CC BY
73
УДК 608.1
Создание штамма дрожжей для нового пивного бренда «Балтика «Кулер»
С. Г. Давыденко, канд. биол. наук;
Д. В. Афонин; Б. Э. Баташов; А. Т. Дедегкаев, канд. техн. наук ОАО «Пивоваренная компания «Балтика»
Ключевые слова: дрожжи; штамм; пивоваренное производство; сероводород; диацетил; коллоидная стабильность.
Keywords: yeast; strain; brewing manufacture; hydrogen sulfide; diacetil; colloidal stability.
Пиво — древнейший натуральный напиток, вобравший в себя силу прорастающих зерен и жизненную энергию дрожжей. Уникальность производства пива обусловлена использованием cуществующего в природе процесса сбраживания дрожжами сахаров пивного сусла с образованием спирта и углекислого газа.
Однако все не так просто. Огромное количество веществ, входящих в состав прорастающего зерна, трансформируется под действием сложных биохимических реакций метаболизма дрожжей в еще большее число сложных органических и неорганических веществ, формируя вкус и аромат пива.
Дрожжи — основной активный компонент пива. Полное секвени-рование генома дрожжей выявило примерно 6000 генов, участвующих в метаболизме этого на первый взгляд примитивного микроорганизма. Теоретически возможное количество взаимодействий продуктов этих генов значительно больше.
Каковы же основные требования к микроорганизму, готовящему для нас пиво? Во-первых, пиво должно быть вкусным. Следовательно, в результате брожения в конечном продукте вещества, определяющие неприятный вкус или аромат пива, не должны превышать порога ощущения потребителем. Известно более 800 веществ, влияющих на вкус и аромат пива. Это прежде всего сероводород, жирные и сероорганические кислоты, высшие спирты, альдегиды, эфиры.
Во-вторых, кроме обычных требований — эффективной утилизации
основного сахара пивного сусла — мальтозы, хорошей флокулирую-щей способности и т. д. — дрожжи должны удовлетворять требованиям современных технологий. Так, в последнее время широко применяется технология высокоплотного пивоварения, позволяющая повысить экономическую эффективность предприятия за счет снижения энергозатрат и более интенсивного использования имеющегося оборудование и вспомогательных материалов. При применении этой современной технологии сусло с высокой экстрактивностью разбавляется стерильной деаэрированной водой до запланированного содержания сухих веществ до или после брожения. Однако при сбраживании плотного сусла дрожжи испытывают осмотический стресс, в результате чего изменяется их активность (активируется глицеро-3-фосфатдегидрогеназа, осуществляющая синтез глицерина для преодоления внешнего гиперосмотического давления на клеточную стенку дрожжей), одновременно синтезируется пируват, способный трансформироваться во многие побочные продукты брожения (высшие спирты и эфиры), отрицательно влияющие на вкус и аромат пива. При высокоплотном пивоварении образуется повышенное содержание этанола, что приводит к увеличению числа мертвых клеток и к ранней флокуляции дрожжей.
В-третьих, пиво — это не только многокомпонентный, но и меняющийся во времени напиток. В связи с использованием новых технологий фильтрации пива появилась возможность существенно увеличить сроки
хранения этого продукта. Стабильность пива — способность сохранять свои органолептические показатели в течение определенного времени. Обеспечить вкусовую стабильность пива можно, лишь повысив его биологическую и коллоидную стойкость. Несоблюдение высокого уровня санитарного состояния производства приводит к появлению посторонних микроорганизмов в пиве, что негативно сказывается на его качестве. Как уже отмечалось выше, пиво представляет собой сложную коллоидную систему, которая находится в определенном равновесии, при нарушении которого в пиве появляется помутнение или взвеси. Нарушение коллоидного равновесия возникает в результате различных реакций (окисление, полимеризация, взаимодействие компонентов пива друг с другом и т. д.).
Люди неосознанно использовали дрожжи для приготовления пищи и напитков со времен неолита. Роль дрожжей в определении вкусоаро-матических свойств напитков стала очевидной лишь в XIX в. В 1861 г. Луи Пастер доказал роль дрожжей в превращении сахаров в этанол и углекислый газ. В 1883 г. первая чистая культура пивных дрожжей была получена Эмилем Христианом Хансеном для пивоварни Карлсберг. В 1890 г. Мюллер-Тургау выделил первую чистую культуру дрожжей для виноделия.
Для улучшения свойств дрожжей, применяемых в пивоварении и виноделии, ученые широко использовали методы классической генетики (мутагенез, гибридизация, цитодукция и т. д.). Современные методы генетики и молекулярной биологии позволяют направленно изменять гены с помощью методов генной инженерии и получать организмы с заранее заданными свойствами. Получены дрожжи, практически не продуцирующие диацетил, диметилсульфит, сероводород и другие вещества, обусловливающие дефекты пива.
Известно множество штаммов пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, применяемых в пивоварении. Во многих странах существуют крупные коллекции пивоваренных дрожжей. Наиболее известный National Collection of Yeast Culturies (NCYC), VTT Biotechnology, Hefebank Weighnstephan, Cara Technology, ВКПМ.
3 • 2011
ПИВО и НАПИТКИ
В пивоваренной промышленности широко используется штамм 34 / 70 из коллекции Hefebank Weighnstephan. Он обладает способностью эффективно утилизировать моно-, ди- и трисахариды пивного сусла с образованием этилового спирта. Штамм обладает высокой способностью к редукции диацетила и пентандиона и хорошими флоку-лирующими свойствами. Недостаток этого штамма — высокое содержание серных и сероорганических соединений в пиве, полученном с использованием этого штамма. Изменением технологических режимов не удается эффективно понизить уровень синтеза серных соединений и улучшить органолептические свойства конечного продукта.
На российских предприятиях для холодного (5...10 ° С) брожения чаще всего используют расы дрожжей 11, 8аМ, 44, 41 и 776. Другие расы применяются, но гораздо реже. Раса 776 была селекционирована в Институте брожения в Берлине, остальные расы были получены из 776 в России. Для технологии теплого (7.15 °С) брожения используют расы Rh, 34, 34/70, 145, 129, 308 [1, 2, 3].
Цель нашей работы — создание штамма для инноваций в пивоварении, поскольку эта область пищевой промышленности в последнее время активно развивается, создавая новые алкогольные и безалкогольные продукты, что выдвигает новые требования к ключевому участнику этого сложного процесса — пивоваренным дрожжам.
В начале работы для отбора наиболее перспективных штаммов нами были использованы 11 штаммов дрожжей S. cerevisiae из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика (ВКПМ) (http://www.genetika.ru/ vkpm) и 93 штамма из коллекции Отдела молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Константинова (ОМРБ ПИЯФ РАН).
Сравнительное изучение бродильной активности этих 104 штаммов проводили при температуре 14 °С в лабораторных условиях в конических колбах с водяными затворами, ограничивающими поступление кислорода и обеспечивающими выведение газов брожения в отдельную колбу с водой. Использовали стерильное стандартное пивное сусло производ-
ства ОАО «Пивоваренная компания «Балтика» плотностью 12°. Начальная концентрация дрожжей в колбе составляла 10 млн клеток в 1 мл. По окончании процесса брожения проводили фильтрацию сброженного сусла через двойной бумажный фильтр и слой кизельгура на двойном слое фильтровальной бумаги для освобождения от дрожжевых клеток. Измерение реальной степени сбраживания (% RDF), объемный процент образовавшегося этанола (% alc V/V) проводили, используя алколайзер фирмы Anton Paar. Ор-ганолептически оценивали запах и вкус сброженного сусла.
Проводили отбор штаммов, способных наиболее эффективно сбраживать пивное сусло и не имеющих органо-лептических недостатков (запах серо-органических соединений, диацетила, фенольный запах и т. д.).
Наиболее перспективные штаммы изучали, моделируя производственные условия на мини-пивзаводе Berplan Harter GMBH в цилиндро-конических танках (ЦКТ) с объемом 120 л 12° пивного сусла при температуре 14 °С. Партию сусла готовили на мини-пивзаводе, равными объемами заполняли два одинаковых цилиндроконических танка (ЦКТ). В контрольный ЦКТ вносили культуру производственного пивоваренного штамма, в другой ЦКТ одновременно инокулировали культуру, полученную в лабораторных условиях. Стартовые культуры контрольного и экспериментального штамма готовили одновременно по единой схеме на одинаковом пивном сусле. Отбор проб для анализа контрольного и экспериментального танков проводили одновременно (рис. 1).
Большинство из проверенных штаммов обладали рядом органо-лептических дефектов: придавали
Лабораторные тесты 104 штамма к
Мини-пивзавод 10 штаммов 1
Производство 1 J
Рис. 1. Схема селекции нового штамма
сброженному суслу фенольный или серный запах. Однако нам удалось подобрать штаммы, не образующие заметного количества фенольных соединений. Далее стояла задача — скрестить эти штаммы и получить потомство. Осуществить скрещивание удалось только в результате применения селективной системы отбора редких гибридных клонов на минимальной среде со спиртом, где оба родителя расти не могли. Один из получившихся клонов использовали в дальнейшей работе. Фенотипические характеристики клона подтверждали его гибридное происхождение. Клон наследовал признак устойчивости к повышенной температуре и к высокому содержанию ионов меди в среде. Кроме того, при микроскопировании клетки клона были заметно крупнее клеток родительских штаммов. Видимо, получившийся в результате незаконного скрещивания штамм имеет, по меньшей мере, тройной набор хромосом. При сравнении кариоти-па нового штамма с кариотипами его родителей можно сделать вывод о гибридном происхождении этого штамма, так как он имеет полиморфные хромосомы обоих родителей.
Производственные испытания нового штамма оказались успешными. На рис. 2 представлен график падения видимого экстракта при ферментации с использованием известного и широко используемого в мире штамма 34/70 и полученного нами нового штамма К при трех температурах: 14; 17 и 20° С. Видно, что новый штамм быстрее утилизирут экстракт сусла при повышенных температурах: 17 и 20° С. Это свойство можно использовать для снижения энергозатрат на охлаждение сусла в ЦКТ.
Эффективность основной и вторичной (созревание пива в ЦКТ, редукция диацетила) ферментации напрямую зависит от физиологического состояния дрожжей и их способности к флокуляции (осаждению) в конце ферментации при появлении высоких концентраций этанола. Широко применяемые современные технологии высокоплотного пивоварения предъявляют новые требования к поведению дрожжей во время ферментации. На рис. 3 представлены концентрации клеток дрожжей 34/70 и К в ЦКТ во время ферментации. Видно, что дрожжи К находятся в ЦКТ в большем количестве, что говорит об их пониженной способности к осаждению.
50 100 150 200
Продолжительность брожения, ч
Штамм 34/70 (14 °С) — Штамм 34/70 (17 °С) — Штамм 34/70 (20 °С)
50 100 150 200
Продолжительность брожения, ч
Штамм 34/70 (14 °С) — Штамм 34/70 (17 °С) — Штамм 34/70 (20 °С)
А А
50 100 150 200
Продолжительность брожения, ч
— Штамм K (14 °С) — Штамм K (17 °С) — Штамм K (20 °С)
100 150 200
Продолжительность брожения, ч
Штамм K (14 °С) — Штамм K (17 °С) — Штамм K (20 °С)
Рис. 2. Падение видимого экстракта во время
ферментации: а — штамм 34/70; б — штамм К
Рис. 3. Концентрация клеток дрожжей в ЦКТ во время ферментации: а — штамм 34/70; б — штамм К
0
250
0
250
а
а
0
250
0
50
250
б
б
Это свойство может быть успешно использовано при применении современных технологий высокоплотного пивоварения, чтобы предотвратить раннюю флокуляцию дрожжей при высокой концентрации этанола.
В современных условиях резкого повышения объемов и сроков годности пива задача коллоидной стабильности — острейшая необходимость. Большая часть веществ в пиве находится в коллоидном состоянии. При его длительном хранении, охлаждении или нагревании нарушается физико-химическое равновесие коллоидных комплексов, выпадающих в осадок. Происходят старение, увеличение размера частиц, окисление, полимеризация, адсорбция, образование нерастворимых высокомолекулярных полифенолов, деградация и денатурация белков. Присутствие в растворе множества взвешенных частиц вызывает его помутнение [4]. Его можно регистрировать с помощью мутномеров — турбидиметров. Однако более чувствительны, точны и применимы в большом диапазоне размеров и концентраций частиц не-
фелометры, определяющие рассеяние света в растворе под углом 90° или 25°. Таким образом, мутность — результат взаимодействия между светом и взвешенными в воде частицами. Проходящий через абсолютно чистую жидкость луч света остается практически неизменным, хотя даже в абсолютно чистой воде молекулы вызывают рассеяние света на некоторый, хоть и очень малый, угол. В результате ни один раствор не обладает нулевой мутностью. Если в образце присутствуют взвешенные твердые частицы, то результат взаимодействия образца с проходящим светом зависит от размера, формы и состава частиц, а также от длины волны (цвета) падающего света. На основе изучения начальной и индуцированной мутности пива можно прогнозировать технологические характеристики процесса фильтрации и сроков хранения продукции.
На рис. 4 показаны характеристики мутности при разных температурах нефильтрованного пива из ЦКТ, полученного с помощью штамма 34/70 и нового штамма. Более
низкие значения мутности у нового штамма наблюдали при 17 °С. Мутность увеличивалась при повышении температуры брожения до 20 °С, видимо, вследствие более интенсивного перемешивания системы за счет газообразования. Повышение мутности при понижении температуры процесса до 14 °С объясняется, по-видимому, менее интенсивной адсорбцией частиц на поверхности дрожжевых клеток.
На рис. 5 представлены данные по мутности фильтрованных через слой кизельгура проб пива из ЦКТ. Видно, что при повышенной температуре брожения мутность увеличивается, по-видимому, вследствие увеличения броуновского движения частиц и коллоидная стабильность пива падает.
Прогноз коллоидной стабильности пива очень важен как один из основных параметров его качества. Существует несколько информативных тестов, на основании которых можно сделать такой прогноз. Тесты подразделяют на два типа: вызывающие выпадение осадка и увеличивающие
3 • 2011
ПИВО и НАПИТКИ
50 100 150 200 ;
Продолжительность брожения, ч
Штамм 34/70 (14 °С) — Штамм 34/70 (17 °С) — Штамм 34/70 (20 °С)
50 100 150 200
Продолжительность брожения, ч
Штамм 34/70 (14 °С) — Штамм 34/70 (17 °С) Штамм 34/70 (20 °С)
50 100 150 200
Продолжительность брожения, ч
— Штамм К (14 °С) — Штамм К (17 °С) — Штамм К (20 °С)
100 150 200
Продолжительность брожения, ч
Штамм К (14 °С) — Штамм К (17 °С) Штамм К (20 °С)
Рис. 4. Мутность нефильтрованного пива во время
ферментации: а — штамм 34/70; б — штамм К
Рис. 5. Мутность фильтрованного пива: а — штамм 34/70; б — штамм К
воздействие (например, увеличение или уменьшение температуры). Благодаря таким тестам за много дней вперед можно предсказать появление мутности в пиве. В 1993 г. Шапон предложил оценку стабильности пива при введении в него 5%
3,5
2,5
1,5
0,5
Штамм Штамм Штамм Штамм Штамм Штамм 34/70, 34/70, 34/70, К, К, К, 14°С 17 °С 20 °С 14°С 17 °С 20 °С
этанола и охлаждении до -4 °С. На рис. 6, а представлены результаты этого теста для сравнительной оценки коллоидной стабильности нового пива. Видно, что пиво, полученное с использованием нового штамма, обладает гораздо большей стабиль-
14 т
10 -
б -
2 -
ЛI......
Штамм Штамм Штамм Штамм Штамм Штамм 34/70, 34/70,, 34/70, К, К, К, 14°С 17 °С 20 °С 14°С 17 °С 20 °С
Рис. 6. Тесты на коллоидную стабильность пива:
а — тест Шапона; б — количество циклов при 60 °С
ностью, чем контрольное пиво. Это уникальное свойство можно подтвердить и с помощью тестов увеличения температурной нагрузки на пиво. Из рис. 6, б видно, что новое пиво более стойкое и выдерживает больше циклов инкубации при 60 °С по сравнению с контрольным. Повышение температура брожения до 20 °С негативно сказывается на стабильности пива.
Однако главные достоинства пива — его потребительские свойства — неповторимый вкус и аромат, отсутствие веществ, негативно на них влияющих. Так, пиво, полученное с помощью нового штамма, обладало уникальным букетом с приятным эфирными нотами и ванильным оттенком. При этом сероор-ганические соединения практически отсутствовали (рис. 7). На основе нового штамма был создан новый бренд пива «Балтика «Кулер», получивший награды на международных конкурсах пивоваров.
Таким образом, используя только методы классической генетики и селекции, нам удалось решить задачу
0
0
250
а
а
0
250
0
50
250
б
б
12 -
8 -
4 -
0
0
Полнота вкуса
Горечь (приятная) Ароматный, эфирный
Ванильный ,
Сладкий
Насыщение С02
Изоамилацетат
7 Этилгексаноат
' Хмелевой, цветочный
Кислый
Серный
Рис. 7. Органолептический профиль пива «Кулер»
создания нового штамма для нового бренда «Балтика «Кулер». Достигнута основная цель работы — максимально расширенный скрининг штаммов разного происхождения и последующий отбор по интересующим признакам [5, 6]. Применение
нового штамма позволяет решить три основные задачи пивоварения — улучшение потребительских свойств напитка, технологических параметров производства и стабильного хранения готового продукта. Универсальность штамма позволила исполь-
зовать эти дрожжи при производстве других сортов пива, сидра и кваса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фараджева, Е. Д. Образование побочных продуктов брожения при высокоплотном пивоварении/Е. Д. Фараджева, Н. А. Кол-нышенко // Пиво и напитки. — 2008. — № 2. — С. 14-16.
2. Филимонова, Т. И. Использование рас пивных дрожжей на российских предприятиях/Т. И. Филимонова, О. А. Борисенко // Пиво и напитки. — 2008. — № 1. — С. 12-13.
3. Меледина, Т. В. Выбор штамма дрожжей для безалкогольного пива/Т. В. Меледина, В. Г. Оганнесян, Н. А. Петрова // Пиво и напитки. — 2008. — № 4. — С. 28-29.
4. Андреева, О. В. Осадки в пиве. Атлас частиц, которые могут быть обнаружены в разлитом пиве/О. В. Андреева, Е. Г. Шувалова. — М.: ООО «МИЦ Пиво и напитки XXI век», 2004. — 173 с.
5. Новый штамм дрожжей для пивоварения: свойства и преимущества/ С. Г. Давыден-ко [и др.] // Генетика. — 2010. — Т. 46. — № 11. — С. 1473-1484.
6. Штамм дрожжей ЗассИаготусеБ сегете1ае для применения в пивовароенной промышленности/С. Г. Давыденко [и др.] // Патент на изобретение № 2340666.2008. &
3 • 2011 ПИВО и НАПИТКИ 47
