 0,05 4,2 ± 0,32* 0,71 ± 0,025*
0,10 3,8 ± 0,18* 0,63 ± 0,036*
0,20 3,3 ± 0,15* 0,52 ± 0,037*
Таблица 5
Влияние «Гепатона» на активность каспазы-3 в клетках печени белых крыс при остром токсическом
тетрахлорметановом гепатите у крыс
Группы животных Активность каспазы-3, пмоль/ мин/мг белка
1 час 4 часа 12 часов 24 часа
Интактная 16,68 ± 3,56
Контрольная (CCL4) 15,23 ± 1,27 28,69 ± 4,15 38,42 ± 1,39 38,98 ± 3,03
Контрольная + Ac-DEVD-CHO 8,94 ± 1,53* 22,19 ± 5,41 21,60 ± 3,91* 23,65 ± 1,46*
Опытная + «Гепатон» 7,24 ± 1,59* 29,51 ± 3,76 39,87 ± 3,53 33,75 ± 2,40
уменьшение показателя в 1,7 раза, а также снижение скорости ХЛ на 25,5 % по сравнению с аналогичными показателями контрольных проб. При увеличении концентрации фитоэкстракта выраженность ингибирования ХЛ повышалась: при внесении «Гепатона» в концентрациях 0,1 и 0,2 мг/мл амплитуда «быстрой вспышки» уменьшалась в 1,9 и 2,2 раза по сравнению с контролем. Скорость ХЛ при внесении гепатона в дозе 0,1 мг/мл снижалась в полтора раза, а при использовании концентрации, равной 0,2 мг/мл, в 1,8 раза. Расчет антиоксидантной активности (АОА) «Гепатона» показал, что его АОА составляет 18,7 (г/л)-1, что свидетельствует о достаточно выраженной АОА.
Влияние «Гепатона» на активность каспазы-3 в печени при интоксикации тетрахлорметаном
Опыты проведены на крысах обоего пола линии Wistar массой 180-200 г. Интоксикацию вызывали путем однократного внутрижелудочного введения четыреххлористого углерода в дозе 1,25 мл/кг. Животные опытной группы дважды получали водный раствор «Гепатона» внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг профилактически за 12 и 1 час до введения четыреххлористого углерода. Крысы контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Активность каспазы-3 определяли в гомогенате печени колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Caspase 3 Assay kit» (Sigma). Полученные данные приведены в таблице 5.
Из таблицы следует, что через 1 час после введения раствора тетрахлорметана активность фермента статистически не отличается от данных у животных интактной группы (15,23 ± 1,27 и 16,68 ± 3,56 соответственно), максимальная активность каспазы-3 в клетках печени наблюдали через 12 и 24 часа после введения четыреххлористого углерода животным, что обьясняется динамикой накопления CCl4 в печени. Несмотря на мембрано-стабализирующую и антиоксидантную активность «Гепатона», его введение не оказывало ингибирующего действия на активность каспазы-3, исключая временной отрезок в 1 час. Можно предположить, что наличие одних только антиоксидантных свойств недостаточно для снижения уровня индуцированного апоптоза. Необходимо также, чтобы испытуемые средства обладали способностью восстанавливать нарушенный энергетический
баланс клетки, так как скорость и глубина апопто-тического процесса зависит от степени истощения запасов АТФ [12]. Следует заметить, что при тетрахлорметановом повреждении печени главным образом идет некроз гепатоцитов и их частичный апоптоз с последующим вторичным некрозом, при котором также отмечается резкое повышение активности каспазы-3 [10]. Видимо поэтому мы не обнаружили ингибирующего действия «Гепатона» на активность этого фермента.
Таким образом, в результате исследования установлено, что «Гепатон» обладает выраженной мембраностабилизирующей, антиоксидантной и желчегонной активностью в то же время не оказывает ингибирующего влияния на активность каспазы-3.
литература
1. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы, антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестник РАМН. - 1998. - № 7. - С. 43-45.
2. Влияние эномеланина на гемолиз эритроцитов, вызываемый свободнорадикальными реакциями и другими факторами / И.Е. Ковалев [и др.] // Фармакология и токсикология. - 1986. -№ 4. - С. 89-91.
3. Дроговоз С.М. Нарушение интенсивности желчеотделения и химического состава желчи при дистрофии печени, вызванной четыреххлористым углеродом / С.М. Дроговоз // Вопросы мед. химии. - 1971. - Вып. 4. - С. 397-400.
4. Карбач Я.И. Количественное определение желчных кислот в желчи и крови с применением хроматографического метода / Я.И. Карбач // Биохимия. - 1961. - № 2. - С. 305-307.
5. Клебанов Г.И. Ингибирование антиокисли-тельной активности плазмы крови азидом натрия / Г.И. Клебанов, Ю.О. Теселкин, Ю.А. Владимиров // Биофизика. - 1988. - Т. 33, № 3. - С. 512-516.
6. Подымова С.Д. Болезни печени / С.Д. Под-ымова. - М., 1993. - 544 с.
7. Полонский В.М. Применение препарата ЛИВ.52 при токсических, алкогольных и лекарственных поражениях печени / В.М. Полонский // Фар-матека. - 2005. - № 7. - С. 23-29.
8. Применение специфических ферментных биотест-систем in vitro для выявления целевой биологической активности фармакологически
активных веществ / М.С. Бродова [и др.] // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника: Научно-прикладной журнал. — 2004. — № 1/2. — С. 24-30.
9. Скакун Н.П. Эффективность легалона и эс-сенциале при поражении печени тетрациклином / Н.П. Скакун, Н.Ю. Степанов // Антибиотики.
- 1986. - № 11. - С. 787-790.
10. Evaluation of oxidative stress during apoptosis and necrosis caused by D-galactosamine in rat liver. / F. Sun [et al.] // Biochimca et Biophysica Acta. -2001. - Vol. 1535. - P. 186-191.
11. Expression of hepatitis C virus NSB 5 protein; characterization of its RNA polymerase activity and RNA binding / K. Ishii [et al.] // Hepatology. -1999. - Vol. 29. - P. 1227-1235.
12. Lieberthal W. Graded ATP depletion can cause necrosis or apoptosis of cultured mouse proximal tubular cells / W. Lieberthal, S.A. Menza, J. Levine // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 274. - P. F315-F327.
13. Pradhan S.C. Hepatoprotective herbal drug, silimarin from experimental pharmacology to clinical medicine / S.C. Pradhan, C. Girish // Ind. J. Med. Res. - 2006. - Vol. 124. - P. 491 -504.
14. Progressive liver inguire in chronic hepatitis C infection correlates with increased expression of Th 1-associatedcytocines / J. Napoli [et al.] // Hepatology. - 1996. - Vol. 24. - P. 759-760.
15. Swerdlow J.L. Nature's Rx. / J.L Swerdlow // National Geographic. - 2000. - Vol. 197. -P. 98-117.
Сведения об авторах:
Ажунова Татьяна Александровна - д.б.н., в.н.с. ИОЭБ СО РАН. Тел. 8 (3012) 43-34-63 Лемза Сергей Васильевич - к.б.н., с.н.с., ИОЭБ СО РАН Мондодоев Александр Гаврилович - к.м.н., с.н.с. ИОЭБ СО РАН
Алексеева Эльвира Алексеевна - к.м.н., доцент, зав. кафедрой нормальной анатомии и физиологии БГУ
