CC BY
82
СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА СЕМАКС ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ
Власова И.М., Салецкий А.М.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический факультет
E-mail: vlasovairina1979@mail.ru
Целью настоящей работы было изучение нейропротекторного воздействия препарата Семакс на уровень окислительного стресса в тканях головного мозга при ишемическом инсульте по оценке свободнорадикального повреждения компонентов крови животных методами флуоресцентного анализа. При ишемическом инсульте происходит повышенное образование активных форм кислорода по двум причинам. Первая из них - нарушение окислительного фосфорилирования в тканях головного мозга. Вторая - включение воспалительной линии защиты организма при некрозе ткани головного мозга. В работе показано, что препарат Семакс уменьшает окислительный стресс в тканях головного мозга при ишемическом инсульте, уменьшая вклад второй причины.
Ишемический инсульт представляет собой острое нарушение мозгового кровоснабжения, возникшее при критическом снижении мозгового кровотока вследствие расстройства общей гемодинамики или при окклюзии сосудов, снабжающих кровью мозг. Патогенез ишемического инсульта многообразен, но основную роль играют гипоксия и ишемия головного мозга (церебральная ишемия). В данной работе ишемический инсульт у крыс вызывался проведением процедуры экспериментальной глобальной (двухчасовой) ишемии головного мозга. В данной работе модельная глобальная ишемия головного мозга вызывалась путем пережатия у животных обеих внутренних сонных артерий (arteria carotis interna), оставшееся кровоснабжение через позвоночные артерии (arteria vertebralis) не обеспечивало адекватное кровоснабжение головного мозга.
В наших предыдущих исследованиях оптико - спектральными методами были зарегистрированы отличия в компонентах крови животных (крыс), перенесших экспериментальную ишемию головного мозга, по сравнению с компонентами крови контрольных группы здоровых животных. Во-первых, методом лазерной корреляционной спектроскопии рассеянного света было показано увеличение размеров и уменьшение плотности липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) сыворотки крови животных после ишемии головного мозга по сравнению с ЛПНП сыворотки крови здоровых животных [1]. Во-вторых, методом комбинационного рассеяния света нами было обнаружено свободнорадикальное окислительное повреждение ненасыщенных жирных кислот амфипатического фосфолипидного внешнего слоя ЛПНП сыворотки крови животных, перенесших экспериментальную ишемию головного мозга [2]. В-третьих, окислительное повреждение ЛПНП сыворотки крови животных, перенесших ишемию головного мозга, нами было зарегистрировано методами люминесцентно - спектрального анализа в связи с тем, что продукты свободнорадикальных реакций, образующиеся при ишемическом повреждении компонентов сыворотки крови, обладают способностью к флуоресценции под действием возбуждающего света [3].
Зарегистрированные изменения ЛПНП, произошедшие вследствие ишемии головного мозга, нами объяснены в рамках свободнорадикальной теории окислительного стресса. При ишемии происходит повышенное образование активных форм кислорода (АФК) по двум причинам. Первая из них - нарушение окислительного фосфорилирования в тканях головного мозга, приводящее к образованию супероксид-радикала O"*2. Вторая - включение воспалительной линии защиты организма при некрозе ткани головного мозга, т.е. активация макрофагов и нейтрофилов, производящих множество свободнорадикальных соединений (O"*2,
H2O2, NO*) за счёт своих ферментативных систем (НАДФН-оксидазы, ксантиноксидазы, NO-синтазы, липоксигеназы). Накопление при ишемии свободнорадикальных продуктов в ткани мозга приводит к их последующему попаданию в кровь и к повреждению компонентов крови. Радикальные окислительные реакции с участием АФК, появляющихся вследствие ишемии головного мозга, вызывают модификацию ЛПНП крови [1-3].
В медицинских аналитических исследованиях растет интерес к изучению протекторных механизмов головного мозга от повреждения при ишемии головного мозга. Среди исследований механизмов защиты головного мозга от повреждения при ишемии большую роль сейчас играют работы, связанные с изучением медикаментозных препаратов, обладающих нейропротекторным действием. Одним из таких препаратов является синтетический полипептид Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), пептидная последовательность которого запатентована Институтом молекулярной генетики РАН. Семакс - это синтетический полипептид, лишенный гормональной активности. Семакс относится к группе нейропептидов, обладающих адаптивным и ноотропным эффетом. При мозговом инсульте Семакс благодаря своим нейропротекторным свойствам значительно ограничивает повреждение головного мозга, если его применяют сразу после инсульта.
Целью настоящей работы было изучить нейропротекторное воздействие препарата Семакс на уровень окислительного стресса в тканях головного мозга при ишемическом инсульте (ишемии головного мозга) по оценке свободнорадикального повреждения ЛПНП сыворотки крови животных методами люминесцентно -спектрального анализа.
Работа проводилась на сыворотке крови крыс (n = 28) популяции Вистар (молодые самки массой 200 ± 30 г.). Животные делились на две равные группы: в первой группе (n = 14) внутрибрюшинно вводился препарат Семакс (100 мкл на 100 г. веса), во второй (контрольной) группе (n = 14) внутрибрюшинно вводился физиологический раствор в том же объеме. В обеих группах проводилась ишемия головного мозга. Глобальная ишемия головного мозга достигалась путём прекращения тока крови через обе внутренние сонные артерии на 2 часа.
Первое введение Семакса в первой группе и физиологического раствора во второй группе проводилось спустя 15 мин после начала процедуры ишемии головного мозга. Второе введение Семакса в первой группе и физиологического раствора во второй группе было выполнено уже после реперфузии внутренних сонных артерий (т.е. после окончания процедуры ишемии головного мозга), спустя 15 мин после реперфузии (т.е. спустя 2 часа 15 мин от начала ишемической процедуры).
Забор крови у животных проводился из ярёмной вены. В обеих группах животных с целью оценки фармакинетического действия препарата Семакс было проведено несколько заборов крови: 1 забор - до операции ишемии головного мозга, 2 забор - спустя 1 сутки после операции, 3 забор - спустя 2 суток после операции, 4 забор - спустя 3 суток после операции, 5 забор - спустя 5 суток после операции, 6 забор - спустя 7 суток после операции, 7 забор - спустя 10 суток после операции. Из полученных образцов крови стандартно получали сыворотку крови [1]. Мы благодарны группе профессора В.Б. Кошелева (МГУ) за проведение описанной процедуры.
Флуоресцентно - спектральные исследования проводились с помощью спектрофлуориметра LS 55 (Perkin Elmer). Для исследования действия Семакса на уровень окислительного стресса в тканях головного мозга при ишемии по оценке окислительного повреждения ЛПНП сыворотки крови образцы сыворотки крови обеих групп животных без разведения помещались при измерении в кювету при комнатной температуре. При возбуждении сыворотки крови светом с длиной волны
Явозб = 350 нм спектры флуоресценции измерялись в диапазоне от 400 нм до 650 нм. Полученные спектры флуоресценции обрабатывались программой FL Winlab (Perkin Elmer). Измерены спектры флуоресценции образцов сыворотки крови обеих групп животных, полученных в различные дни для изучения кинетики Семакса, а также произведено усреднение спектров в каждой из этих двух групп животных (получавших Семакс, либо получавших физиологический раствор).
Показано, что после процедуры экспериментальной ишемии головного мозга наблюдается увеличение интенсивности в максимуме спектров флуоресценции (470 нм) сыворотки крови в обеих группах животных по сравнению с интенсивностью в максимуме спектров флуоресценции (470 нм) сыворотки крови животных до ишемии головного мозга. Данный наблюдаемый эффект объясняется в рамках указанной ранее нами свободнорадикальной теории окислительного стресса.
Между двумя группами животных (получавших либо Семакс, либо физиологический раствор) наблюдаются отличия в интенсивности в максимуме спектров флуоресценции сыворотки крови животных, перенесших ишемию головного мозга, при рассмотрении кинетики по дням после ишемии головного мозга.
Рис 1 Интенсивность в максимуме спектра флуоресценции сыворотки крови (возбуждение 350 нм)
j макс V п
1фл , отн ед
ишемии головного мозга На рис. 1 представлена диаграмма, отражающая зависимость интенсивности в максимуме спектра флуоресценции (Явазб = 350 нм, Яфлмакс = 470 нм) сыворотки крови животных двух групп (получавших либо Семакс, либо физиологический раствор) от номера дня после проведения процедуры экспериментальной ишемии головного мозга (0-столбцы - на рис. 1 представляют интенсивность в максимуме спектра флуоресценции сыворотки крови животных до проведения ишемии головного мозга). В первые три дня после процедуры экспериментальной ишемии головного мозга отличия между двумя группами животных (получавших либо Семакс, либо физиологический раствор) в интенсивностях в максимумах спектров флуоресценции незначительны, что указывает на примерно одинаковый уровень окислительных свободнорадикальных повреждений компонентов сыворотки крови. Существенные отличия между этими двумя группами животных начинаются после третьего дня после ишемии головного мозга. Хотя в обеих группах наблюдается увеличение интенсивности в максимумах спектров флуоресценции сыворотки крови, но при этом в контрольной группе животных, получавших физиологический раствор, это увеличение намного больше по сравнению с группой животных, получавших Семакс. В качестве отличий между двумя группами животных следует отметить также, что в группе животных, получавших Семакс, наблюдается более монотонное поведение интенсивности в максимуме спектров флуоресценции
сыворотки крови в зависимости от номера дня по сравнению с контрольной группой животных.
Данный эффект скорее всего объясняется влиянием препарата Семакс на воспалительную линию защиты организма, включающуюся при некрозе ткани головного мозга вследствие ишемической процедуры. Как указывалось выше, при ишемии головного мозга происходит повышенное образование АФК по двум причинам. Первая из них - нарушение окислительного фосфорилирования в тканях головного мозга. Вторая - включение воспалительной линии защиты организма при некрозе ткани головного мозга. Вследствие сбоев окислительного фосфорилирования в клетках тканей головного мозга АФК образуются сразу после ишемии головного мозга или в течение первого дня. А включение воспалительной линии защиты организма при некрозе тканей головного мозга при ишемии происходит позднее - спустя 1-2 дня после операции, при этом происходит активация макрофагов и нейтрофилов, производящих множество свободнорадикальных соединений за счёт своих ферментативных систем, которые, попадая в кровоток, повреждают компоненты крови (в частности, ЛПНП). Поэтому у группы животных, получавших физиологический раствор, вследствие воспалительной линии защиты спустя 3 дня после операции происходят окислительные свободнорадикальные повреждения компонентов крови. А у группы животных, получавших Семакс, подобных сильных окислительных повреждений компонентов крови спустя 3 дня после операции не наблюдается.
Следовательно, препарат Семакс уменьшает окислительный стресс в тканях головного мозга при ишемии головного мозга, уменьшая вклад второй причины -уменьшая производство множества свободнорадикальных соединений при включении воспалительной линии защиты организма.
1. Vlasova I.M., Dolmatova E.V., Koshelev V.B., Saletsky A.M. Investigation of ischemia damaging action on blood serum structure by laser spectroscopy methods. // Laser Physics Letters, 2004, v. 1, № 8, p. 417-420.
2. Baranov A.N., Vlasova I.M., Saletsky A.M. Investigation of ischemia damaging action on blood serum by Raman spectroscopy method. // Laser Physics Letters, 2004, v. 1, № 11, p. 555-559.
3. Власова И.М., Салецкий А.М. Спектрально - люминесцентное проявление повреждающего действия ишемии головного мозга на компоненты сыворотки крови. // Журнал Прикладной Спектроскопии, 2005, т. 72, № 6, с. 827-831.
SPECTROSCOPIC FLUORESCENT METHODS OF INVESTIGATIONS OF NEUROPROTECTIVE PROPERTIES OF DRUG SEMAX AT ISCHEMIC INSULT
Vlasova I.M., Saletsky A.M.
M.V. Lomonosov Moscow State University, Physical Department E-mail: vlasovairina1979@mail.ru
The aim of this paper was investigation of neuroprotective action of drug Semax on the level of oxidative stress in brain tissues at ischemic insult by estimation of free radical damaging of blood components by fluorescence analysis. At ischemic insult there is the heightened generation of the reactive oxygen species (ROS) due to two reasons. The first is the violation of cellular respiration (oxidative phosphorylation) in brain tissues. The second is the activation of an inflammatory line of organism protection at necrosis of a brain tissue. In this paper is shown that drug Semax decreases the oxidative stress in brain tissues at ischemic insult by decreasing the influence of second reason.
