CC BY
37
10. Bartov M.S., Karyagina A.S., Gromov A.V., Mishina D.M., Truno-va G.V., Sidorova E.I. et al. New generation osteoplastic materials «Gamalant» containing protein factors of bone tissue growth and regeneration. Kafedra travmatologii i ortopedii. 2012; 2: 21—5. (in Russian)
11. Magamedkhanov Yu.M., Buravtsova E.A., Grishkova N.O., Romashko N.A., Zakharov P.A., Kashchenko P.V. et al. Optimization of before implantation preparation of the alveolar holes remote tooth with the help of Russian material «GamalantTM-paste-FORTE Plus». Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal. 2012; 6: 14—5. (in Russian)
12. Olesova V.N., Kononenko V.I., Bersanov R.U., Kashchenko P.V., Nikonchuk E.E., Chuyanova E.Yu. Before implantation preparation of the alveolar holes remote tooth with the help of domestic material «GamalantTM-paste-FORTE Plus». Farmateka. 2013; 2(13): 28—30. (in Russian)
13. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
14. Vallejo L.F., Brokelmann M., Marten S., Trappe S., Cabrera-Crespo J., Hoffmann A. et al. Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli. J. Biotech. 2002; 94: 185—94. doi:10.1016/S0168-1656(01)00425-4
15. Ihm H.J., Yang S.J., Huh J.W., Choi S.Y., Cho S.W. Soluble expression and purification of synthetic human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli. BMB Rep. 2008; 41(5): 404—7. PMID: 18510873
16. Shineberg B., Zipser D. The lon gene and degradation of beta-galactosidase nonsense fragments. J. Bacteriol. 1973; 116(3): 1469—71. PMCID: PMC246507
17. Fredriksson A., Ballesteros M., Dukan S., Nyström T. Defense against protein carbonylation by DnaK/DnaJ and proteases of the heat shock regulon. J. Bacteriol. 2005; 187(12): 4207—13. doi: 10.1128/JB.187.12.4207-4213.2005
18. Ruppert R., Hoffmann E., Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur. J. Biochem. 1996; 237: 295—302. doi: 10.1111/j.1432-1033.1996.0295n.x
19. Long S., Truong L., Bennett K., Phillips A., Wong-Staal F., Ma H. Expression, purification, and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 2006; 46(2): 374—8. doi:10.1016/j.pep.2005.09.025
Поступила 13.05.16
A.S. Karyagina12-3,1.S. Boksha1, T.M. Grunina1, A.V. Demidenko1, M.S.
Poponova1, O.V. Sergienko1-3, A.M. Lyaschuk1, Z.M. Galushkina1, LA.
Soboleva1, E.O. Osidak4, AS. Semikhin, A.V. Gromov1, V.G. Lunin1,3
OPTIMIZATION OF RHBMP-2 ACTIVE FORM PRODUCTION IN A HETEROLOGOUS EXPRESSION SYSTEM USING MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR GENETIC APPROACHES
1N.F. Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow;
2A.N.Belozersky Research Institute of Physico-Chemical Biology, M.V. Lomonosov MSU, 119991, Moscow; 3All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, 127550, Moscow; 4Imtek, 121552, Moscow, Russia
Recombinant bone morphogenetic protein-2 (Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2)) has pronounced osteoinductive properties, as evidenced by the results of experimental and clinical practices. This applies both to the protein produced in eukaryotic cells and to the protein synthesized in bacterial cells. In eukaryotic expression system, production of the protein is extremely low and, consequently, the cost of materials based on it is very high. Therefore, optimization of heterologous expression systems for rhBMP-2 production represents an important task. In the present work optimization of codon composition of the rhBMP-2 gene nucleotide sequence and secondary structure of the transcript, as well as the strain selection for efficient gene expression were performed. The producing strain based on Escherichia coli BL-21(DE3) provides the high level of rhBMP-2 synthesis (about 57% of total cell proteins). Biological activity of rhBMP-2 dimeric forms purified from the obtained producing strain was measured by induction of alkaline phosphatase activity in C2C12 cells. It is comparable with that of commercial rhBMP-2 expressed in E. coli (R&D Systems, USA). Purified rhBMP-2 does not contain impurities of E. coli endotoxin and can be used in experimental studies of osteoinduction in laboratory animals. Keywords: Bone morphogenetic protein-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2); rhBMP-2; heterologous expression system; codon composition, the active form, dimer.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-132-137
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.821-005.4-085.214.3:577.21.084
Ставчанский В.В.1, Куриченкова Е.О.1, Дмитриева В.Г.1, Мясоедов Н.Ф.1, Лимборская С.А.1,2, Дергунова Л.В.12
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА CPLX2 В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ МОЭГА КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ ПЕПТИДОВ СЕМАКС И PGP С ИСПОЛьзОВАНИЕМ
двух экспериментальных моделей
'ФГБУН «Институт молекулярной генетики» Российской академии наук, 123182, Москва, Россия; ^Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997, Москва, Россия
Комплексин 2 — цитозольный белок, участвующий в экзоцитозе синаптических везикул. С помощью метода ОТ-ПЦР в реальном времени исследована динамика изменения экспрессии гена Cplx2, кодирующего данный белок, в отделах мозга крыс в течение суток в условиях неполной глобальной ишемии, а также в условиях фокальной ишемии спустя 3; 24 и 72 ч после необратимой окклюзии средней мозговой артерии. Наиболее существенное снижение транскриптов гена Cplx2 в условиях неполной глобальной ишемии обнаружено в гиппокампе и лобной коре крыс спустя 12 и 24 ч после необратимой окклюзии общих сонных артерий соответственно. В условиях другой модели — фокальной ишемии мозга крыс — снижение содержания транскриптов гена Ср1х2 выявлено только в участке лобно-теменной коры, включающей очаг повреждения, спустя 24 ч после окклюзии. Мы также изучили воздействие нейропротекторного препарата семакс и его С-концевого фрагмента Рго-О!у-Рго на экспрессию
гена Cplx2 в условиях данных моделей ишемии. При неполной глобальной ишемии применение семакса компенсировало максимальное снижение экспрессии гена Cplx2 в лобной коре и гип-покампе крыс, вызванное повреждением, однако в условиях фокальной ишемии пептид не оказал эффекта. Воздействие PGP на экспрессию гена Cplx2 в условиях экспериментальной ишемии носит более сложный характер и не всегда совпадает с эффектами семакса. Полученные результаты дают представление об особенностях экспрессии гена Cplx2 в условиях экспериментальной ишемии мозга, а также приближают нас к пониманию механизмов действия пептидных препаратов.
Ключевые слова: комплексин 2, семакс, Pro-Gly-Pro, альтернативные транскрипты, экспериментальная ишемия мозга крыс, нейропротекция.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-137-142
Церебральная ишемия, возникающая вследствие снижения мозгового кровотока и последующего дефицита кислорода и глюкозы в нервной ткани, приводит к нарушению функциональной активности и жизнеспособности нервных клеток. К числу самых ранних проявлений ишемии головного мозга относится нарушение синап-тической деятельности нейронов [1]. В синаптической трансмиссии участвует множество белков, в том числе — цитозольные белки комплексины, которые, взаимодействуя с рецепторным комплексом SNARE, регулируют высвобождение нейромедиаторов путем экзоцитоза [2, 3]. В высвобождении возбуждающих нейромедиаторов, в том числе — глутамата, способствующего развертыванию ишемического повреждения ткани мозга, участвует комплексин 2. Ген Cplx2, кодирующий данный белок, активно экспрессируется в нейронах и в астроцитах, которые принимают важное участие в регуляции выброса и обратного захвата глутамата [4]. Данные, полученные на модели обратимой окклюзии средней мозговой артерии (СМА) у мышей, а также с использованием первичной культуры нейронов, подвергнутой кислородному и глю-козному голоданию, свидетельствуют, что комплексин 2 является центральной мишенью воздействия продуктов окислительного стресса при инсульте, следствием которого является увеличение экспрессии гена Cplx, высвобождение глутамата и гибель нейронов [5]. Однако особенности функционирования гена Cplx2 при развитии инсульта, а также под воздействием нейропротекторных препаратов практически не исследованы.
В число препаратов, обладающих нейропротекторным свойством, входит отечественный препарат семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), состоящий из аналога фрагмента АКТГ (4-7) с присоединенной на C-конце последовательностью Pro-Gly-Pro (PGP). В многочисленных опытах in vitro и in vivo показано, что семакс проявляет целый ряд важных терапевтических свойств. Наиболее существенными из них являются ноотропные и нейропротекторные эффекты препарата [6—9]. Как показали исследования, семакс способствует выживанию нейронов в условиях гипоксии [10] и в условиях глутаматной нейротоксично-сти [11]. Трипептид PGP, защищающий молекулу семакса от преждевременной деградации, также является активным регуляторным пептидом [11, 12]. Ранее мы детально исследовали особенности функционирования генов нейротрофинов и их рецепторов в условиях экспериментальных моделей ишемии мозга крыс и показали активирующее действие семакса и PGP на их экспрессию при ишемии [13—15]. Учитывая важную роль комплексина 2 в высвобождении глутамата и других нейромедиаторов, представляется важным исследовать особенности функционирования гена Cplx2 при развитии ишемического повреждения, а также воздействие семакса и PGP на его экспрессию при ишемии. Поскольку в синтезе полноценного белка комплексина 2 участвуют альтернативные транскрипты Cplx2_v1 и Cplx_v2, отличающиеся участками 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) [16], мы определили динамику относительного содержания этих транскриптов в различных отделах мозга крыс.
Материал и методы животные. Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководством Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Publ. no. 80—23, revised 1996). Исследования выполнены на самцах белых крыс линии Вистар массой около 250 г, содержащихся в условиях естественного освещения и свободного доступа к еде и воде. Нами были применены две экспериментальные модели ишемии: неполная глобальная ишемия мозга (ГИМ) и фокальная ишемия мозга (ФИМ).
Модель неполной глобальной ишемии мозга (ГИМ). Данная модель ишемии достигалась путем необратимой двусторонней окклюзии шелковыми лигатурами общих сонных артерий. Операцию проводили под эфирным наркозом. Крысы (n = 84) были распределены на 4 группы: 1-я — ложнооперированные животные (л/о), которым вводился физраствор; 2-я — животные с ишемией, которым вводился физраствор; 3-я — животные с ишемией, получавшие семакс; 4-я — животные с ишемией, получавшие PGP. Через 15 мин после лигирования сосудов крысам внутрибрюшинно вводили препарат: семакс, PGP или физраствор. Кроме того, каждая группа делилась на временные подгруппы; животных выводили из эксперимента через 30 мин, 1; 2; 4; 8; 12 и 24 ч после окклюзии. В каждой такой подгруппе было не менее трех животных. Пептиды или физиологический раствор вводили соответствующим группам животных через 1; 4 и 8 ч после наложения лигатур. Семакс применялся из расчета 10 мкг/100 г массы тела крысы; PGP — 3,75 мкг/100 г Из мозга крыс выделяли лобные доли коры и гиппокамп.
Модель фокальной ишемии мозга (ФИМ). Эта модель ишемии достигалась путем необратимой коагуляционной окклюзии дистального участка левой средней мозговой артерии [17]. Операцию проводили под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Крысы (n = 60) также были разделены на 4 группы: 1-я — л/о животные, которым вводился физраствор; 2-я — животные с фокальной ишемией, которым вводился физраствор; 3-я — животные с окклюзией, получавшие семакс; 4-я — животные с окклюзией, получавшие PGP. Эти группы были разделены на 3 временные подгруппы: животных выводили из эксперимента через 3; 24 и 72 ч после операции под действием эфирного наркоза. В каждой такой подгруппе было не менее 4 животных. Через 15 мин, 1; 4 ч и далее через каждые 4 ч, животным 3-й и 4-й групп внутрибрюшинно вводили один из препаратов: семакс, PGP или физиологический раствор. Семакс использовали из расчета 10 мкг/100 г массы крысы; PGP — 3,75 мкг/100 г. Из мозга выделяли лобно-теменную долю коры и соответствующие ей подкорковые структуры.
Метод ОТ-ПЦР в реальном времени. Выделение РНК из тканей, синтез кДНК, полимеразную цепную реакцию в реальном времени и статистическую обработку данных проводили как описано ранее [15]. Специфичные праймеры к референсным генам Gapdh, Lhda, Rpl3 и двум альтернативным транскриптам гена Cplx2 были подобраны с помощью пакета программ OLIGO Primer Analysis Software 6.31 и синтезированы фирмой ЗАО «Ев-роген». Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в табл. 1. Для получения значений уровня относительной экспрессии (R) данные пороговой флуоресценции (Ct) обрабатывали при помощи программы REST (Relative Expression Software Tool) [18, 19]. Результаты представлены в табл. 2 и 3 в виде R ± SE.
Результаты и обсуждение
Анализ относительного содержания транскрип-тов гена Cplx2 в условиях экспериментальной ишемии. Динамика изменения содержания транскриптов гена Cplx2_v1 и Cplx2_v2, отличающихся 5'-НТО, в лобной коре и гиппокампе крыс в условиях неполной ГИМ представлена в табл. 2. В качестве контроля использовали л/о крыс, подвергнутых соответствующей операции, но без окклюзии сосудов. В первые 4 ч после наложения лигатур в лобной коре крыс в условиях эксперимента содержание транскриптов гена Cplx2 не отличалось от контроля. Спустя 8 и 12 ч после окклюзии наблюдалось увеличение содержания транскрип-тов Cplx2_v1 в 1,9 и 1,4 раза соответственно, а спустя 24 ч уровень экспрессии транскриптов гена Cplx2 упал более чем в 3 раза по сравнению с контролем. В отличие от данных, полученных нами, Wang Z. и соавт. при исследовании экспрессии гена Cplx2 в условиях модели обратимой окклюзии СМА в ишемизирован-ном полушарии мозга мышей спустя сутки после окклюзии наблюдали увеличение содержания транскрип-тов данного гена, а также кодируемого ими белка [5].
Таблица
Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в ПЦР
Праймер
Последовательность
GeneBank Acc. No.
Позиция
Gapdh прямой Gapdh обратный Ир13 прямой Ир13 обратный Ldha прямой Ldha обратный Ср1х2^1 прямой Ср1х2^1 обратный Ср1х2^2 прямой Ср1х2^2 обратный
5'-tgccatcaacgaccccttca-3'
5'-actcagcaccagcatcaccc-3'
5'-atgggtccttgggcttcttg-3'
5'-cacaatacccacaaccacca-3'
5'-gcgtctccctgaagtctctga-3'
5'-tccttgattccatagagaccct-3'
5'-ggaggagtgaggaggacggg-3'
5'-caccaagcagggtagatagcat-3'
5'-ctggctgaggggcgtgatt-3'
5'-cagcaaccgtctaagccactg-3'
NM 017008
NM 1987532
NM 017025
U35099
NM 053878
Авторы предположили, что активация экспрессии гена Ср1х2 происходит в результате воздействия продуктов окислительного стресса и способствует развитию глу-таматной эксайтотоксичности. Нельзя исключить, что обнаруженное нами небольшое увеличение транскрип-тов Ср1х2_у1 в лобной коре крыс также обусловлено воздействием активных форм кислорода на экспрессию гена Ср1х2 (см. табл. 2), однако в условиях использованной нами модели оно наблюдается в другое время: спустя 8 и 12 ч после окклюзии.
В условиях неполной ГИМ снижение экспрессии гена Ср1х2 в гиппокампе проявилось в более ранние сроки, чем в лобной коре (см. табл. 2). Достоверное снижение содержания обоих транскриптов гена Ср1х2 было обнаружено через 8 ч, а наиболее выраженное (0,3 от уровня соответствующих транскриптов у контрольных животных) — спустя 12 ч после окклюзии. В эти же временные точки в условиях данной модели в гиппокампе крыс ранее мы обнаружили существенное снижение содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов [15]. Полученные результаты хорошо согласуются с мнением о том, что в условиях неполной ГИМ именно эта область мозга в наибольшей степени страдает от недостатка кислорода и глюкозы [20].
Резкое снижение уровня обоих транскриптов гена
117—136 285—304
58—77 277—296 726—746 936—957
24—43 134—155
25—43 176—196
1 Cplx2 в гиппокампе и в лобной коре крыс, вероятно, является следствием гибели клеток, к которой приводит развитие ишемического повреждения. Гибель значительной части нейронов в лобно-теменной области коры и в подкорковых структурах мозга была обнаружены нами ранее при гистологическом исследовании мозга в условиях данной модели через 24 ч после перевязки сонных артерий [21].
Анализ экспрессии гена Cplx2 в условиях ФИМ выявил снижение содержания обоих транскриптов гена в участке лобно-теменной коры, включающей очаг повреждения, спустя 24 ч после окклюзии (см. табл. 3). Это снижение, вероятно, также отражает гибель клеток, участвующих в транскрипции данного гена. Анализ содержания транскриптов гена Cplx2 в подкорковых структурах через 3; 24 и 72 ч после операции не выявил достоверных отличий уровня экспрессии гена в группах ишемизированных и л/о животных (см. табл. 3). По-видимому, это обусловлено тем, что в данных условиях подкорковая область в значительно меньшей степени страдает от ишемии [17].
Таким образом, по нашим данным, содержание транскриптов гена Cplx2 в мозге животных в условиях экспериментальной ишемии в значительной степени определяется условиями модели и может зависеть от глубины повреждения. При этом на обеих моделях, использованных нами, ишемия вызывает преимущественно снижение уровня экспрессии гена Cplx2.
Влияние пептидов семакс и PGP на содержание транскриптов гена Cplx2 в мозге крыс в условиях экспериментальной ишемии. Для исследования влияния пептидов семакс и PGP на содержание транскриптов Cplx2_v1 и Cplx2_v2 в мозге крыс в условиях неполной ГИМ и ФИМ в качестве контроля использовали животных с ишемией, получавших физиологический раствор во временных точках, в которых опытным животным вводили растворы пептидов. На ранних этапах неполной ГИМ (0,5—2 ч после окклюзии) под воздействием
Таблица 2
Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в лобной коре и гиппокампе крыс, подвергнутых
неполной глобальной ишемии, получавших семакс и PGP
Область Cplx 0,5 ч 1 ч 2 ч 4 ч 8 ч 12 ч 24 ч
Ишемия + физраствор/контроль (ложнооперированные + физраствор)
Кора v1 0,97 ± 0,07 1,49 ± 0,14 0,88 ± 0,03 0,89 ± 0,09 1,87 ± 0,20* 1,41 ± 0,22* 0,20 ± 0,03*
v2 0,79 ± 0,05 0,82 ± 0,07 0,79 ± 0,03 0,78 ± 0,07 1,10 ± 0,10 1,45 ± 0,27 0,33 ± 0,04*
Гиппокамп v1 1,22 ± 0,15 0,81 ± 0,10 0,42 ± 0,06* 1,60 ± 0,24 0,53 ± 0,07* 0,25 ± 0,04* 1,02 ± 0,10
v2 0,84 ± 0,24 0,66 ± 0,08 0,63 ± 0,10 0,87 ± 0,11 0,57 ± 0,05* 0,34 ± 0,07* 0,51 ± 0,05*
Ишемия + семакс/контроль (ишемия + физраствор)
Кора v1 1,22 ± 0,09 0,71 ± 0,10 1,3 ± 0,07 1,39 ± 0,10* 0,29 ± 0,03* 0,94 ± 0,17 1,74 ± 0,19*
v2 1,64 ± 0,13* 1,29 ± 0,16 1,16 ± 0,08 1,55 ± 0,15* 0,58 ± 0,05* 0,91 ± 0,07 1,37 ± 0,09*
Гиппокамп v1 0,53 ± 0,06* 1,15 ± 0,14 1,71 ± 0,22* 0,71 ± 0,09 0,65 ± 0,12 2,72 ± 0,23* 1,37 ± 0,18
v2 1,13 ± 0,34 1,27 ± 0,35 1,06 ± 0,21 0,75 ± 0,13 0,62 ± 0,06 2,25 ± 0,22 1,58 ± 0,15
Ишемия + PGP/контроль (ишемия + физраствор)
Кора v1 0,52 ± 0,05* 0,44 ± 0,04 1,50 ± 0,11* 0,97 ± 0,09 0,35 ± 0,02* 2,70 ± 0,83* 1,59 ± 0,15*
v2 0,52 ± 0,04 1,00 ± 0,11 1,33 ± 0,06* 0,91 ± 0,11 0,84 ± 0,05* 1,70 ± 0,24* 1,14 ± 0,07
Гиппокамп v1 0,45 ± 0,05* 1,75 ± 0,17* 1,52 ± 0,13 0,42 ± 0,03* 2,14 ± 0,27* 1,85 ± 0,15* 1,92 ± 0,43
v2 0,48 ± 0,14 2,06 ± 0,72 0,79 ± 0,12 0,62 ± 0,05 1,62 ± 0,09 1,12 ± 0,15 1,52 ± 0,33*
Примечание. Здесь и в табл. 3: числовое значение показывает, во сколько раз изменился уровень транскриптов гена Cplx2 у животных в результате действия ишемии и введения пептидов семакс или PGP относительно уровня содержания транскриптов этого гена у контрольных животных. Данные представлены в виде R + SE. * — p < 0,05. Статистически значимые результаты дополнительно выделены полужирным шрифтом.
Таблица 3
Динамика изменений относительного содержания транскрип-тов гена Cplx2 в лобно-теменной коре и соответствующей ей подкорковой области головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших семакс и PGP
Область
Cplx
3 ч
24 ч
72 ч
Ишемия + физраствор/контроль (ложнооперированные + физраствор)
Кора v1 0,80 ± 0,14 0,45 ± 0,12* 0,99 ± 0,34
v2 0,86 ± 0,15 0,51 ± 0,13* 1,25 ± 0,62
Подкорка v1 0,89 ± 0,15 0,86 ± 0,23 0,95 ± 0,17
v2 0,86 ± 0,16 0,85 ± 0,23 0,95 ± 0,23
Ишемия + семакс/контроль (ишемия + физраствор)
Кора v1 0,95 ± 0,20 1,00 ± 0,49 0,94 ± 0,49
v2 1,02 ± 0,20 1,03 ± 0,43 0,90 ± 0,53
Подкорка v1 0,87 ± 0,20 1,10 ± 0,14 1,04 ± 0,21
v2 0,93 ± 0,21 1,09 ± 0,13 1,06 ± 0,23
Ишемия + PGP/контроль (ишемия + физраствор)
Кора v1 1,07 ± 0,24 0,85 ± 0,29 0,33 ± 0,16*
v2 1,16 ± 0,26 0,78 ± 0,24 0,34 ± 0,16*
Подкорка v1 1.11 ± 0,10 1,12 ± 0,15 1,05 ± 0,21
v2 1,14 ± 0,14 1,11 ± 0,14 1,15 ± 0,19
семакса обнаружено незначительное изменение содержание отдельных транскриптов гена Cplx2 в мозге крыс. Достоверное увеличение обоих транскриптов более чем в 1,4 раза наблюдалось в лобной коре через 4 ч после окклюзии. Через 8 ч после окклюзии содержание обоих транскриптов гена Cplx2 в лобной коре резко снизилось, а спустя 24 ч достоверно увеличилось. В гиппокампе крыс под воздействием семакса достоверное увеличение уровня мРНК Cplx2 более чем в 2 раза относительно контроля наблюдалось через 12 ч после окклюзии: в момент максимального снижения экспрессии гена при ишемии мозга у животных, получавших физраствор. В условиях неполной ГИМ введение трипептида PGP вызвало значительные колебания экспрессии транскриптов гена Cplx2 в мозге животных относительно уровня мРНК этого гена у контрольных животных. Но если в первой половине суток после окклюзии эффекты PGP заметно отличались от влияния семакса, то во второй половине преимущественно совпадали: оба пептида активировали экспрессию гена Cplx2 и препятствовали развитию изменений, вызванных ишемией.
Как показали исследования Сторожевых и соавт., проведенные на культивируемых зернистых клетках мозжечка крыс в условиях глутаматной токсичности, семакс и PGP замедляют развитие кальциевой дизре-гуляции и снижение митохондриального потенциала [11]. Обнаружив, что в присутствии семакса и PGP выживаемость нейронов в среднем повышается на 30%, авторы объяснили нейропротекторный эффект семакса при ишемии большей устойчивостью митохондрий к повреждающему действию глутамата, а также к окислительному и «кальциевому» стрессу [11]. Выявленное нами увеличение экспрессии гена Cplx2 в лобной коре и гиппокампе крыс в присутствии семакса и PGP при ишемии также может свидетельствовать о влиянии пептидов на выживаемость клеток мозга, участвующих в транскрипции данного гена.
В условиях ФИМ мы не обнаружили статистически значимого влияния препарата семакс на содержание транскриптов гена Cplx2 ни в лобной коре, ни в подкорковых структурах. В присутствии PGP в лобной коре через 72 ч после коагуляции сосудов наблюдалось до-
стоверное снижение уровня мРНК Cplx2 (см. табл. 3). Возможно, спустя 3 сут после окклюзии, в период восстановления мозга, PGP оказывает эффект, предположительно направленный на снижение экзоцитоза и другие процессы.
По данным литературы, семакс оказывает нейро-протекторное действие при ишемии, основными проявлениями которого являются торможение воспалительных реакций, торможение синтеза оксида азота и реакций окислительного стресса, иммуномодуляция [11, 22—24]. В ранних исследованиях эффектов ишемии было показано, что в условиях ГИМ семакс оказывает положительный эффект, проявляющийся в снижении неврологических расстройств в первые часы после операции, а также в повышении выживаемости у животных по сравнению с контролем [6]. Результаты, полученные нами, свидетельствуют, что при ишемии семакс и PGP способствуют восстановлению сниженной экспрессии гена Cplx2, обусловленной, по-видимому, массированной гибелью клеток мозга.
Ранее при изучении особенностей структурной организации гена комплексина 2 у человека и грызунов мы обнаружили два варианта альтернативных транскриптов гена, отличающихся участками 5'-НТО [17]. Синтез таких транскриптов, возможно, направляется различными промоторами гена и может регулироваться на посттранскрипционном уровне под воздействием физиологических условий. Небольшое различие содержание транскриптов Cplx2_v1 и Cplx_v2 в отдельных временных точках нашего эксперимента, по-видимому, реализуется за счет предпочтительного использования одного из альтернативных промоторов, обеспечивающих потребность клеток в данном белковом продукте. Однако следует отметить, что в большинстве экспериментальных точек в условиях ишемии, а также под воздействием пептидов синтез транскриптов гена Cplx2 изменяется однонаправ-ленно. По-видимому, работа промоторов, обеспечивающих их синтез, является скоординированной.
Заключение
Таким образом, несмотря на различия использованных в эксперименте моделей ишемии, обнаруженное нами одновременное снижение содержания альтернативных транскриптов гена в Cplx2 в мозге крыс через 24 ч после окклюзии сосудов может отражать гибель клеток, участвующих в их транскрипции, и служить показателем глубины повреждения тканей мозга в условиях экспериментальной ишемии. Тот факт, что семакс и PGP частично компенсируют изменения содержания транскриптов Cplx2, вызванные ишемией, позволяет заключить, что введение пептидов препятствует развитию изменений экспрессии гена Cplx2, что может способствовать восстановлению синаптической деятельности нервных клеток, нарушенной ишемиче-ским повреждением.
Благодарности. Авторы выражают благодарность Твороговой Т.В., Боциной А.Ю. и Поваровой О.В. за помощь в постановке моделей экспериментальной ишемии мозга животных.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Совета по грантам Президента РФ для поддержки молодых российских ученых, грант МК-2959.2014.4 (постановка модели неполной глобальной ишемии мозга), Российского Фонда Фундаментальных Исследований, грант 14-04-00487 (постановка модели фокальной ишемии мозга), и Российского Научного Фонда, грант № 16-14-00077 (анализ экспрессии генов, статистическая обработка данных).
ЛИТЕРАТУРА
1. Hofmeijer J., van Putten M.J. Ischemic cerebral damage: an appraisal of synaptic failure. Stroke. 2012; 43(2): 607—15.
2. Pabst S., Hazzard J.W., Antonin W., Sudhof T.C., Jahn R., Rizo J. et al. Selective interaction of complexin with the neuronal SNARE complex. Determinationof the binding regions. J. Biol. Chem. 2000; 275(26): 19808—18.
3. Neher E. Complexin: does it deserve its name? Neuron. 2010; 68(5): 803—6.
4. Hazell A.S., Wang D. Identification of complexin II in astrocytes: a possible regulator of glutamate release in these cells. Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 2011; 404(1): 228—32.
5. Wang Z., Wei X., Liu K., Zhang X., Yang F., Zhang H. et al. NOX2 deficiency ameliorates cerebral injury through reduction of complexin II-mediated glutamate excitotoxicity in experimental stroke. Free Radic. Biol. Med. 2013; 65: 942—51.
6. Яковлева Е.В., Кузенков В.С., Федоров В.Н., Скворцова В.И., Кошелев В.Б., Гусев Е.И. и др. Исследование эффективности семакса при глобальной ишемии мозга in vivo. Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины. 1999; 128(8): 172—4.
7. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Мясоедов Н.Ф., Незавибатько В.Н., Журавлева Е.И., Ваничкин А.В. Эффективность семакса в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1997; 97: 26—34.
8. Мясоедов Н.Ф., Скворцова В.И., Насонов Е.Л., Журавлева Е.И., Гривенников И.А., Арсеньева Е.Л. и др. Изучение механизмов нейропротективного действия семакса в остром периоде ише-мического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1999; 5: 15—9.
9. Алексеева Г.В., Боттаева Н.А., Горшкова В.В. Применение се-макса в отдаленном периоде у больных с постгипоксической патологией мозга. Анестезиология и реаниматология. 1999; 1: 40—3.
10. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс. Физиология человека. 1992; 18(5): 104—7.
11. Сторожевых Т.П., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф. Влияние семакса и его фрагмента Pro-Gly-Pro на кальциевый гомеостаз нейронов и их выживаемость в условиях глутаматной токсичности. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007; 143(5): 538—41.
12. Мартынова К.В., Андреева Л.А., Климова П.А., Кириллова Ю.Г., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю. и др. Структурно-функциональное исследование глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипро-линов) как потенциальных нейропротекторов. Биоорганическая химия. 2009; 35: 165—71.
13. Дмитриева В.Г., Дергунова Л.В., Поварова О.В., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф. Действие семакса и его C-концевого трипептида PGP на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс. Доклады Академии Наук. 2008; 422(2): 258—61.
14. Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. Semax and Pro-Gly-Pro Activate the Transcription of Neurotrophins and Their Receptor Genes after Cerebral Ischemia. CellMol. Neurobiol. 2010; 30(1): 71—9.
15. Ставчанский В.В., Творогова Т.В., Боцина А.Ю., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф. и др. Семакс и его C-концевой фрагмент PGP влияют на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в условиях неполной глобальной ишемии мозга крыс. Молекулярная биология. 2011; 45(5): 1—10.
16. Raevskaya N.M., Dergunova L.V., Vladychenskaya I.P., Stavchan-sky V.V., Oborina M.V., Poltaraus A.B. et al. Structural organization of the human complexin 2 gene (CPLX2) and aspects of its functional activity. Gene. 2005; 359: 127—37.
17. Dmitrieva, V.G., Torshina, E.V., Yuzhakov, V.V., Povarovac O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A. et al. Expression of sphingomyelin synthase 1 gene in rat brain focal ischemia. Brain Res. 2008; 1188: 222—7.
18. Pfaffl M.W. A new mathematical model for ralative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001; 29 (9): 2002—7.
19. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2002; 30(9): e36.
20. Sieber F.E.; Palmon S.C., Traystman R.J., Martin L.J. Global Incomplete Cerebral Ischemia Produces Predominantly Cortical Neuronal Injury. Stroke. 1995; 26: 2091—6.
21 .Stavchansky V.V., Yuzhakov V.V., Botsina AY., Skvortsova V.l., Bondurko L.N., Tsyganova M.G. et al. The Effect of Semax and Its C-End Peptide PGP on the Morphology and Proliferative Activity of Rat Brain Cells During Experimental Ischemia: A Pilot Study. J. Mol. Neurosci. 2011; 45(2): 177—85.
22. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека. Доклады академии наук. 2000; 374(3): 401—3.
23. Bashkatova V.G., Koshelev V.B., Fadyukova O.E., Alexeev A.A., Vanin A.F., Rayevsky K.S., Ashmarin I.P., Armstrong D.M. Novel synthetic analogue of ACTH 4-10 (Semax) but not glycine prevents the enhanced nitric oxide generation in cerebral cortex of rats with incomplete global ischemia. Brain. Res. 2001; 894: 145—9.
24. Medvedeva E.V., Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Limborska S.A., Skvortsova V.I., Myasoedov N.F. et al. The peptide semax affects the expression of genes related to the immune and vascular systems in rat brain focal ischemia: Genome-wide transcriptional analysis. BMC Genomics. 2014; 15: 228. Available at: http://www.biomedcen-tral.com/1471-2164/15/228.
Поступила 12.05.16
REFERENCES
1. Hofmeijer J., van Putten M.J. Ischemic cerebral damage: an appraisal of synaptic failure. Stroke. 2012; 43(2): 607—15.
2. Pabst S., Hazzard J.W., Antonin W., Südhof T.C., Jahn R., Rizo J. et al. Selective interaction of complexin with the neuronal SNARE complex. Determinationof the binding regions. J. Biol. Chem. 2000; 275(26): 19808—18.
3. Neher E. Complexin: does it deserve its name? Neuron. 2010; 68(5): 803—6.
4. Hazell A.S., Wang D. Identification of complexin II in astrocytes: a possible regulator of glutamate release in these cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011; 404(1): 228—32.
5. Wang Z., Wei X., Liu K., Zhang X., Yang F., Zhang H. et al. NOX2 deficiency ameliorates cerebral injury through reduction of complexin II-mediated glutamate excitotoxicity in experimental stroke. Free Radic. Biol. Med. 2013; 65: 942—51.
6. Iakovleva E.V., Kuzenkov V.S., Fedorov V.N., Skvortsova V.I., Koshelev V.B., Gusev E.I. et al. Study of the efficacy of semax in global cerebral ischemia in vivo. Bulletin of experimental biology and medicine. 1999; 127(8): 172—4. (in Russian)
7. Gusev E.I., Skvortsova V.I., Miasoedov N.F., Nezavibat'ko V.N., Zhuravleva E.I., VanichkinA.V. Effectiveness of semax in acute period of hemispheric ischemic stroke (a clinical and electrophysiological study). Zhurnal nevrologii i psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 1997; 97: 26—34. (in Russian)
8. Miasoedov N.F., Skvortsova V.I., Nasonov E.L., Zhuravleva E.I., Grivennikov I.A., Arsen'eva E.L. et al. Investigation of mechanisms of neuroprotective effect of semax in acute period of ischemic stroke. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 1999; 99: 15—9. (in Russian)
9. Alekseeva G.V., Bottaeva N.A., Gorshkova V.V. Semax application in patients with post-hypoxic brain pathology in long-term period. Anesteziologiya i reanimatologiya. 1999; 1: 40—43. (in Russian)
10. Kaplan A.I., Koshelev V.B., Nezavibat'ko V.N., Ashmarin I.P. Increased resistance to hypoxia effected by the neuropeptide preparation SEMAX. Fiziologiia cheloveka. 1992; 18: 104—7. (in Russian)
11. Storozhevykh T.P., Tukhbatova G.R., Senilova Y.E., Pinelis V.G., Andreeva L.A., Myasoyedov N.F. Effects of semax and its Pro-Gly-Pro fragment on calcium homeostasis of neurons and their survival under conditions of glutamate toxicity. Bulletin of experimental biology and medicine. 2007; 143: 601—4. (in Russian)
12. Martynova K.V., Andreeva L.A., Klimova P.A., Kirillova Yu.G., Shevchenko V.P., Nagaev I.Yu. et al. Structural-functional study of glycine-and-proline-containing peptides (glyprolines) as potential neuroprotectors. BioorganicheskayaKhimiya. 2009; 35(2): 165—71. (in Russian)
13. Dmitrieva V.G., Dergunova L.V., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborskaya S.A., Myasoedov N.F. The effect of semax and the C-terminal peptide PGP on expression of growth factor genes and receptors in rats under conditions of experimental cerebral ischemia. Dokl. Biochem. Biophys. 2008; 422: 261—4.
14. Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. Semax and Pro-Gly-Pro activate the transcription of neurotrophins and their receptor genes after
cerebral ischemia. Cell Mol. Neurobiol. 2010; 30(1): 71—9.
15. Stavchanskiy V.V., Tvorogova T.V., Botsina A.Yu., Skvortsova V.l., Limborskaia S.A., Miasoedov N.F. et al. The effect of semax and its C-end peptide PGP on expression of the neurotrophins and their receptors in the rat brain during incomplete global ischemia. Mol. Biol. (Mosk). 2011; 45(6): 1026—35. (in Russian)
16. Raevskaya N.M., Dergunova L.V., Vladychenskaya I.P., Stavchan-sky V.V., Oborina M.V., Poltaraus A.B. et al. Structural organization of the human complexin 2 gene (CPLX2) and aspects of its functional activity. Gene. 2005; 359: 127—37.
17. Dmitrieva, V.G., Torshina, E.V., Yuzhakov, V.V., Povarovac O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A. et al. Expression of sphingomyelin synthase 1 gene in rat brain focal ischemia. Brain Res. 2008; 1188: 222—7.
18. Pfaffl M.W. A new mathematical model for ralative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001; 29(9): 2002—7.
19. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2002; 30(9): e36.
20. Sieber F.E.; Palmon S.C., Traystman R.J., Martin L.J. Global Incomplete Cerebral Ischemia Produces Predominantly Cortical Neuronal Injury. Stroke. 1995; 26: 2091—6.
21. Stavchansky V.V., Yuzhakov V.V., Botsina A.Y., Skvortsova V.I., Bondurko L.N., Tsyganova M.G. et al. The Effect of Semax and Its C-End Peptide PGP on the Morphology and Proliferative Activity of Rat Brain Cells During Experimental Ischemia: A Pilot Study. J. Mol. Neurosci. 2011; 45(2): 177—85.
22. Astashkin E.I., Bespalova Yu.B., Grivennikov I.A., Smirnov O.N., Glezer M.G., Grachev S.V. Effects of Semax on Ca2+ responses of human neutrophils. Dokl. Biol. Sci. 2000; 374: 536—8.
23. Bashkatova V.G., Koshelev V.B., Fadyukova O.E., Alexeev A.A., Vanin A.F., Rayevsky K.S., Ashmarin I.P., Armstrong D.M. Novel synthetic analogue of ACTH 4-10 (Semax) but not glycine prevents the enhanced nitric oxide generation in cerebral cortex of rats with incomplete global ischemia. Brain. Res. 2001; 894: 145—9.
24. Medvedeva E.V., Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Limborska S.A., Skvortsova V.I., Myasoedov N.F. et al. The peptide semax affects the expression of genes related to the immune and vascular systems in rat brain focal ischemia: Genome-wide transcriptional analysis. BMC Genomics. 2014; 15: 228. Available at: http://www.biomedcentral. com/1471-2164/15/228
Поступила 12.05.16
V.V. Stavchansky1, E.O. Kurichenkova1, V.G. Dmitrieva1, NF. Myasoedov1, SA. Limborska12, L.V. Dergunova12
CPLX2 GENE EXPRESSION FOLLOWING SEMAX OR PGP ADMINISTRATION UNDER CONDITIONS OF TWO EXPERIMENTAL MODELS OF RAT BRAIN ISCHEMIA
1 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences,
123182, Moscow, Russian Federation 2 Pirogov Russian National Research Medical University, 117997, Moscow, Russian Federation
Complexin 2 is a cytosolic protein participating in synaptic vesicle exocytosis. The RT-PCR technique was used in a real-time study of the dynamics of variation of the expression of the Cplx2 gene that encodes this protein. The study was performed in the rat brain. The duration of study under the conditions of incomplete global ischemia was 1 day; measurements under the conditions of focal ischemia were performed 3, 24 and 72 h after the irreversible occlusion of the medial cerebral artery. The most significant decrease in Cplx2 transcripts under the conditions of incomplete global ischemia was observed in the hippocampus and the frontal cortex of rats 12 and 24 hours after the irreversible occlusion of the common carotid arteries, respectively. Under the conditions of focal ischemia, a decrease in the content of Cplx2 transcripts was observed only in the frontoparietal cortex region containing the lesion focus 24 h after occlusion. The effect of the Semax neuroprotector and its C-terminal fragment Pro-Gly-Pro on Cplx2 expression was also studied under the model ischemia conditions. In the case of incomplete global ischemia, the application of Semax compensated the maximal decrease in Cplx2 expression in the frontal cortex and the hippocampus in rats caused by lesion. However, the peptide had no effect when used in rats with focal ischemia. The effect of PGP on Cplx2 expression under conditions of experimental ischemia was more complicated and did not always coincide with the effect of Semax. The obtained results provide insight into the specific features of Cplx2 expression under the conditions of experimental brain ischemia and help to better understand the mechanisms of activity of peptide preparations. Keywords: complexin 2, Semax, Pro-Gly-Pro, alternative transcripts, experimental brain ischemia in rats, neuroprotection
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-137-142
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.9-022.369:579.862]:618.2
Кузьмин В.Н., Арсланян К.Н., Харченко Э.И., Адамян Л.В. РОЛЬ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ В В РАЗВИТИИ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Кафедра репродуктивной хирургии и медицины ФДПО ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России,
127473, Москва, Россия
В статье освещена роль стрептококка группы В в развитии вну-трибольничной инфекции в акушерском стационаре. Рассмотрены его особенности, распространенность, факторы риска заражения, различные формы бактериальной инфекции у грудных детей, беременных, родильниц. Представлены мировые данные и данные собственного исследования роли стрептококка группы В в акушерстве и перинатологии.
Ключевые слова: стрептококк группы B, внутрибольнич-ные инфекции, акушерство, перинатология
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-142-149
Заболевания, вызванные стрептококком группы В (СГБ), являются ведущей причиной детской смертности во всем мире. СГБ колонизирует прямую кишку и
Для корреспонденции: Харченко Эльмира Ильгизаровна, канд. мед. наук, ассистент кафедры репродуктивной медицины и хирургии факультета последипломного образования Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета имени А.И. Евдокимова, E-mail: hadeeva_elmira@inbox.ru
влагалище матери, передается при прохождении через родовые пути, что является важным фактором риска для развития инфекционного заболевания. Известны также пути передачи СГБ через грудное молоко. Однако большинство младенцев не инфицируются СГБ.
СГБ — это грамположительный кокк, формирующий цепочки вариабельной, но меньшей длины по сравнению с пиогеннным стрептококком. Факультативный анаэроб. Типичные штаммы слабо лизируют in vitro эритроциты жвачных (гемолиз типа Р), что стало основой для отнесения бактерии к бета-гемолитической группе стрептококков. Однако 25—30% штаммов атипичны по данному признаку (проявляют а-гемолиз или не обладают выраженными гемолитическими свойствами).
СГБ образует 2 типа полисахаридных антигенов: группоспецифический (общий для всех штаммов, интегрированный в стенку бактерии) и капсульные. Выявление первого позволяет дифференцировать бактерию от стрептококков других групп, а по капсульным антигенам штаммы бактерии делят на 10 известных в настоя-
