CC BY
14
« Спектр мутаций гена VHL при спорадическом
Г1 светлоклеточном почечно-клеточном раке
со
us
и ш и
X
Н.Н. Мазуренко1, И.В. Цыганова1, В.В. Стрельников2, А.В. Балбуцкий1, Т.Ф. Маливанова1, Е.Б. Кузнецова2, В.А. Драудин-Крыленко1, О.В. Шаньгина1, А.Ф. Мукерия1, В.Б. Матвеев1, Д.Г. Заридзе1
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; ФГБНУ«Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова»; Россия, 115522 Москва, ул. Москворечье, 1
Контакты: Наталья Николаевна Мазуренко nnmazurenko@mail.ru
Нарушения гена VHL являются ранней и характерной особенностью светлоклеточного почечно-клеточного рака (скПКР). Проведен анализ мутаций VHL в 98 образцах скПКР для определения их локализации относительно функционально значимых мотивов белка VHL. Анализ мутаций VHL проводили в ДНК из свежезамороженных тканей опухоли секвенированием по Сэнгеру, параллельно 62 образца скПКР подвергли секвенированию нового поколения (next generation sequencing, NGS). В 73 (74,4 %) из 98 образцов скПКР обнаружены нон-сайлент-мутации в кодирующей части гена VHL. Мутации, нарушающие функции белка VHL (нонсенс-мутации, мутации в сайтах сплайсинга и делеции/инсерции со сдвигом рамки считывания), выявлены в 40 (40,8 %) образцах скПКР, миссенс-мутации — в 35 (35,7 %). Всего обнаружено 76мутаций, влияющих на функции белка VHL в 72 (73 %) образцах скПКР, причем 15мутаций не были описаны ранее (делеции/инсерции VHL со сдвигом или без сдвига рамки считывания). В 4 случаях скПКР выявлено по 2 мутации VHL. Большинство миссенс-мутаций нарушают сайты взаимодействия белка VHL с HIF, РКС или кинезином. Рассмотрен вопрос о патогенности сайлент-мутации p.P154P и мутаций в интронах вблизи сайтов сплайсинга. Полученные результаты важны для изучения роли мутаций VHL в прогрессировании и прогнозе скПКР.
Ключевые слова: светлоклеточный почечно-клеточный рак, мутации VHL, секвенирование по Сэнгеру, NGS-анализ
Для цитирования: Мазуренко Н.Н., Цыганова И.Б., Стрельников В.В. и др. Спектр мутаций гена VHL при спорадическом светлоклеточном почечно-клеточном раке. Успехи молекулярной онкологии 2020;7(3):48—57.
DOI: 10.17650/2313-805X-2020-7-3-48-57
Spectrum of VHL mutations in clear cell renal cell carcinoma
SJ N.N. Mazurenko1, I. V. Tsyganova1, V. V. Strelnikov2, A. V. Balbutsky1, T.F. Malivanova1, E.B. Kuznetsova2, V.A. Draudin-Krilenko',
O. V. Shangina1, A.F. Mukeria1, V.B. Matveev1, D.G. Zaridze1
1N.N.. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia; 2N.P. Bochkov Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow 115522, Russia
The VHL gene alterations are the early and characteristic feature of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). We have examined VHL mutations in sporadic 98 ccRCC cases to evaluate their localization in relation to functionally important motifs of the VHL protein. The DNA samples were obtained from snap-frozen carcinoma biopsies and used for Sanger sequencing, while 62 ccRCC DNA cases were studied by next generation sequencing (NGS) analysis in parallel. In 73 (74.4 %) of 98 ccRCC cases the somatic non-silent VHL mutations were identified. Loss of function VHL mutations (nonsilent, frameshifts or in splicing sites) were detected in 40 (40.8 %) ccRCC, while missense mutations — in 35 (35.7 %) ccRCC. In total 76 mutations important for VHL functioning were detected in 72 (73 %) ccRCC samples, of them 15 mutations (deletion/insertion in-frame or frameshifts) were identified for the first time. Four ccRCC cases contained two mutations each. Most of missense mutations disturb the sites of VHL interactions with HIF, PKC or kinesin. The pathogenicity of p.P154P silent mutation and intronic mutations near mRNA VHL splicing sites was discussed. The obtained results are important for understanding the role of VHL mutations in ccRCC progression and prognosis.
Key words: clear cell renal cell carcinoma, VHL mutations, Sanger sequencing, NGS analysis
For citation: Mazurenko N.N., Tsyganova I. V., Strelnikov V.V. et al. Spectrum of VHL mutations in clear cell renal cell carcinoma. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2020;7(3):48—57. (In Russ.).
Введение
Рак почки занимает 9-е место по распространенности в структуре онкологической заболеваемости в мире [1]. Ежегодно регистрируют более 330 тыс. новых случаев заболевания раком почки и более 140 тыс.
смертей от этой патологии. В России в 2017 г. было зарегистрировано 24 779 новых случаев рака почки, от него умерли 8386 человек, причем заболеваемость с 1990 г. выросла с 5,5 до 13,8 случая на 100 тыс. населения [2, 3].
Рак почки представлен различными гистологическими формами, наиболее распространен (80—85 %) светлоклеточный почечно-клеточный рак (скПКР), который отличается наибольшей агрессивностью. Для скПКР характерны нарушения гена von Hippel— Lindau (VHL), которые присутствуют как у пациентов с семейным раком почки с наследственным синдромом von Hippel—Lindau (2—4 %), так и у больных спорадическим раком почки. Изменения гена VHL являются ранним и общим событием в канцерогенезе спорадического скПКР. В 85—98 % случаев имеет место потеря гетерозиготности на 3р, что в сочетании с мутациями приводит к биаллельной инактивации гена VHL, при этом выявляют разнообразные соматические мутации: делеции/инсерции со сдвигом рамки считывания, нонсенс- и миссенс-мутации, мутации, затрагивающие сайты сплайсинга [4—6]. В 8—19 % случаев скПКР инактивация гена VHL происходит за счет гиперметилирования промотора [7—9]. Нарушения VHL характерны именно для скПКР [10], тогда как гиперметилирование промотора выявляется в равной степени в различных гистологических подтипах по-чечно-клеточного рака (ПКР) [11].
Ген VHL размером 10 kb расположен в локусе 3р25.3, состоит из 3 экзонов и кодирует 2 белковых изоформы VHL 30 (экзоны 1, 2, 3; 213 ак) и VHL19 (экзоны 1 и 3; 160 ак). Каноническая изоформа VHL30 является компонентом Е3 убиквитинлигазного комплекса VCB-cul2, содержащего элонгины С и В, белки Cullin-2 и Rbx1. Белок VHL связывается более чем с 30 белками для их последующей убиквитинзависимой деградации, в том числе с индуцируемыми гипоксией факторами (HIF), протеинкиназой С, ретинолсвязывающим белком 1 [12]. Среди мишеней VHL наиболее изучены субъединицы HIF1a/2 а, регулирующие транскрипцию большого числа генов, в том числе VEGF, PDGF, EPO, CA9 и CXCR4, важных для клеточного метаболизма, ан-гиогенеза, инвазии и метастазирования [13].
Белок VHL30 имеет N-концевой домен в 53 аминокислотных остатка (включает 8 копий кислых пен-тамерных повторов GXEEX), который связывается с фибрином и, как принято считать, не несет функциональной нагрузки (см. рисунок). Однако имеются указания, что фосфорилирование этого домена влияет на супрессивные свойства белка VHL [14]. Изучение кристаллической структуры показало, что центральная и С-концевая части VHL30 состоят из р-сэндвич домена, распознающего субстрат (63—154 ак, кодируются экзонами 1 и 2; 193—204 ак, кодируются экзоном 3), и а-спирального домена (155—192 ак, кодируются экзоном 3), который контактирует с элонгином С. В нормальных условиях в присутствии кислорода субъединицы HIF после гидроксилирования пролил-гидроксилазой PHD приобретают способность связываться с р-доменом белка VHL, который через а-домен формирует третичный комплекс с элонгинами C и B, компонентами Е3 убиквитинлигазного комплекса. При этом молекулы убиквитина взаимодействуют с HIF и осуществляют его протеолиз. В условиях гипоксии негидроксилированные субъединицы HIF1a образуют гетеродимеры с HIF1P, поступают в ядро и активируют транскрипцию генов, ответственных за функционирование клеток при низком содержании кислорода. Кроме дестабилизации HIF1a белок VHL участвует в активации многих эффекторных белков, регулирующих активацию р53, стабильность микротрубочек, клеточную сценесценцию и анеуплоидию клеток, апопотоз нейронов, убиквитинизацию РНК-полимеразы, активность NF-kB [15].
При анализе публикаций выявляются значительные различия в частоте мутаций VHL при скПКР — от 41 до 82 % [4, 7, 11, 16—21]. Вариации в частоте мутаций частично связаны с тем, что одни авторы изучают только нон-сайлент-мутации в экзонах, влияющие на структуру белка VHL [21], тогда как другие описывают все мутации, включая мутации в первых
CV a CV
CS
и ш u
ж ш
и
Ген VHL / VHL gene
340 341
463 464
642
5' Экзон 1 / Exon 1 > ! Экзон 2 / Exon 2 / i Экзон 3 / Exon 3 5'
н \ ff
J Ч
Белок VHL / VHL protein
(GXEEX),
1 14
ATG
54 63
\ I
* I \
\
i
. I
\ I v t \ t li I
114
155
ATG
HIF
PKC
Элонгин С / Elongin С
193 204 213
ß
ß
a
Структура гена и белка VHL VHL gene and protein structure
CV а CV
со
us
и ш u
X ш
и
53 кодонах экзона 1, сайлент-мутации, а также мутации в интронах. Различия в результатах также могут быть связаны с выборкой пациентов, процентным соотношением опухолевой и нормальной ткани в исследуемом образце, субъективной оценкой гистологии опухоли, а также с методом определения мутаций. В частности, отмечается более низкая частота мутаций при секвенировании нового поколения (next generation sequencing, NGS), чем при секвенировании по Сэнгеру [18, 19].
Изучение связи мутаций VHL с этиологией, про-грессированием и прогнозом скПКР привело к накоплению большого количества противоречивых данных. Метаанализ результатов 10 публикаций, включивших 1082 пациента со скПКР, показал, что изменения гена VHL незначительно ассоциированы с клиническими характеристиками заболевания и общей выживаемостью пациентов [22]. Тем не менее изучение мутаций VHL важно, так как для прогресси-рования скПКР и, возможно, для прогноза заболевания определенное значение имеет сочетание мутаций VHL и других генов [23—25]. При этом независимо от нарушений других генов слабая экспрессия белка VHL была ассоциирована с более высокой стадией заболевания (p = 0,023) и меньшей общей выживаемостью пациентов (p = 0,013) [26].
Цель исследования — изучение спектра мутаций гена VHL в образцах спорадического скПКР у российских больных.
Материалы и методы
Клинический материал. В исследование включено 98 образцов первичного скПКР от пациентов, которые находились на лечении в отделении онкоурологии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Больные были отобраны из базы данных молекулярно-эпидемиоло-гического исследования рака почки, проводимого в отделе эпидемиологии и профилактики злокачественных опухолей [27]. Исследование одобрено комитетом по этике при НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Диагноз был установлен на основании клинической картины и гистологической верификации опухолевых образцов в отделении патологической анатомии опухолей человека.
Опухолевую ДНК выделяли из свежезамороженных операционных биоптатов ПКР с использованием протеиназы К и последующей фенол-хлороформной экстракцией. Для всех образцов был определен процент опухолевых клеток в серийных срезах свежезамороженных тканей, в исследование вошли образцы ПКР, которые содержали 60—100 % опухолевых клеток. Для 8 образцов скПКР ДНК была получена из опухолевых клеток, собранных с депарафинизиро-ванных срезов опухолевых биоптатов при использовании протеиназы К.
Анализ мутаций. Анализ мутаций гена VHL проводили секвенированием по Сэнгеру и NGS.
Амплификацию участков кодирующей последовательности VHL в ДНК из свежезамороженных тканей проводили в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к экзонам 1—3, как описано [11]: VHL1F: cta-cgg-agg-tcg-act-cgg-gag; VHL1R: ggg-ctt-cag-acc-gtg-cta-tcg; VHL2F: ccg-tcg-cca-gcc-acc-ggt-gtg; VHL2R: gga-taa-cgt-gcc-tga-cat-cag VHL3_F: cgt-tcc-ttg-tac-tga-gac-cct-ag; VHL3_R: gaa-cca-gtc-ctg-tat-vta-gat-caa-g.
ПЦР-продукты разделяли в 2 % агарозном геле и после электрофореза выделяли из геля для секвени-рования по Сэнгеру с помощью набора Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher, США).
Параллельно было проведено NGS для 62 препаратов ДНК скПКР (54 препарата ДНК из свежезамороженных тканей и 8 препаратов ДНК из парафиновых срезов) с праймерами: NGS_VHL1_F: ggt-cat-ctt-ctg-caa-tcg-cag-t; NGS_VHL1_R: gct-tca-gac-cgt-gct-act-gt; NGSVHL2F: tac-ggt-gct-gga-gga-tcc-tt; NGS_VHL2_R: tac-tct-tcg-acg-cct-gcc-tcc; NGSVHL3F: aca-ttc-agt-tag-tta-aag-caa-tca-caa-gc; NGS_VHL3_R: cgc-tct-ttc-aga-gta-tac-act-gga-ag; NGS_VHL4_F: cca-ccg-gtg-tgg-ctc-tt; NGS_VHL4_R: cta-tcc-tgt-act-tac-cac-aac-aac-ctt-atc; NGS_VHL5_F: ctg-gat-cgc-gga-ggg-aat; NGSVHL5R: tgc-gat-tgc-aga-aga-tga-cct; NGSVHL6F: ccc-tag-tct-gcc-act-gag-gat-t; NGS_VHL6_R: atc-agt-acc-atc-aaa-agc-tga-gat-ga.
Высокопроизводительное полупроводниковое параллельное секвенирование ДНК выполняли на приборе Ion S5 (Thermo Fisher, США). Подготовку библиотек фрагментов ДНК проводили с использованием набора реактивов Ion AmpliSeq Library Kit 2.0.
Поиск данных о выявленных мутациях и их патогенетическом значении осуществляли в базах COSMIC (the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer; http:// cancer.sanger.ac.uk/cosmic) и HGMD (http://www.hgmd. cf.ac.uk).
Результаты и обсуждение
В данной работе не проводили выявление герми-нальных мутаций гена VHL, так как исследовали ДНК только из опухолевых клеток скПКР, но не из нормальных тканей пациентов.
По функциональной значимости все мутации гена VHL можно разделить на 3 группы.
1. Мутации, приводящие к утрате белка VHL или нарушению его функций (LOF, loss of function)
В 1-ю группу вошли различные мутации, приводящие к нарушению функций белка VHL (loss of function, LOF), которые обнаружены в 40 (40,8 %) из 98 образцов скПКР (табл. 1):
1) 6 вариантов нонсенс-мутаций обнаружены в 7 (7,1 %) из 98 образцов скПКР, все описаны в базе COSMIC;
2) делеции/инсерции VHL, вызывающие сдвиг рамки считывания, выявлены в 27 (27,5 %) из 98 образцов скПКР, причем 11 из 27 мутаций являются новыми и отсутствуют в базе COSMIC (данные
Таблица 1. Мутации, приводящие к утрате белка VHL или нарушению его функциональности в образцах спорадического светлоклеточного почечно-клеточного рака
Table 1. Loss of function mutations in the VHL gene in sporadic clear cell renal cell carcinoma samples
№ Эк-зон Exon Мутация мРНК Мутация белка VHL ТИп мутации Mutation type COSMIC Патоген-ность Домен Мишень связывания
Mutation mRNA change VHL protein mutation Pathoge-necity Domen Proteins binding site
1 1 c.159_166 del 8nt p.E53FS* FS* N-концевой N-end
2 1 c.163G>T p.E55X Nonsense COSM249129 Патоген Pathogen ß HIF
3 1 с.164 ins 4nt p.E55FS* FS* ß HIF
4 1 c.166 dupG p.A56FS* FS* COSM3734689 ß HIF
5 1 c.176_180 del 5nt p.P59FS* FS* ß HIF
6 1 c.198_207 del 10nt p.N67FS* FS* ß HIF
7 1 c.217C>T p.Q73X Nonsense COSM17872 0,82 ß HIF
8 1 c.221 delT p.V74FS* FS* COSM4186011 N/a ß HIF
9 1 c.225 delC p.I75FS* FS* ß HIF
10 1 c.236_237 del p.R79FS FS* COSM17719 N/a ß HIF
11 1 c.251 delT p.84VFS* FS* ß HIF
12 1 с.263 delG p.W88FS* FS* COSM26785 N/a ß HIF
13 1 c.263G>A p.W88X Nonsense COSM18070 0,98 ß HIF
14 1 c.310 339 del 30nt p^i0,4! - R113 del In frame Splicing effect ß HIF
15 1 c.315 316 ins 7nt p.T105_, T106FS* FS* ß HIF Kinesin
16 1 c.319 delC p.R107FS* FS* COSM17891 N/a ß HIF Kinesin
,-, , c.320 323 delins титт-о* 17 1 -ça p.R107FS* FS* ß HIF Kinesin
18 1 c.G340C p.G114R Missense Splicing effect COSM18065 0,98 ß HIF Kinesin
19 2 c.341 11 del 37nt ^IV* del - 37nt Splicing effect ß HIF Kinesin
20, 21 2 c.341-1G>T p.G114C Splicing effect COSM17642 0,98 ß HIF Kinesin
22 2 с.369 delG p.T124FS* FS* COSM17895 N/a ß Kinesin
23 2 с.408 delT p.F136FS* FS* COSM18059 N/a ß PKC
24 2 c.419_420 del p.L140FS* FS* COSM17930 N/a ß PKC
25 2 c.431 delG p.G144FS* FS* COSM14412 N/a ß PKC
26 2 c.439 delA p.I147FS* FS* COSM17976 N/a ß PKC
27 2 c.444 delT p.F148FS* FS* COSM14410 N/a ß PKC
28 2 c.463G>A p.V155M Missense Splicing effect COSM18152 0,87 ß PKC
29 3 c.475A>T p.K159X Nonsense COSM422840 0,93 а Elongin C
cv a cv
CS
и ш u
ж ш
и
CV а CV
со
us
Окончание табл. 1 End of table 1
№ Эк-зон Мутация мРНК Mutation mRNA change Мутация белка VHL VHL protein ТИп мутации COSMIC Патоген-ность Pathoge-necity Домен Domen Мишень связывания
Mutation type Proteins
EXon mutation binding site
30, 31 3 c.481C>T p.R161X Nonsense COSM17612 0,87 а Elongin C
32 3 c.483_490 del8 p.C161FS* FS* а Elongin C
33 3 c.493 delG p.V165FS* FS* COSM14332 0,93 а Elongin C
34 3 c.500_501 ins GA p.S168FS* FS* а Elongin C
35 3 c.525C>A p.Y175X Nonsense COSM17789 0,71 а Elongin C
36 3 c.532 delC p.L178FS* FS* COSM18265 N/a а Elongin C
37 3 c.548_549 del 2nt p.L184FS* FS* а Elongin C
38 3 c.562 delC p.L188FS* FS* COSM14337 N/a а Elongin C
39 3 c.576_586 del 11nt p.P192FS* FS* а Elongin C
40 3 c.607_608 del CA p.Q203FS* FS* COSM3358443 N/a С-концевой С-end
И
ш u
Примечание. Здесь и в табл. 2: мРНК — матричная РНК; FS* — мутация со сдвигом рамки считывания; n/a — нет данных; kinesin — кинезин; elongin — элонгин.
Note. Here and in the table 2: mRNA — messenger RNA; FS* — frameshift mutation; n/a — data non-available.
X ш
и
на июль 2020 г.). Делеции обнаружены в 22 случаях скПКР, инсерции - в 4, мутация p.R107 FS* (с.320_323 delins CA) - в 1;
3) мутации, затрагивающие сайты сплайсинга, разнообразны и выявлены в 6 (6,1 %) образцах скПКР:
♦ в 2 образцах скПКР выявлены ранее не описанные делеции, затрагивающие сайты сплайсинга мРНК VHL:
— с.341_11 del 37nt начинается в интроне 1 и включает 26 кодонов экзона 2,
— с.310_339 del 30nt, p.104_113 del захватывает донорный сайт сплайсинга экзона 1;
♦ в 2 образцах скПКР выявлены миссенс-мутации, затрагивающие сайты сплайсинга матричной РНК (мРНК) VHL. Это патогенные миссенс-мутации в акцепторном сайте сплайсинга экзона 2: с.340 G>C, p.G114R, C0SM18065 (Pathogenic score 0,98) и в донорном сайте сплайсинга экзона 2: a463G>A, p.V155M, COSM18152 (Pathogenic score 0,97);
♦ в 2 образцах скПКР выявлена мутация в интроне в сайте сплайсинга: c.341-1G>T, COSM17642 (Pathogenic score 0,98).
2. Мутации, не нарушающие рамку считывания VHL
Во 2-ю группу включены делеции / инсерции, не нарушающие рамку считывания VHL, и миссенс-мутации.
Выявлены 4 ранее не описанные делеции VHL без сдвига рамки считывания:
♦ 2 мутации в экзоне 1 VHL кодируют сайт взаимодействия белка VHL с HIF: p.V74_V83 del (c.220_249 del); p.C77_N78 del (c.228_233 del);
♦ 2 мутации в экзоне 2 VHL кодируют сайты взаимодействия белка VHL с PKC: p.G123 del (с.367_369 del); p.P146_A149 del (c.437_445 del). Миссенс-мутации гена VHL встречаются в 28—
35 % случаев скПКР, причем до 40 % этих мутаций существенно влияют на функции белка VHL [18, 20].
В нашей работе при анализе 98 образцов скПКР обнаружено 30 вариантов миссенс-мутаций в 35 (35,7 %) случаях, включая 2 вышеописанные мутации p.G114R и p.V155M в сайтах сплайсинга (табл. 2). Все выявленные мутации описаны в базе COSMIC, большинство высокопатогенны (0,85—0,99). Исключение составляет мутация в начале экзона 1 в N-концевом домене VHL: c.116G>A, p.G39D (COSM14345; Neutral, Pathogenic score 0,39).
Особый интерес представляет локализация мутаций в белке VHL, поскольку это определяет их роль в связывании белков, взаимодействующих с VHL. При анализе локализации мутаций в белке VHL в образцах скПКР подтверждено, что большинство миссенс-му-таций нарушают сайты взаимодействия VHL с HIF, PKC или кинезином (см. табл. 2). В 20 (57 %) из 35 образцов скПКР миссенс-мутации локализованы в р-домене
в сайте взаимодействия с HIF, в 10 (29 %) — в сайте взаимодействия с PKC. В 4 образцах скПКР миссенс-мутации затрагивают а-домен, сайт взаимодействия с элонгином С.
Встречаются различные замены в одной позиции: p.S65, p.N78, p.P86, p.H115 и p.I151. Некоторые мутации выявлены в 2—3 опухолях: p.S65L, p.L89P, p.L118P (см. табл. 2), что соответствует данным литературы. Кодоны p.S65, p.N78, p.W117 и p.L184 описаны как «горячие точки», а миссенс-мутации p.W117 и p.L184 дестабилизируют VHL [20]. Выявленные нами мутации p.S65, p.N78, p.P86, p.W117, p.L118, p.L158 совпадают с «горячими точками», описанными ранее [28].
В 4 образцах скПКР выявлено по 2 мутации VHL, наблюдалось сочетание миссенс-мутации в экзоне 1 и миссенс-мутации в экзоне 2 или делеции со сдвигом рамки считывания в экзоне 3 (табл. 3). Присутствие двух мутаций VHL в одном образце скПКР наблюдали и ранее [16, 20]. Возможно, наличие нескольких мутаций VHL в жПКР связано с поликлональностью опухолей почки [28, 29], поскольку ДНК в каждом случае была получена из достаточно крупного фрагмента свежезамороженной опухолевой ткани.
3. Мутации, не влияющие на функции белка VHL
В 3-ю группу выделены мутации, влияние которых на функции белка VHL неочевидно или требует изучения. К ним относятся мутации, локализованные в 5'UTR (с.73С>Т), и упомянутая выше миссенс-му-тация в N-концевом домене VHL: c.116G>A, p.G39D (COSM14345; Neutral, Ра^ет: score 0,39).
В VHL обнаружено также достаточно много сайлент-мутаций и полиморфизмов, изучение которых не входило в задачу данной работы. Однако наше внимание привлекла сайлент-мутация вблизи сайта сплайсинга экзона 2 - c.462A>T, p.P154P (COSM144976, Pathogenic score 0,87), патогенность которой вызывает сомнение. Мы выявили эту мутацию в 3 образцах скПКР, причем в двух опухолях помимо нее обнаружены мутации в экзоне 1 (p.W88 FS*) или экзоне 2 (p.V130I), а в 3-й - в интроне 3 (a463+9G>T). По кон-сенсусной последовательности донорного сайта сплайсинга тимин (урацил в РНК) в положении «-2» не должен нарушить сплайсинг. Выявление других патогенных вариантов VHL в тех же образцах также свидетельствует в пользу непатогенности p.P154P.
В 25 образцах скПКР не выявлено нон-сайлент-мутаций в кодирующей части VHL. С помощью ПЦР со специфичными праймерами проанализированы последовательности интронов, граничащие с сайтами сплайсинга. В результате в 2 образцах скПКР выявлена мутация в интроне 1, влияющая на сплайсинг (с.341-Ю>Т), которая была учтена ранее в 1-й группе мутаций. Выявлены также мутации в интронах гена VHL вблизи экзонов: a341-20G>T (интрон 1), c.463+9G>T (интрон 2), c.464-3C>T (интрон 2). Данных о патогенности этих мутаций нет, и они скорее всего
непатогенны, исходя из консенсуса акцепторного сайта сплайсинга человека. В пользу этого свидетельствует и то, что замены в интронах наблюдались иногда в тех же образцах скПКР, где отмечены мутации в эк-зонах. Помимо точечных замен в интронах обнаружены делеции (например, делеции del 5033G в интроне 1 в 2 образцах скПКР и др.).
Таким образом, всего выявлено 77 нон-сайлент-мутаций гена VHL в 73 (74,4 %) из 98 образцов скПКР, из которых 76 влияют на функциональность белка. При этом мутации в экзоне 1 выявлены в 36 (36,6 %) случаях скПКР, в экзоне 2 — в 26 (26,5 %), в экзоне 3 — в 15 (15,3 %).
Считается, что для скПКР характерны мутации, которые связаны с дестабилизацией VHL [6, 20, 28]. Мутации консервативных остатков глицина G93 или пролина могут разрушить и дестабилизировать VHL. Мутация N78 разрушает водородные связи, которые стабилизируют участок VHL, связывающий 2 петли, важные для взаимодействия с HIF и элонгином С. В то же время выявлено 3 разных мутации в позиции p.H115N/Y/P, которая непосредственно взаимодействует с HIFa — гидроксипролинсвязывающим сайтом. Эти мутации нарушают способность белка VHL связывать HIFa для последующей убиквитинизации, при этом дестабилизации структуры белкового комплекса VHL c элонгином С и элонгином В (VCB) не происходит [6].
В настоящей работе выявлено 15 образцов скПКР с мутациями в a-домене белка VHL в участке взаимодействия с элонгином С, причем 4 из них — миссенс, приводящие к аминокислотным заменам в сайте сплайсинга мРНК VHL: p.L158R, p.L169P, p.Y175D и p.V155M.
Несмотря на то что мы не исследовали нормальную ткань почки, обнаруженные мутации p.S65L, p.G114R, p.L118P, p.V130I, p.I151T и p.L169P описаны как терминальные и могут встречаться при семейном ПКР [6].
Мутация в позиции p.L169P интересна тем, что находится между 2 сайтами фосфорилирования белка VHL по серину S168 и тирозину Y175, связанными с NEKI-киназой, которая фосфорилирует VHL по этим сайтам, способствуя его протеосомной деградации и цилиарной дестабилизации. Аминокислотная замена p.L169P может индуцировать накопление фос-форилированных CDK1 или родственных CDK- или MAP-киназ. Инактивация VHL связана с повышением уровней CDK1 и CDK2 и стабилизацией транскрипционных факторов HIF, которые являются мишенями VHL [30].
Заключение
Спектр мутаций VHL в скПКР достаточно разнообразен и представлен большим числом генетических нарушений. Всего выявлено 77 нон-сайлент-мутаций в кодирующей части гена VHL в 73 (74,4 %) из 98 образцов скПКР. Мутации, приводящие к утрате функций
CV a CV
ев
и ш u
ж ш
и
CV а CV
со
us
Таблица 2. Миссенс-мутации белка VHL в образцах светлоклеточного почечно-клеточногорака Table 2. VHL missense mutations in sporadic clear cell renal cell carcinoma samples
№ Эк-зон Exon Мутация Изменения в белке COSMIC Патоген- ность Pathogenecity Домен Мишень î4>ci > 1.11> *» un а
Mutation HGMD Domen
Aminoacid change Proteins binding site
1 c.116G>A p.G39D COSM14345 0,39 N-концевой N-end
2 c.193T>A p.S65T COSM97135 0,99 ß HIF
3 c.193T>C p.S65P COSM18074 0,99 ß HIF
4-6 c.194C>T p.S65L COSM14400 CM941364 germline mutation 0,98 ß HIF
7 c.233A>C p.N78T COSM14319 0,98 ß HIF
8 c.234T>G p.N78K COSM17875 0,85 ß HIF
9 c.254T>C p.L85P COSM17859 0,89 ß HIF
10 c.257C>T p.P86L COSM18028 0,97 ß HIF
11 c.257C>G p.P86R COSM30234 0,97 ß HIF
12-14 c.266T>C p.L89P COSM14346 0,97 ß HIF
15 c.278G>A p.G93D COSM97143 0,99 ß HIF
16 c.280G>A p.E94K COSM3734682 0,93 ß HIF
17 c.313A>C p.T105P COSM18064 0,95 ß HIF
18 c.340G>C p.G114R COSM18065 CM951284 germline mutation 0,98 ß HIF Kinesin
19 2 c.343C>A p.H115N COSM17752 0,98 ß HIF Kinesin
20 2 c.343C>T p.H115Y COSM14375 0,98 ß HIF Kinesin
21 2 c.344A>C p.H115P COSM17962 0,98 ß HIF Kinesin
22 2 c.351T>G p.W117G COSM 30297 0,97 ß PKC Kinesin
23, 24 2 c.353T>C p.L118P COSM14312 CM941373 germline mutation 0,98 ß PKC Kinesin
25 2 c.388G>A p.V130I COSM1757303 0,98 ß PKC
26 2 c.391A>T p.N131Y COSM17758 0,98 ß PKC
27 2 c.393C>A p.N131K COSM1731999 0,95 ß PKC
28 2 c.403T>A p.L135I COSM33993 0,98 ß PKC
29 2 c.451A>T p.I151F COSM17978 0,99 ß PKC
30 2 c.452T>C p.I151T COSM17934 0,97 ß PKC
31 2 c.461C>T p.P154L COSM18266 0,96 ß PKC
32 3 c.463G>A p.V155M COSM18152 0,87 a Elongin C
33 3 c.473T>G p.L158R COSM30286 0,89 a Elongin C
34 3 c.506 T>C p.L169P COSM17837 CM003060 germline mutation 0,90 a Elongin C
35 3 c.523T>G p.Y175D COSM17917 0,90 a Elongin C
И Ш
u
X ш
и
Таблица 3. Образцы светлоклеточного почечно-клеточногорака с 2мутациями VHL Тable 3. Cases of clear cell renal cell carcinoma with two VHL mutations
Окончание табл. 2 End of table 2
№ Мутация 1 мРНК Изменения СOSMIC Мутация 2 мРНК Изменения в белке COSMIC
Mutation 1 в белке Mutation 2
Âminoacid change
mRNA change Âminoacid change mRNA change
1 Ex1 c.313A>C p.T105P COSM18064 Ex3 c.492 delG p.V165FS* COSM14332
2 Ex1 c.266T>C p.L89P COSM14346 Ex3 c.532 delC p.L178FS* COSM18265
3 Ex1 c.233A>C p.N78T COSM14319 Ex3 c.483_490 del 8nt p.R161FS*
4 Ex1 c.194C>T p.S65L C0SM14400 Ex2 с. 404T>A p.L135I COSM33993
Примечание. мРНК — матричная РНК. Note. mRNA — messenger RNA.
cv a cv
CS
белка VHL, обнаружены в 40 (40,8 %), а миссенс-му-тации — в 35 (35,7 %) образцах скПКР. Особое внимание привлекают ранее не описанные мутации — делеции / инсерции со сдвигом и без сдвига рамки считывания в 15 образцах скПКР. Анализ мутаций VHL в образцах скПКР показал, что большинство мис-сенс-мутаций нарушают сайты взаимодействия белка
VHL с HIF, РКС или кинезином. В дальнейшем предполагается использовать полученные результаты для сравнения показателей выживаемости пациентов с различными мутациями и «диким» типом VHL, а также для изучения распространенности мутаций в скПКР в зависимости от эпидемиологических и клинических характеристик опухолевого процесса.
и ш u
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Znaor A., Lortet-Tieulent J., Laversan-ne M. et al. International variations and trends in renal cell carcinoma incidence and mortality. Eur Urol 2015;67(3):519—30.
DOI: 10.1016/j.eururo.2014.10.002.
2. Заридзе Д.Г. Рак почки: клинические и экспериментальные исследования. Молекулярная эпидемиология рака почки. М.: РАН, 2019. C. 67—92. [Zaridze D.G. Kidney cancer: clinical and experimental research. Molecular epidemiology of kidney cancer. Moscow: RAN, 2019. Pp. 67—92. (In Russ.)].
3. Заридзе Д.Г., Мукерия А.Ф., Шаньги-на О.В., Матвеев В.Б. Молекулярная эпидемиология рака почки. Онкоурология 2018;14(3):107—19. [Zaridze D.G., Mukeriya A.F., Shan'gina O.V., Matveev V.B. Molecular epidemiology of renal cancer. Onkourologiya = Cancer Urology 2018;14(3):107—19.
(In Russ.)]. DOI: 10.17650/1726-97762018-14-3-107-119.
4. Banks R.E., Tirukonda P., Taylor C. et al. Genetic and epigenetic analysis of von Hippel—Lindau (VHL) gene alterations and relationship with clinical variables in sporadic renal cancer. Cancer Res 2006;66(4):2000—11.
DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-05-3074.
5. Nordstrom-O'Brien M., van der Luijt R.B., van Rooijen E. et al. Genetic analysis
of von Hippel—Lindau disease. Hum
Mutat 2010;31(5):521-37. DOI: 10.1002/humu.21219.
6. Gossage L., Pires D.E., Olivera-Nappa Â. et al. An integrated computational approach can classify VHL missense mutations according to risk of clear cell renal carcinoma. Hum Mol Genet 2014;23(22):5976-88.
DOI: 10.1093/hmg/ddu321.
7. Nickerson M.L., Jaeger E., Shi Y. et al. Improved identification of von Hippel-Lindau gene alterations in clear cell renal tumors. Clin Cancer Res 2008;14(15):4726-34.
DOI: 10.1158/1078-0432.
8. Cowey C.L., Rathmell W.K. VHL gene mutations in renal cell carcinoma:
role as a biomarker of disease outcome and drug efficacy. Curr Oncol Rep 2009;11(2):94—101. DOI: 10.1007/s11912-009-0015-5.
9. Mehdi A., Riazalhosseini Y. Epigenome Aberrations: Emerging driving factors of the clear cell renal cell carcinoma. Int J Mol Sci 2017;18(8):1774.
DOI: 10.3390/ijms18081774.
10. Wang J., Xi Z., Xi J. et al. Somatic mutations in renal cell carcinomas from Chinese patients revealed
by whole exome sequencing. Cancer Cell Int 2018;18:159. DOI: 10.1186/s12935-018-0661-5.
11. Moore L.E., Nickerson M.L., Brennan P. et al. Von Hippel-Lindau (VHL)
inactivation in sporadic clear cell renal
cancer: associations with germline VHL
polymorphisms and etiologic
risk factors. PLoS Genet
2011;7(10):e1002312.
DOI: 10.1371/journal.pgen.1002312.
12. Iwai K., Yamanaka K., Kamura T. et al. Identification of the von Hippel—Lindau tumor-suppressor protein as part
of an active E3 ubiquitin ligase complex. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(22):12436—41. DOI: 10.1073/pnas.96.22.12436.
13. Shen C., Kaelin W.G. The VHL/HIF axis in clear cell renal carcinoma.
Semin Cancer Biol 2013;23(1):18-25. DOI: 10.1016/j.semcancer.2012.06.001.
14. Lolkema M.P., Gervais M.L., Snijckers C.M. et al. Tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein requires phosphorylation of the acidic domain.
J Biol Chem 2005;280:22205-11. DOI: 10.1074/jbc.M503220200.
15. Frew I.J., Moch H.A. Clearer view
of the molecular complexity of clear cell renal cell carcinoma. Annu Rev Pathol 2015;10:263-89. DOI: 10.1146/annurev-pathol-012414-040306.
16. Young A.C., Craven R.A., Cohen D. et al. Analysis of VHL gene alterations and their relationship to clinical parameters in sporadic conventional renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 2009;15(24):7582-92. DOI: 10.1158/1078-0432.
X ш
и
CV а CV
со
us
и ш u
17. Taylor C., Craven R.A., Hamden P. et al. Determination of the consequences
of VHL mutations on VHL transcripts in renal cell carcinoma. Int J Oncol 2012;41(4):1229-40. DOI: 10.3892/ijo.2012.1561.
18. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma. Nature 2013;499(7456):43-9.
DOI: 10.1038/nature12222.
19. Scelo G., Riazalhosseini Y., Greger L. et al. Variation in genomic landscape of clear cell renal cell carcinoma across Europe. Nat Commun 2014;5:5135. DOI: 10.1038/ncomms6135.
20. Razafinjatovo C., Bihr S., Mischo A. et al. Characterization of VHL missense mutations in sporadic clear cell renal cell carcinoma: hotspots, affected binding domains, functional impact on pVHL and therapeutic relevance. BMC Cancer 2016; 16:638. DOI: 10.1186/s12885& 016&2688&0.
21. Mikhailenko D.S., Zhinzhilo T.A., Kolpakov A.V. et al. Specific lcalization of missense mutations in the VHL gene
in clear cell renal cell carcinoma. Bull Exp Biol Med 2017;163(4):465-8. DOI: 10.1007/s10517-017-3829-4.
22. Kim H.S., Kim J.H., Jang H.J. et al.
Clinicopathologic significance of VHL gene alteration in clear-cell renal cell carcinoma: An Updated Meta-Analysis and Review. Int J Mol Sci 2018;19(9): E2529. DOI: 10.3390/ijms19092529.
23. Casuscellia J., Vanob Y.A., Fridmanc W.H., Hsieh J.J. Molecular classification of renal cell carcinoma and its implication in future clinical practice. Kidney Cancer 2017;1(1): 3-13. DOI: 10.3233/KCA-170008.
24. Poehlman W.L., Hsieh J.J., Feltus F.A. Linking binary gene relationships to drivers of renal cell carcinoma reveals convergent function in alternate tumor progression paths. Sci Rep 2019;9(1):2899.
DOI: 10.1038/s41598-019-39875-y.
25. Huang Y.,Wang J., Jia P. et al. Clonal architectures predict clinical outcome in clear cell renal cell carcinoma. Nat Commun 2019;10(1):1245.
DOI: 10.1038/s41467-019-09241-7.
26. Högner A., Krause H., Jandrig B. et al. PBRM1 and VHL expression correlate in human clear cell renal cell carcinoma with differential association with patient's overall survival. Urol Oncol 2018;36(3):94.e1-14.
DOI: 10.1016/j.urolonc.2017.10.027.
27. Заридзе Д.Г., Мазуренко Н.Н., Бежанова С.Д. и др. Прогностическая роль экспрессии маркера PBRM1 при светлоклеточном раке почки. Онкоурология 2019;15(1):23—31. [Zaridze D.G., Mazurenko N.N., Bezhanova S.D. et al. Prognostic role
of PBRM1 marker expression in clear-cell renal-cell carcinoma. Onkourologiya = Cancer Urology 2019;15(1):23—31. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/1726-97762019-15-1-23-31.
28. Minervini G., Quaglia F., Tabaro F., Tosatto S.C.E. Insights into the molecular features of the von Hippel-Lindau-like protein. Amino Acids 2019;51(10-12):1461-74.
DOI: 10.1007/s00726-019-02781-8.
29. Gerlinger M., Rowan A.J., Horswell S. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883-92. DOI: 10.1056/NEJMoa1113205.
30. Krassowski M., Paczkowska M., Cullion K. et al. Active Driver DB: human disease mutations and genome variation in post-translational modification sites of proteins. Nucleic Acids Res 2018;46(D1):D901-10. DOI: 10.1093/nar/gkx973.
X ш
и
Вклад авторов
H.Н. Мазуренко: анализ полученных данных, обзор публикаций, написание текста и редактирование статьи; И.В. Цыганова: проведение генетических исследований;
В.В. Стрельников: анализ результатов NGS, редактирование статьи;
A.В. Балбуцкий: проведение генетического анализа; Т.Ф. Маливанова: проведение генетического анализа; Е.Б. Кузнецова: проведение NGS-исследования;
B.А. Драудин-Крыленко: создание клинико-эпидемиологической базы данных; О.В. Шаньгина: создание клинико-эпидемиологической базы данных;
A.Ф. Мукерия: создание клинико-эпидемиологической базы данных;
B.Б. Матвеев: организация и предоставление клинического материала;
Д.Г. Заридзе: разработка дизайна исследования, создание клинико-эпидемиологической базы данных, редактирование статьи. Authors' contributions
N.N. Mazurenko: analysis of the obtained data, reviewing of publications, article writing, article editing;
I.V. Tsyganova: genetic research;
V.V. Strelnikov: analysis of NGS results, article editing; A.V. Balbutsky: genetic analysis; T.F. Malivanova: genetic analysis; E.B. Kuznetsova: NGS analysis;
V.A. Draudin-Krilenko: creation of a clinical and epidemiological database; O.V. Shangina: creation of a clinical and epidemiological database; A.F. Mukeria: creation of a clinical and epidemiological database; V.B. Matveev: organization and provision of clinical material;
D.G. Zaridze: study design development, creation of a clinical and epidemiological database, article editing.
ORCID авторов / ORCID of authors
Н.Н. Мазуренко / N.N. Mazurenko: https://orcid.org/0000-0003-4767-6983 В.В. Стрельников / V.V. Strelnikov: https://orcid.org/0000-0001-9283-902X
A.В. Балбуцкий / A.V.Balbutsky: https://orcid.org/0000-0001-6809-3221 Т.Ф. Маливанова / T.F. Malivanova: https://orcid.org/0000-0001-9699-2603 Е.Б. Кузнецова / E.B. Kuznetsova: https://orcid.org/0000-0002-7857-6320
B.А. Драудин-Крыленко / V.A. Draudin-Krilenko: https://orcid.org/0000-0003-2205-8345 О.В. Шаньгина / O.V. Shangina: https://orcid.org/0000-0003-2431-068X
A.Ф. Мукерия / A.F. Mukeria: https://orcid.org/0000-0002-6847-9295
B.Б. Матвеев / V.B. Matveev: https://orcid.org/0000-0001-7748-9527 Д.Г. Заридзе / D.G. Zaridze: https://orcid.org/0000-0002-2824-3704
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. в
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. ^
cv
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. .
Financing. The study was performed without external funding. eo
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики
Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии О
им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. О
Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. ££
Compliance with patient rights and principles of bioethics О The study protocol was approved by the biomedical ethics committee N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health ОС
of Russia. ^ All patients gave written informed consent to participate in the study.
И
ш u
x ш
и
Статья поступила: 29.06.2020. Принята к публикации: 20.10.2020. Article submitted: 29.06.2020. Accepted for publication: 20.10.2020.
