CC BY
91
Т.К. ДЗАГУРОВА, ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
А.П. ИВАНОВ, ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
Н.А. КОРОТИНА, ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
А.Е. МАЛКИН, А.А. СИНЮГИНА, ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института
полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
С.Е. СОЦКОВА, ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
А.А. ИШМУХАМЕТОВ, ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита
и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
Е.А. ТКАЧЕНКО, ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
Разработка лабораторных методов
И ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8—10 тыс. больных в целом по стране.
Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми, ранее не известными в России хантавирусами, свидетельствует о возрастающей медицинской и социальной значимости проблемы ГЛПС.
Открытию возбудителя ГЛПС предшествовал более чем 40-летний период поисков, успешно завершившийся в конце 70-х гг., когда впервые вирус-возбудитель ГЛПС был выделен в Южной Корее от полевой мыши Apodemus agrarius coreae [1].
Несколько лет после открытия возбудителя ГЛПС единственным лабораторным методом для выявления антигена вируса-возбудителя ГЛПС и антител к нему оставался непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) с использованием препаратов криостатных срезов легочной ткани полевых мышей. Ограниченные возможности этого метода, а также трудности, связанные с использованием криостатных срезов легочной ткани диких грызунов (отлов диких животных, транспортировка и хранение легочных тканей, нестан-
Ключевые слова:
геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, хантавирусы, методы лабораторной диагностики, диагностикум ГЛПС, культуральные антигены
дартность антигенной активности препаратов, спонтанная инфицирован-ность грызунов реовирусами, низкая производительность и др.), существенно тормозили изучение ГЛПС, а также применение специфической диагностики этой инфекции в широкой прак-
тике. Это в основном и явилось основанием для разработки и усовершенствования методов лабораторной диагностики ГЛПС, чему посвящена настоящая работа.
В процессе исследований было разработано и усовершенствовано применительно к хантавирусам 23 метода, включая иммунологические, вирусологические и молекулярно-генетические. Иммунологические методы: + непрямой МФА с использованием антигенсодержащих клеток VERO-Е6, инфицированных хантавирусами; < реакция непрямой гемагглютина-ции (РНГА) [2];
{ реакция торможения непрямой ге-магглютинации (РТНГА) с использованием эритроцитарного диагностикума ГЛПС [2];
i два варианта радиоиммунологического анализа (РИА): родоспецифичес-
Keywords: HFRS, hantavirus, diagnostic test-system.
T
he industrial technology of two test-systems for the diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) have been developed. The introduction of them in the practice of healthcare, greatly improving the efficiency of HFRS patients detection, as well as allowed to predict the epidemiological situation and promptly to conduct anti-epidemic measures in the natural foci of HFRS. T.K. DZAGUROVA1, A.P. IVANOV2, N.A. KOROTINA1, A.E. MALKIN2, A.A. SINYUGINA2, S.E. SOT-SKOVA1, A.A. ISHMUKHAMETOV2, E.A. TKACHENKO1. DEVELOPMENT OF DRUG LABORATORY METHODS AND MANUFACTURE TECHNOLOGY FOR SPECIFIC DIAGNOSIS OF HEMORRHAGIC FEVER WITH RENAL SYNDROME.
1 M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, Moscow.
2 Bacterial and Viral Agents Enterprise of the M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis, Moscow.
кая РИА-тест-система (прямой вариант) для определения антигенов ханта-вирусов и блок прямого РИА для определения антител к хантавирусам; + 10 вариантов иммуноферментного анализа (ИФА): родоспецифическая ИФА-тест-система (прямой вариант) для определения антигенов хантавиру-сов; блок прямого ИФА для определения антител к хантавирусам; родоспе-цифическая ИФА-тест-система для определения антигенов и антител ханта-вирусов в варианте дот-блот-анализа; типоспецифическая ИФА-тест-система на основе моноклональных антител для определения вирусспецифического антигена хантавируса Puumala; типос-пецифическая ИФА-тест-система для определения IgM и IgG антител к хан-тавирусу Hantaan; типоспецифическая ИФА-тест-система для определения IgM и IgG к хантавирусу Puumala; ИФА-тест-система для типирования хантавирус-ных антигенов с использованием био-тинилированных моноклональных антител; определение IgM и IgG антител с использованием рекомбинантных антигенов, полученных из Германии [3—8]; ИФА-тест-система «Ханта-ПУУ» для определения поверхностного белка хантавируса Puumala и универсальная ИФА-тест-система «Ханта-N» для определения нуклеокапсидного белка хан-тавирусов Puumala, Dobrava/Belgrad, Hantaan и Seoul [9]. Вирусологические методы: + обнаружение и титрование вируса по индикации вирусспецифического антигена в клетках VERO-E6 с использованием непрямого МФА; + обнаружение и титрование вируса с использованием феномена фокусобра-зующих единиц (ФОЕ) [10, 11]; + реакция нейтрализации [10, 11]. Метод титрования вирусных частиц с использованием феномена ФОЕ использован в собственной модификации ранее описанного метода [12]. Была изменена концентрация метилцеллюлозы в покрытии (0,4% для вирусов Puumala и Tula); в качестве специфических антител использована сыворотка реконва-лесцента ГЛПС-Пуумала с титром антител > 32 000; в качестве выявляющих антител — меченный пероксидазой белок А; в индикаторную систему добавляли
краситель — МС12, благодаря чему инфекционные фокусы «бляшки» приобретают более контрастный темный цвет.
Реакция нейтрализации с использованием феномена подавления числа ФОЕ применялась в собственной модификации, предусматривающей добавление комплемента при экспозиции вирус-сывороточной смеси, что стандартизует результаты нейтрализующей активности антител в сыворотках крови с различным сроком хранения. По нашим данным, такая модификация позволяет наиболее достоверно выявлять антигенные взаимоотношения между хантави-русами и, соответственно, обеспечивать надежную информацию к таксономической классификации хантавирусов. Молекулярно-генетические методы: 4 выделение хантавирусной РНК с использованием гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией; + амплификация и секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК-сегментов хантавирусного генома [13—15].
Из вышеперечисленных методов, апробированных нами в разноплановых по своему характеру и назначению исследованиях большого количества биологических материалов разного происхождения, был сформирован в конечном результате и широко используется в настоящее время комплекс методов, наиболее эффективных и значимых для исследований в области хантавирусоло-гии, а также для диагностических целей. Если вирусологические и молекулярно-генетические методы в полном вышеуказанном составе вошли в этот комплекс, то среди иммунологических методов наибольшие преимущества получили четыре метода: непрямой МФА с использованием культурального антигена — для выявления антител к ханта-вирусам у людей и животных; прямой метод ИФА — для выявления хантави-русного антигена в органах мелких млекопитающих и секционных материалах погибших от ГЛПС людей; непрямой метод ИФА с использованием рекомби-нантных антигенов хантавирусов — для выявления ^ и ^ антител к хантави-русам — для серодиагностики ГЛПС у больных людей, а также два метода ИФА
с использованием моноклональных антител «Ханта-ПУУ» и «Ханта-№> для определения нуклеокапсидного и поверхностного белков хантавирусов при изготовлении инактивированных вакцинных препаратов против ГЛПС. При сравнении эффективности применения разработанных нами иммунологических методов принимали во внимание не только их высокую чувствительность и специфичность, но и доступность для широкого применения в условиях практического здравоохранения. Кроме того, учитывали перспективность технологии промышленного изготовления диагностических препаратов. Так, в соответствии с этими критериями оценки эффективности было показано, что по сравнению с ранее применявшимся непрямым МФА (препараты криостатных срезов) возможность широкого практического применения иммуносорбентных методов ИФА и РИА для выявления вирусспецифического антигена у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС имеет очевидные преимущества, обусловленные высокой производительностью при обследовании большого количества образцов суспензий органов, не нуждающихся в дополнительной очистке от грубых примесей, простотой и объективностью учета результатов опыта. Кроме того, в отличие от непрямого МФА иммуносор-бентные методы и РНГА, обладая практически одинаковой чувствительностью и специфичностью, позволяют определять количественное содержание антигена в исследуемых материалах. Вместе с тем следует отметить, что при сравнении возможностей использования ИФА, РИА и РНГА для выявления хантавирусного антигена предпочтение отдано ИФА, поскольку применение РИА требует наличия дорогостоящего оборудования и высокого качества радиоактивных препаратов, а также специальной подготовки персонала, что ограничивает возможности использования этого метода в учреждениях практической сети здравоохранения. Что касается РНГА и РТНГА, то эффективность их широкого практического применения ниже по сравнению с ИФА и РИА, что связано главным образом с необходимостью предварительной обработки исследуемых материалов эритроцита-
ми барана для удаления гетероагглюти-нинов. При оценке эффективности применения двух вариантов непрямого МФА для выявления специфических хантави-русных антител в сыворотках крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных регионов России было показано, что частота выявления серопозитивных лиц и среднегеометрические титры антител, выявляемых непрямым МФА с культу-ральным антигеном хантавируса (92%, титр Е 8,3 log2), была значительно выше по сравнению с тем же методом, но с применением в качестве антигена препаратов криостатных срезов легочной ткани животных (72%, титр Е 4,5 log2) [16].
• БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ ГЛПС
Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культу-ральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции. До разработки технологии изготовления культурального поливалентного диа-гностикума в том виде, в котором этот препарат был передан для промышленного освоения, пройден длительный и важный этап его конструирования. Этот этап был связан с усовершенствованием и оптимизацией процессов изготовления диагностического препарата, обусловленных как использованием в технологии новых данных, касающихся особенностей гуморального иммунитета при ГЛПС, антигенной вариабельности хантавирусов и их репродукции в культуре клеток, так и чисто практическими проблемами, возникавшими при широком применении диагности-кума.
Первоначально культуральный диагно-стикум готовили на основе прототип-ного штамма Hantaan 76-118, полученного из Южной Кореи. Однако применение такого диагностикума в европейских очагах ГЛПС оказалось малоэффективным, особенно в ранние сроки болезни, поскольку циркулирующий в этих очагах вирус-возбудитель ГЛПС имеет, как выяснилось позже, антигенные различия с прототипным штаммом. В связи с этим для приготовления культуральных антигенов стали использовать выделенные нами в евро-
пейском и дальневосточном регионах России штаммы, относящиеся к ханта-вирусам Puumala и Hantaan. Вначале готовили и применяли моновалентные антигены (отдельно для каждого ханта-вируса), а затем комбинированный двухвалентный препарат, с тем чтобы при серологическом исследовании сывороток крови больных ГЛПС не пропустить гетерологичный для данного региона хантавирусный серотип. Диа-гностикум включал антигенные препараты, изготовленные по авторской технологии из 2 штаммов, представлявших штаммы хантавирусов Puumala и Hantaan, положительные и отрицательные контрольные сыворотки и ФИТЦ-конъюгат IgG против иммуноглобулинов человека. Поскольку антитела, вырабатываемые в ответ на заражение человека вирусами-возбудителями ГЛПС, относящимися к хантавирусам Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, при исследовании непрямым МФА перекрестно реагируют с минимальной разницей в титре, включение в состав диагностикума одного из этих вирусов для выявления антител ко всем остальным представлялось оправданным. Однако впоследствии было показано, что в остром периоде болезни титры антител в сыворотках крови больных ГЛПС, ассоциированной с хантавирусами Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, в 2—4 раза выше c гомологичным антигеном (в поздних сыворотках эта разница нивелируется). В этой связи для повышения чувствительности препарата при определении антител в ранние сроки болезни диа-гностикум ГЛПС был усовершенствован: в состав комбинированного двухвалентного антигена были дополнительно включены культуральные антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Seoul и Dobrava/Bel-grad (рис. 1).
При разработке экспериментальных серий препарата были проведены научные исследования по изучению оптимальных условий размножения ханта-вирусных штаммов в культуре клаток VERO-E6 и накопления вирусспецифи-ческого антигена; оптимальных условий приготовления антигенных препаратов; параметров полной инактивации инфекционной активности ханта-вирусов; оптимальных условий поста-
новки непрямого МФА для выявления вирусспецифических флюоресцирующих антигенов хантавирусов и др. Успешная апробация культурального ди-агностикума ГЛПС в широкой практике (серологически обследовано более 20 тыс. больных с подозрением на ГЛПС на 17 административных территориях России) и определение реальных потребностей в препарате практического здравоохранения явились обоснованием к технологической разработке промышленного производства этого диагностикума. Была разработана и утверждена соответствующая нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению культурального поливалентного диагностикума ГЛПС, проведены комиссионные испытания диагнос-тикума в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также утверждена фармакопейная статья на диагностический препарат. Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09140 от 01 ноября 2010 г. «подтверждает, что изделие медицинского назначения на набор реагентов «Диа-гностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции» по ТУ 9388017-01895045-2010 производства ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН разрешено к производству, продаже и применению на территории РФ». В настоящее время диагностикум ГЛПС выпускается в виде набора реагентов, содержащего культуральный антигенный препарат и контрольные сыворотки. Антигенный препарат является основным действующим компонентом комплекта. Он представляют собой равномерно нанесенные на предметное стекло по 0,005 мл высушенные, инак-тивированные ультрафиолетовым облучением и фиксированные ацетоном суспензии клеток VERO-E6, содержащие специфические антигены, приготовленные на основе штаммов хантави-русов Puumala, Hantaan, Seoul и Dob-rava/Belgrad, и клетки, не содержащие хантавирусных антигенов в соотношении 2:1:1:1:1. Визуально на стекле антиген определяется в виде серых пятен диаметром 2—З мм (по 12 или 21 капле на каждом стекле). Помимо антигенных препаратов, набор содержит контрольные иммунные сыворотки: анти-Hantaan,
ОКТЯБРЬ 2 0 15
рисуно^1 Биологическая схема промышленного производства препарата
«Диагностикум ГЛПС культуральный поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции»
выявляющую антигены хантавирусов Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad; анти-Puumala, выявляющую антигены ханта-вируса Puumala; нормальную сыворотку человека, а также ФИТЦ-конъюгат против глобулинов человека. К настоящему времени ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» произведено и реализовано более 200 коммерческих серий (по 500 комплектов в серии) поливалентного культурального диагности-кума ГЛПС для непрямого МФА Потребителями препарата являются медицинские учреждения практического здравоохранения в более чем 60 субъектах Российской Федерации, на территории которых регистрируется заболеваемость ГЛПС.
Несомненным достоинством диагнос-тикума ГЛПС является то, что в антигенном поливалентном препарате имеется весь набор присущих хантавирусу антигенных детерминант, представленных в цитоплазме клеток в составе зрелых вирионов, а также компонентов сборки вирусных частиц: белка нуклео-капсида, гликозилированного белка наружной оболочки и его предшественников, вирусной РНК. Именно поэтому
непрямой МФА остается стандартом при сравнении специфичности и чувствительности вновь создаваемых диагностических препаратов для серодиагностики ГЛПС.
Следует отметить, что культуральный диагностикум применяется и для исследования сывороток крови животных на присутствие хантавирусных антител. Для этого необходимо использовать ФИТЦ-конъюгат против глобулинов того вида животных, которому принадлежит исследуемая сыворотка.
• ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА «ХАНТАГНОСТ» ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ХАНТАВИРУСОВ
При разработке промышленной технологии изготовления иммунофермент-ной тест-системы «Хантагност» были проведены исследования по изучению формирования гуморального иммунитета у больных ГЛПС с целью выбора оптимальных сроков забора крови у ре-конвалесцентов. Кроме того, были оптимизированы условия конъюгации иммуноглоубина с пероксидазой хрена, условия постановки иммунофермент-ного анализа и режим хранения имму-нохимических компонентов тест-системы. Определены чувствительность и
специфичность тест-системы при выявлении культуральных (клетки VERO-E6) антигенов вирусов-возбудителей хантавирусных инфекций: Puumala, Hantaan, Seoul, Dobrava/Belgrad и Sin Nombre, а также показана высокая эффективность применения тест-системы при проведении широких эпизоотоло-гических исследований (выявление хантавирусного антигена у диких грызунов) на территории России. Лабораторные серии тест-системы «Хантагност» успешно прошли испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и рекомендованы для внедрения в медицинскую практику.
Технологический цикл промышленного изготовления иммуноферментной тест-системы «Хантагност» (предусматривает выделение IgG из сыворотки крови реконвалесцентов после ГЛПС (не ранее 2 месяцев от начала заболевания) с титром антител к хантавирусу Puumala не менее 1 : 64 000 в непрямом МФА (рис. 2), а также приготовление «нормального» IgG (контроль специфичности) из сыворотки крови доноров, не содержащих антитела к ханта-вирусам. Пероксидазный конъюгат готовят путем конъюгирования перокси-дазы хрена с анти-Puumala IgG. Контрольный антиген представляет собой
рисунок! 2 Биологическая схема производства тест-системы «Хантагност»
инактивированный формалином лизат клеток VERO-E6, инфицированных хантавирусом Puumala. Специфические компоненты тест-системы «Хантагност» выпускаются в лиофильно высушенном виде за исключением перокси-дазного конъюгата, который выпускается в жидком виде. Иммунофермент-ная тест-система «Хантагност» предназначена для определения антигенов всех известных хантавирусов-возбудителей ГЛПС в грубых суспензиях органов диких животных и обеспечивает быстрый скрининг сотен образцов. Коммерческая тест-система представляет собой полный диагностический набор для прямого варианта ИФА (12-компонентный), состоящий из специфических компонентов: специфический и «нормальный» ^ для сенсибилизации иммунопанели, пероксидаз-ный конъюгат, контрольный антиген — и неспецифических компонентов: концентраты буферов, ферментный субстрат, иммунопанель. Один комплект рассчитан на обследование 47 образцов. Регистрационное удостоверение №2010/ 09139 от 1.11.2010 «подтверждает, что изделие медицинского назначения на набор реагентов «Хантагност» — тест-системы иммуноферментной для определения антигенов хантавирусов» по ТУ 9388-016-01895045-2010 производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова» разрешено к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации».
К настоящему времени ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П. Чумакова» произведено и реализовано более 70 коммерческих серий (по 250 комплектов в серии) иммунофермент-ной тест-системы «Хантагност». Потребителями препарата являются учреждения Роспотребнадзора в более чем 60 субъектах Российской Федерации, на территории которых регистрируется заболеваемость ГЛПС.
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом занимает ведущее место по заболеваемости среди природно-очаго-вых инфекций в России. Заболевание протекает как острая инфекция с пора-
жением почек, легких, центральной нервной и гормональной систем, наличием в ряде случаев тяжелых осложнений в остром периоде, приводящих к летальным исходам, и характеризуется длительным сроком восстановления до полного выздоровления. В этой связи проблема ГЛПС представляет серьезную медико-социальную проблему. Открытие вируса — одного из возбудителей этого заболевания в 1978 г. (Lee H.W. et al., 1978) стало этапным в изучении этой инфекции, а название вируса — Хантаан стало родовым для многочисленных впоследствии открытых вирусов, как патогенных, так и не патогенных для человека. Начало наших исследований по этой проблеме совпало с началом становления хантавирусологии. В первую очередь остро стоял вопрос методической составляющей исследований, поскольку в арсенале экспериментаторов поначалу имелся только метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием криостатных срезов легких инфицированных грызунов — природных носителей вируса. Отсутствовала специфическая диагностика заболевания, соответственно, вопросы этиологии, ареала и нозоареала инфекции, о
ее носителях в природе требовали своего решения.
В начале наших исследований наиболее важным был вопрос обеспечения исследований ГЛПС высокоэффективными и стандартными диагностическими препаратами. Это препараты для специфической лабораторной диагностики ГЛПС у больных людей, с одной стороны, и, с другой, для выявления возбудителей этой инфекции во внешней среде, поскольку источником заражения людей служат дикие грызуны. В связи с этим были определены основные параметры конструирования им-муноглобулиновых диагностических препаратов, что позволило разработать технологическую схему их промышленного производства. Были разработаны и утверждены нормативно-технические документы по изготовлению, контролю и применению иммуногло-булиновой пероксидазной тест-системы для ИФА и культурального поливалентного диагностикума ГЛПС для непрямого МФА.
На базе ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова» осуществляется серийный промышленный выпуск культурального поливалентного диагностикума ГЛПС и имму-ноферментной тест-системы «Хантаг-
ОКТЯБРЬ 2 0 15
ност». Следует отметить, что коммерческие препараты для специфической диагностики ГЛПС до внедрения в нашей стране нигде в мире не производились. Экспериментальная разработка лабораторных методов применительно к хан-тавирусам и промышленное производство диагностических препаратов ГЛПС в значительной мере способствовало успеху, достигнутому в нашей стране и за рубежом в изучении ГЛПС, а также решению ряда задач практического здравоохранения, связанных с этой инфекцией.
Широкое применение разработанных нами методов специфической диагностики применительно к хантавирусам для обследования людей и мелких млекопитающих позволило значительно расширить наше представление о географическом распространении возбудителей ГЛПС и их носителей в природе. Отмечена тесная корреляция при обнаружении инфицированных ханта-вирусом мелких млекопитающих и се-ропозитивных к этому вирусу лиц среди населения административных территорий, где проводились параллельные исследования мелких млекопитающих и людей. В последние годы, благодаря серологическому обследованию людей с заболеваниями, сходными по некоторым симптомам с ГЛПС, в ряде районов России, в которых ранее не регистрировалась заболеваемость ГЛПС, были выявлены больные этой инфекцией.
• ВЫВОДЫ
1. Впервые, применительно к хантави-русам, разработан комплекс лабораторных методов исследования материалов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих, позволивших существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС и получить новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом.
2. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволили установить истинные размеры заболеваемости, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции.
3. Получены экспериментальные данные, которые составили основу технологии изготовления иммунобиологических препаратов, предназначенных для специфической лабораторной диагностики ГЛПС.
4. В широкую практику здравоохранения внедрены два диагностических препарата: «Диагностикум ГЛПС куль-туральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции» и «Иммуноферментная тест-система «Хантагност» для определения антигенов хантавирусов». Применение первого диагностикума позволило существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС, что спо-
собствует, в свою очередь, своевременной госпитализации, а также выбору правильной тактики ведения и лечения больных. Практическое применение иммуноферментной тест-системы для определения инфицированности хан-тавирусами мелких млекопитающих открыло перспективу для оценки напряженности эпизоотического процесса у грызунов — основного фактора, используемого для прогнозирования эпидемической ситуации и обусловливающего показания к проведению соответствующих противоэпидемических мероприятий в природных очагах инфекции.
ИСТОЧНИКИ
1. Lee H.W, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever. J. Infect. Dis., 1978. 137: 298-308.
2. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.А., Дзагурова Т.К. и др. Реакция непрямой гемагглютинации для индикации вируса ГЛПС и лабораторной диагностики заболеваний. Вопр. вирусол.,
1984. 1: 82-85.
3. Ivanov AP, Tkachenko EA, Petrov VA et al. Enzyme immuno assay for the detection of virus specific Ig G and Ig M antibody in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. Arch Virol., 1988. 100: 1-7.
4. Иванов А.П., Деконенко А.Е., Шуткова Т.М., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Поликлональная им-муноферментная система для определения антигенов хантавирусов: оценка специфичности с помощью моноклональных антител и полимеразной цепной реакции. Вопр. вирусол., 1996. 3: 110-112.
5. Иванов А.П., Дзагурова Т.К., Деконенко А.Е., Барановский П.М., Шервали В.И., Ткаченко Е.А. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональ-ных антител для типирования антигенов хантавирусов. Вопр. вирусол., 1996. 6: 263-265.
6. Tkachenko EA, Ivanov AP, Dzagurova TK, Donets MA, Rezapkin GV. Immunosorbent assay for diagnosis of HFRS. The Lancet, 1982, 8240, 257-258.
7. Ткаченко Е.А., Донец М.А., Дзагурова Т.К. и др. Усовершенствование лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Вопр. вирусол., 1981. 5: 618-621.
8. Tkachenko EA, Donets MA, Dzagurova TK. Serotypes of HFRS virus in East European and Far Eastern USSR. The Lancet, 1982. 10: 863.
9. Alexeyev OA, Elgh F, Ahlm C et al. Hantavirus antigen detection using human serum IgG M as the capturing antibody in an enzyme-linked immunosorbent assay. Am J Trop Med Hyg, 1996. 54, 4: 367-367.
10. Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Башкирцев В.Н. и др. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в европейской части России. Медицинская вирусология,
2008. 25: 142-150.
11. Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Юничева Ю.В. и др. Обнаружение и клинико-этиологическая характеристика ГЛПС в субтропической зоне Краснодарского края. ЖМЭИ, 2008. 1: 12-16.
12. Lee PW, Gibbs CJ, Gajdusek C, Yanagihara R. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests. Journal of Clin. Microbiol.,
1985. 22, 6: 940-944.
13. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.Ю. и др. Генетическая дифференциация ханта-вирусов с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования. Вопр. вирусол., 1996. 1: 24-27.
14. Морозов В.Г., Дзагурова Т.К., Морзунов С.П. и др. Генетическая идентификация хантавиру-сов в крови больных ГЛПС. Эпидемиол. и инфекц. бол. 2004. 2: 43-47.
15. Dzagurova TK, Klempa B, Tkachenko EA et al. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia. J Clin Microbiol,
2009. 47, 12: 4029-4036.
16. Dzagurova TK, Klempa B, Tkachenko EA et al. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia. J Clin Microbiol., 2009. 47, 12: 4029-4036.
