CC BY
21
1 2 © Анисимова Т.А. , Ефимова Э.В.
1Доцент кафедры детских болезней медицинского факультета;
К.м.н., доцент кафедры детских болезней медицинского факультета.
Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова, г. Чебоксары
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С
ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
Клиническая диагностика ГЛПС в ранние сроки затруднена в связи с тем, что на начальных стадиях симптомы болезни могут напоминать многие острые лихорадочные состояния, прежде всего ОРЗ, пиелонефрит, острую пневмонию. Наряду с этим существуют атипичные, легкие, стертые формы геморрагической лихорадки, плохо диагностируемые даже в разгар болезни. По данным Т.К. Дзагуровой и соавт. (1983) в некоторых стационарах около половины больных ГЛПС выписывалось с другим диагнозом. В связи с этим приобретает особое значение ранняя специфическая лабораторная диагностика геморрагической лихорадки.
Лабораторная диагностика хантавирусной инфекции начала развиваться с 80-х годов XX века. Диагноз ГЛПС ставится на основании характерных клинических симптомов, изменений гемограммы и общего анализа мочи, а также эпидемиологических и лабораторных данных.
После перенесенного заболевания остается стойкий длительный иммунитет. Специфическая диагностика ГЛПС основывается в основном на обнаружении специфических иммуноглобулинов [6, с.66; 9, с. 14; 11, с.73]. 1§0 антитела к вирусам Хантаан и Пуумала в сыворотках крови реконвалесцентов после перенесенного заболевания, по-видимому, остаются пожизненно [8, с.100].
В настоящее время наибольшее распространение получил метод диагностики ГЛПС на основе использования флуоресцирующих антител. В 1978 году корейским ученым впервые удалось с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) обнаружить антиген вируса геморрагической лихорадки в легочной ткани диких грызунов, а также специфические антитела к этому вирусу в сыворотках крови людей, переболевших данной инфекцией [13, с. 865]. В прямом МФА флуоресцентным красителем (обычно флуоресцеин изотиоцианатом) метятся антитела, узнающие вирусный антиген. В непрямом МФА, который используется для детекции антивирусных антител в физиологических жидкостях больных ГЛПС [2, с.19], антивирусные антитела находятся в исследуемом образце и немечены, после связывания с антигеном добавляются антитела против иммуноглобулинов человека, несущие флуоресцентную метку. По окончании реакции образцы микроскопируются в ультрафиолетовом свете с соответствующей длиной волны. В случае присутствия антител к вирусу в клетках с помощью флуоресцентного микроскопа наблюдают специфическое свечение. В качестве антигена обычно используют криостатные срезы легких инфицированных грызунов [1, с.184; 4, с.678; 10, с.619] или культуру клеток, зараженных вирусом. Внедрение МФА в широкую практику с начала 80-х годов позволило выявлять атипичные, стертые формы ГЛПС, а также подтверждать диагноз в сомнительных случаях. Этот метод позволяет обнаружить к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания [4, с. 676]. Выявляемые МФА антитела представляют собой суммарно иммуноглобулины классов 1§;М и 1§0, но в силу особенностей иммунохимических взаимодействий, антитела класса М этим методом отдельно плохо выявляются, поэтому МФА не используется как метод массового скрининга специфических 1§М [5, с. 43]. Поскольку в эндемичных районах у 10-30% здорового населения определяются специфические антитела класса 1§0, для подтверждения серологического диагноза требуется исследование МФА парных
© Анисимова Т. А., Ефимова Э.В., 2016 г.
сывороток крови для выявления 4-х кратного и более нарастания титра антител [7, с.26]. В тоже время большинство серопозитивных обследованных не отмечают в анамнезе заболеваний, схожих с ГЛПС, что говорит о большом распространении стертых и легких форм болезни, обуславливающие естественную иммунизацию населения [4, с. 679]. Использование парных сывороток затрудняет постановку диагноза, кроме того, некоторыми авторами показано, что нарастание титра антител во второй сыворотке при ГЛПС удается зарегистрировать далеко не во всех случаях. Так, диагностическое нарастание титров антител было установлено только у 27-45,8% больных, обследованных в оптимальные сроки [1, с.185].
Метод иммуно-пероксидазного окрашивания отличается от МФА только тем, что вместо флуоресцентной метки используется пероксидаза хрена. После инкубирования антител с пероксидазой с исследуемым образцом добавляется субстрат для пероксидазы, который изменяет цвет при воздействии на него фермента. Достоинство метода состоит в том, что просматривать образцы можно в обычный микроскоп [12, с.279]. Недостаток данного метода в том, что он еще более громоздкий, чем МФА, а также в том, что эндогенные пероксидазы могут вызывать довольно сильное фоновое окрашивание.
Были также предложены методы диагностики на основе реакции торможения гемагглютинации (РТГА) специфическими к вирусу антителами, поскольку многие штаммы хантавирусов обладают способностью агглютинировать эритроциты [16, с.896]. С помощью модифицированной РТГА антитела удавалось определять на 2-8 день от начала заболевания в титрах 1:20-1:160. Однако и в этом случае перед исследователями стояла все та же проблема - необходимость определения антител в парных сыворотках.
Другой подход для ранней диагностики ГЛПС основан на определении IgM к вирусу. Новый метод диагностики был предложен Engvall и Perlmann и Van Weemen и Spurn's - твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на принципе меченых антител или антигенов с использованием в качестве метки определенного фермента (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA, ИФА). Иммуноферментный анализ высокочувствителен, специфичен, прост и быстр в постановке. Используется, главным образом, метод непрямого ИФА. В качестве антигена применяется очищенный вирус, рекомбинантные белки или синтетические полипептиды, представляющие собой отдельные детерминанты структурных вирусных белков - нуклеокапсидный белок (который экспрессировался в бактериях Е. coli), G1 и G2. Показано, что нуклеокапсидный белок (НКБ) является основным антигеном, на который отмечается наиболее интенсивный гуморальный иммунный ответ. Причем он регистрируется уже в начале развития ГЛПС [15, с.779].
Научные разработки привели к созданию коммерческой тест-системы на основе ИФА (Progen), а в нашей стране разработка хантавирусных диагностикумов производится ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов института полиомиелита и вирусных энцефалито в им. М. П. Чумакова РАМН». Это "Культуральный поливалентный диагностикум ГЛПС для выявления антител непрямым МФА" - для серодиагностики ГЛПС у больных и "Иммуноферментная тест-система (Хантагност) - для выявления хантавирусного антигена - для оценки напряжённости эпизоотического процесса у грызунов - основного фактора, используемого для прогнозирования эпидемической ситуации. На базе ФГУП НПО «Микроген», филиал «Иммунопрепарат» разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител класса М к вирусу ГЛПС, которая прошла государственные испытания, но еще не внедрена в широкую практику [3, с.88].
Для диагностики ГЛПС также используются различные варианты иммуноблотинга с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НИМ) [6, с. 67]. Фирма Micogen (Германия) предлагает нитроцеллюлозные полоски с сорбированным на поверхности рекомбинантным НКБ вирусов Пуумала и Хантаан.
Как развитие подходов, использующих нитроцеллюлозные мембраны, можно рассматривать иммунохроматографические методы. Они позволяют определять специфические антитела всего за несколько минут. В их основе лежит так называемая латеральная иммунодиффузия. Иммунохроматографический анализ (ИХА) - это метод определения наличия определенных концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т. д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования [3, с.89]. Выявление 1§М к рекомбинантному нуклеокапсидному белку осуществляется всего за 5 минут. При этом чувствительность и специфичность достигают 97-100 % [14, с. 416]. Так как в реакцию вступают только антитела 1§М класса, тест определяет только острую инфекцию. 1§0 не влияет на результат теста. Обычно положительный результат теста может быть получен в первый же день проявления симптомов ГЛПС. В качестве исследуемого материала могут быть использованы сыворотка, плазма или кровь из пальца [3, с. 87].
Диагностика ГЛПС с использованием обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) является высокочувствительным методом ранней диагностики, Метод ОТ-ПЦР уже более 10 лет используется для детекции и генетической характеристики хантавирусов. Анализ данных ОТ-ПЦР при обнаружении вирусной РНК в крови и сыворотках больных в зависимости от сроков начала болезни свидетельствует о наличии вирусемии в крови больных довольно длительное время - до 15 дня от появления первых признаков заболевания [7, с.28]. К сожалению, этот метод не применяется в широкой практике в связи с отсутствием коммерческих амплификационных диагностических систем, а тест-системы, разработанные в нашей стране ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» совместно с ЗАО «Вектор-Бест» и ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва, не освоены в промышленном масштабе.
Метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала. Альтернативой традиционным методам может стать разработанная модификация метода ОТ-ПЦР в реальном времени. Основные преимущества этого метода в том, что он является одостадийным, проводится при обычных условиях с доступными реагентами, и использует технологию, подходящую для многих лабораторий. В результате исследований [14, с.416] появился метод прямой детекции продуктов амплификации в присутствии бромистого этидия - ПЦР в режиме реального времени, названной тогда кинетической и повлекшей за собой создание нового типа ДНК амплификаторов, оснащенных оптическим модулем и способными детектировать изменение флуоресценции реакционной смеси.
Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить высокочувствительную детекцию хантавирусной РНК за максимально короткое время на ранних стадиях ГЛПС.
Литература
1. Астахова Т.И., Слонова Р.А., Павленко О.В. и др. Результаты изучения гуморального иммунитета при геморрагической лихорадке с почечным синдромом в Приморском крае. // Вопр. вирусологии. - 1986.- №2. - С.183-186.
2. Верета Л.А., Елисова Т.Д., Воронкова Г.М. Обнаружение антител к вирусу Хантаан в моче больных ГЛПС // Вопр. вирусологии. - 1993. - № 1. - С. 18 -21.
3. Воробьев В.С., Ладыженская И.П. и др. Результаты государственных испытаний препарата: "ИФА-ГЛПС-ПУУМАЛА-ЮМ", тест - система иммуноферментная для выявления антител класса М к хантавирусу, серотипа Пууумала-возбудителю ГЛПС. // Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: историяизучения ми современное состояние эпидемиологи , патогенезе, диагностики и лечения и профилактики. / Материалы Всероссийской научно-практической конференции . - Уфа РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ. - 2008. - С.88.
4. Дзагурова Т.К. Серологическое обследование больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в Европейской части СССР // Вопросы вирусологии.1983. -№6. - С. 676 - 680.
5. Иванис В.А., Маркелова Е.В., Перевертень Л.Ю. Иммунологические аспекты нарушения гомеостаза у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом // Гомеостаз и инфекционный процесс. - 2003. - №8 - С. 41-45.
6. Иванов Л.И., Здановская Н.И., Волков В.И., Деконенко А.Е. Особенности циркуляции хантавирусов и эпидемиологии ГЛПС в Российском Приморье //Актуальные проблемы мед. вирусологии: Материалы научн. конф., посвящ. 90-летию со дня рожд. М.П. Чумакова - М., 1999. - С. 66.
7. Морозов, В.Г. Клинико-эпидемиологическая характеристика, специфическая диагностика и лечение различных вариантов геморрагической лихорадки с почечным синдромом: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / В.Г. Морозов. - СПб.: ВМедА, 2002. - 42 с.
8. Слонова Р. А., Астахова Т.И., Компанец Г.Г. Результаты изучения геморрагической лихорадки с почечным синдромом на юге Дальнего Востока России. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997.- № 5. - С. 97-101.
9. Сокотун С.А. Иммунологическая и серотипическая характеристика природных очагов хантавирусной инфекции в Приморском крае: автореф. дис. . канд. мед. наук / С.А. Сокотун. Владивосток, 2002. - 20 с.
10. Ткаченко Е.А., Донец М.А., Дзагурова Т.К. и др. Усовершенствование лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. // Вопр. вирусологии. -1981. - №5. - С. 618-620.
11. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Петров В.А. Эффективность применения культуральных антигенов для серодиагностики ГЛПС с помощью метода иммунофлюоресценции. // Вопросы вирусологии. 1988. - №1. - С. 71-75.
12. Fields B.N: / Fields B. N., Kaufinann R. S. Pathogenesis of viral infection // Fundamental virology. NY. - 1986 - V. 1 - p. 277 - 289.
13. Lee H. W. Hemorrhagic fever with renal syndrome in Korea // Rev. infect, dis - 1989. - Vol. 11, N. 4.- P. 864 - 876.
14. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. -1992.-V.10.-P. 413-417.
15. Schmaljohn C, Sugiyama K,. et al Baculovirus expression of the small genome segment of Hantaan virus and potential use of the expressed nucleocapsid protein as a diagnostic antigen // J. Gen. Virol. - 1988. - Vol. 69. - P. 777-786.
16. Tsai T., Tang Y., Hu S., et al. Hemagglutination inhibition antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome // J. Infect. Dis. - 1984. - Vol. 150. - P. 895-898.
