CC BY
0УДК 579.66:577.15+579.842.11
М. А. Винтер, А. И. Зинченко
СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ХИТИНДЕАЦЕТИЛАЗЫ
Государственное научное учреждение «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220084, г. Минск, ул. Акад. Купревича, 2 e-mail: [email protected]
Приведены результаты исследований, посвященных созданию отечественного рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего хитиндеацетилазу — фермент, способный катализировать реакцию превращения химически инертного природного полимера — хитина, в полимер хитозан, который характеризуется лучшей растворимостью, биоразлагаемостью, нетоксичностью и поэтому имеет хорошие перспективы применения в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.
В работе были использованы традиционные методы конструирования генно-инженерных бактерий, которые позволили создать штамм E. coli, характеризующийся продуцирующей способностью в отношении хитинде-ацетилазы Bacillus cereus, составляющей 0,5 мг/л культуральной жидкости.
Полученные результаты могут способствовать разработке технологии, представляющей собой экологически чистую альтернативу традиционному химическому производству хитозана.
Ключевые слова: рекомбинантная бактерия, хитин, хитозан, хитиндеацетилаза, Escherichia coli, Bacillus cereus.
Для цитирования: Винтер, М. А. Создание рекомбинантного бактериального штамма-продуцента хитинде-ацетилазы / М. А. Винтер, А. И. Зинченко // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2024. - Т. 37. - С. 95-102.
Введение
Хитин — второй по распространенности природный полимер после целлюлозы и самое распространенное возобновляемое азотсодержащее вещество на Земле [1, 2]. Он широко представлен в клеточных стенках ракообразных, экзоскелетах насекомых, моллюсках и грибах [3].
Природный хитин обладает плотной кристаллической структурой и не растворим в обычных растворителях, что серьезно ограничивает его практическое применение [4, 5].
Хитозан — поликатионный полимер, получаемый путем деацетилирования хитина. Благодаря наличию аминогрупп хитозан обладает лучшей растворимостью, чем хитин [6].
На протяжении многих лет хитозан считается многообещающим экологически чистым полимером благодаря своей возобновляемо-сти, биосовместимости, биоразлагаемости, нетоксичности и простоте химических моди-
фикаций [7, 8]. Применимость хитозана в медицине (системы доставки лекарств и тканевая инженерия) и других областях (продукты питания, косметика, сельское хозяйство) уже хорошо задокументированы [9-12].
Традиционный промышленный способ получения хитозана заключается в обработке хитина концентрированными растворами щелочей. Этот процесс трудно контролировать, и он может приводить к серьезному загрязнению окружающей среды [13, 14]. Кроме того, качество получаемого таким образом конечного продукта не может удовлетворять требованиям биофармацевтики [15, 16].
Хитиндеацетилаза принадлежит к суперсемейству углеводных эстераз [5]. Она может катализировать деацетилирование хитина, тем самым образуя хитозан с лучшей биосовместимостью и биоразлагаемостью [15, 17]. Таким образом, ферментативное деацетили-рование хитина с помощью хитиндеацети-
лаз (рис. 1) представляет собой экологически чистую альтернативу производству хитозана [14, 18-21].
В прошлом большинство исследований хи-тиндеацетилазы было сосредоточено на изучении свойств этого фермента, изолированного из штаммов, выделенных из окружающей
среды [22, 23]. В настоящее время основное внимание уделяется созданию высокопродуктивных штаммов с помощью технологии ре-комбинантной ДНК [24, 25].
Цель исследования — создание отечественного рекомбинантного штамма E. coli, продуцирующего хитиндеацетилазу.
ОН ОН
Рис. 1. Расщепление хитина до хитозана хитиндеацетилазой
Материалы и методы
Бактерии рода Bacillus культивировали на среде следующего состава (%): NaNO3 — 0,2; K2HPO4 — 0,1; KH2PO4 — 0,1; MgSO4 — 0,05; коллоидный хитин — 1; агар-агар — 1,5; при 30 °С в течение 48 ч.
Источником структурных генов chbG (GenelD: 72451846), кодирующего аминокислотную последовательность хитиндеаце-тилазы, служила хромосомная ДНК штамма Bacillus cereus БИМ В-170. ДНК выделяли с помощью фенол-хлороформного метода. Ген chbG амплифицировали с помощью ПЦР, используя «Flash-полимеразу» (АртБиоТех, Беларусь) и олигонуклеотидные праймеры:
BcerCDA_F (5'-GTGGTGGTCCACA ACATGTTTTTCTTTTTTATTACGAGTA AAAGAAAC-3'),
BcerCDA_R (5'-GTGGTGGTGATGGTGA TGCTCTTGAACATCTTTACTTTTCGTACTT GTATTG-3').
На 5'-окончания праймеров встроили ну-клеотидные последовательности (подчеркну-
ты), комплементарные плазмиде рЕТ42а(+) (Novagen, США).
Амплификацию гена, кодирующего хи-тиндеацетилазу, и линеаризацию плазмиды рЕТ-42а(+) проводили в реакционных смесях объемом 50 мкл, каждая из которых содержала: 1 ед. активности Flash-полимеразы, смесь четырех канонических дезоксинуклеозидтри-фосфатов (дНТФ) (суммарно 200 мкмолей), по 20 пмоль прямого и обратного праймеров и 0,01 мкг ДНК.
Амплификацию гена проводили по следующей программе: этап предденатурации (30 сек при 98 °С); 30 циклов амплификации (7 сек при 98 °С; 10 сек при 55 °С; 30 сек при 72 °С); финальная элонгация (30 сек при 72 °С).
Линеаризацию плазмиды рЕТ42а(+) проводили с использованием праймеров рЕТ421^ (5'-САТАШТАТАТСТССТТСТТ AAAGTTAAACA AAATTATTTCTAGAG-3') и 421п^ (5'-GAGCATCACCATCACCACCAC CACCACTAATTG-3') по следующей программе: этап предденатурации (30 сек при 98 °С);
25 циклов амплификации (10 сек при 98 °С; 15 сек при 55 °С; 3 мин 30 сек при 72 °С); финальная элонгация (3 мин 30 сек при 72 °С).
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1%-ом агарозном геле. Для определения размера фрагментов ДНК использовали маркер молекулярных масс ДНК «GeneRulerTM DNA Ladder Mix» (ThermoFisher, США). Продукт, соответствующий гену chbG, выделяли и встраивали в вектор pET42a(+), предварительно линеаризованный методом ПЦР.
Сборку полученных фрагментов ДНК (линеаризованного вектора и гена, кодирующего хитиндеацетилазу) осуществляли методом продолжительной перекрывающейся ПЦР (ПП-ПЦР). Продуктами ПП-ПЦР трансформировали компетентные клетки E. coli BL (Novagen, США) методом электропора-ции с использованием прибора MicroPulser Electroporator (BioRad, США), после чего высевали на плотную питательную среду LB (0,5%-й дрожжевой экстракт; 1%-й триптон; 1%-й NaCl; 1%-ая глюкоза; 2%-й агар-агар; рН 7,0), содержащую канамицин в концентрации 100 мкг/мл. Выросшие одиночные колонии анализировали на наличие вставки гена chbG методом ПЦР, используя праймер к Т7-про-мотору (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'), входящему в состав плазмиды pET24а+, и праймер к гену chbG — BcerCDA_R. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1 ед. активности Taq-полимеразы, смесь четырех канонических дНТФ (суммарно 80 мкмолей), по 10 пмоль праймеров и ресуспендированные в смеси клетки бактерий-трансформантов.
ПЦР осуществляли по следующей программе: этап предденатурации (3 мин при 95 °С); 25 циклов амплификации (10 сек при 95 °С; 10 сек при 55 °С; 1 мин 20 сек при 72 °С); финальная элонгация (1 мин 20 сек при 72 °С).
Продукты амплификации анализировали электрофоретически в 1%-ом агарозном геле. Отбирали бактерии, клетки которых содержали плазмиду pET24а(+) со вставкой гена chbG в правильной ориентации.
Поверхностное культивирование трансформантов осуществляли на модифицированной среде LB, содержащей в качестве источника углерода коллоидный хитин в конечной концентрации 1% при 37 °С в течение 16 ч. Зоны
утилизации хитина визуализировали с использованием красителя Конго красный в концентрации 2%.
Глубинное культивирование E. coli осуществляли в жидкой среде следующего состава (%): дрожжевой экстракт — 0,5; пептон — 1; глюкоза — 1; MgSO4 — 0,02; Na2HPO4 — 0,36; KH2PO4 — 0,34; NH4Cl — 29,6; Na2SO4 — 0,07; канамицин — 0,01.
Бактерии выращивали на термостатируемой качалке при температуре 37 °С до достижения оптической плотности культуральной жидкости (КЖ) 0,6-1,0 (X = 600 нм), затем вносили индуктор — изопропил^-0-1-тиогалактопи-ранозид (ИПТГ) (CarlRoth, Германия) до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжали культивирование в течение 4 ч при температуре 37 °С. Затем клетки осаждали центрифугированием при 10 000 g в течение 5 мин. Супернатант удаляли, клетки ресуспендиро-вали в лизирующем буфере (300 мМ NaCl; 10 мМ имидазол; 50 мМ NaH2PO4; pH 8,0) и разрушали ультразвуком, используя прибор Sonifier-450 (Brandson, США), при следующих режимах: мощность — 0,05 кВт; температура — 4 °С; продолжительность — 600 импульсов по 0,5 сек.
Клеточные лизаты осветляли центрифугированием при 60 000 g в течение 30 мин и на-досадочную жидкость наносили на хрома-тографическую колонку со смолой Ni2+-NTA (Qiagen, США), уравновешенную пятью объемами лизирующего буфера.
Через колонку последовательно пропускали два объема лизирующего буфера. Далее использовали 10 объемов промывочного буфера (300 мМ NaCl; 10 мМ имидазол; 50 мМ NaH2PO4; 0,5%-й Тритон X-100; pH 8,0) для удаления неспецифически связавшихся с колонкой белков и два объема лизирующего буфера. Рекомбинантный белок элюировали буфером, содержащим 300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 500 мМ имидазола (pH 8,0). Полученные в результате металл-аффинной хроматографии образцы белка анализировали с помощью 12%-го ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза. Для определения молекулярных масс белков использовали стандарт «BlueEye Prestained Protein Marker» (Jena Bioscience, Германия). Концентрацию белка в образцах определяли методом Брэдфорд.
Результаты и обсуждение
Биоинформационный анализ проводили с использованием базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank. Для поиска гена, кодирующего хитиндеацетилазу, были выбраны непатогенные бактерии, в частности бациллы, характеризующиеся широким спектром продуцируемых ферментов, что позволило сузить круг поисков до трех видов: Bacillus cereus, B. licheniformis и B. velezensis.
Скрининг продуцентов проводили на ага-ризованной среде в качестве единственного источника углерода, в которой был коллоидный хитин. Т. к. на момент проведения исследования был аннотирован ген, кодирующий хитиндеацетилазу только для B. cereus, в качестве референсной для этого вида была выбрана нуклеотидная последовательность chbG (Gene ID: 72451846). Для дальнейшей работы была выбрана ДНК B. cereus БИМ B-170.
Далее нами был выделен образец хромосо-мальной ДНК штамма B. cereus БИМ B-170 методом фенольной экстракции. Амплификацию гена проводили, как описано в разделе Материалы и методы исследования. Результаты представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Электрофореграмма продукта амплификации гена сИЬО: 1 — ампликон гена сИЬО из штамма В. сегет БИМ В-170; Мн — маркер молекулярных масс фрагментов ДНК
Амплифицированный ген был встроен в предварительно линеаризованный вектор рЕТ42а(+) с помощью ПП-ПЦР, в результате чего была получена генетическая конструкция, обозначенная как pET42-CDA-B.cereus (генетическая карта конструкции представлена на рис. 3).
Полученными плазмидами трансформирова-
Рис. 3. Генетическая карта конструкции, несущей ген chbG B. cereus
ли реципиентные штаммы E. coli BL21 (DE3) и отбирали трансформанты, содержащие плазмиду с геном chbG, встроенным в правильной ориентации. Скрининг выросших трансформантов осуществляли с помощью ПЦР (рис. 4).
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов ПЦР-скри-нинга на наличие гена хитиндеацетилазы B. cereus: 1-10 — ампликоны из соответствующих клонов-трансформантов; Мн — маркер молекулярных масс фрагментов ДНК
Колонии трансформантов, несущие в своем составе гены chbG, были пересеяны и далее проанализированы на способность использовать хитин в качестве единственного источника углерода с последующим окрашиванием Конго красным (рис. 5).
Кислый pH приводит к сдвигу спектрального максимума красителя в область больших длин волн (X = 540-570 нм) и, соответственно, изменению цвета индикатора. Неионные взаимодействия этого красителя при нейтральных значениях pH приводят к деколоризации красителя, что позволяет использовать это свойство для количественного определения субстрата, способного вступать во взаимодействие с Конго красным. Следовательно, по зонам деколоризации Конго красного вокруг колоний клеток можно судить об их способности утилизировать хитин.
Как видно из рис. 5, вокруг всех колоний образовались более светлые зоны деколоризации красителя, что свидетельствует о продукции хитиндеацетилазы.
Индукция синтеза хитиндеацетилазы и последующая очистка фермента показала синтез трансформантами целевого белка для продуцентов B. cereus (рис. 6 и 7) соответственно.
Как видно из рис. 6, образуемый фермент накапливается в растворимой фракции клеточного лизата.
Продуктивность штамма в расчете на синтезируемый белок составляет 0,5 мг/л культу-ральной жидкости. Молекулярная масса выделенного белка равна 25 кДа, что соответствует целевому ферменту.
В плане обсуждения полученных резуль-
Рис. 5. Рост клонов-трансформантов на среде с коллоидным хитином
Рис. 6. Электрофореграмма белкового состава клеток E. coli BL, несущих плазмиду с геном chbG: 1 — клеточный лизат до индукции; 2 — клеточный лизат после индукции; 3 — супернатант клеточного лизата; 4 — тела включения; М — маркер молекулярной массы белка
Рис. 7. Электрофореграмма хитиндеацетилазы после металл-аффинной хроматографии. М — маркер молекулярной массы белка
татов следует отметить, что утилизация хи-тинсодержащих отходов является актуальной проблемой, в то время как получаемый при деацелилировании хитина хитозан может служить перспективным соединением в биофармацевтике [7-12]. Продемонстрированный в настоящем исследовании биотехнологический подход для трансформации хитина в хитозан является экологичным, а также открывает возможность для получения целевого продукта с заданными свойствами для применения в медицине [17].
Заключение
Методами генной инженерии был изолирован и клонирован ген, кодирующий хитиндеа-цетилазу B. cereus. С использованием вектора pET42a(+) создана генетическая конструкция, несущая ген chbG, которой трансформирован штамм E. coli BL21 (DE3). Полученный ре-комбинантный штамм способен продуцировать хитиндеацетилазу в растворимой форме в количестве 0,5 мг/л культуральной жидкости. Полученные результаты могут быть использованы для разработки технологии, представляющей собой экологически чистую альтернативу традиционному химическому производству хитозана.
Список использованных источников
1. Younes, I. Chitin and chitosan preparation
from marine sources. Structure, properties and applications / I. Younes, M. Rinaudo // Mar. Drugs. - 2015. - Vol. 13. - P. 1 133-1 174. DOI: 10.3390/md13031133.
2. Upcycling chitin-containing waste into organonitrogen chemicals via an integrated process / X. Q. Ma [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2020. - Vol. 117. - P. 7 719-7 728. DOI: 10.1073/pnas.1919862117.
3. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris / L. L. Yin [et al.] // Molecules. - 2022. - Vol. 28.
- Art. 113. D0I:10.3390/molecules28010113.
4. Extraction, characterization and antimicrobial activity of chitosan from pen shell, Pinna bicolor / B. P. Sudatta [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. -
2020. - Vol. 163. - P. 423-430. D0I:10.1016/j. ijbiomac.2020.06.291.
5. Rationally engineered chitin deacetylase from Arthrobacter sp. AW19M34-1 with improved catalytic activity toward crystalline chitin / Z. W. Ding [et al.] // Carbohydr. Polym.
- 2021. - Vol. 274. - Art. 118637. D0I:10.1016/j. carbpol.2021.118637.
6. Liaqat, F. Chitooligosaccharides and their biological activities: A comprehensive review / F. Liaqat, R. Eltem // Carbohydr. Polym. -2018. - Vol. 184. - P. 243-259. D0I:10.1016/j. carbpol.2017.12.067.
7. Effects of neutralization on the physicochem-ical, mechanical, and biological properties of am-monium-hydroxide-crosslinked chitosan scaffolds / P. H. Azueta-Aguayo [et al.] // Int. J. Mol. Sci.
- 2022. - Vol. 23. - Art. 14822. D0I:10.3390/ ijms232314822.
8. Reimagining chitosan-based antimicrobial biomaterials to mitigate antibiotic resistance and alleviate antibiotic overuse: a review / K. S. Dhlamini [et al.] // Macromol. Mater. Eng. - 2024. - Art. 2400018. D0I:10.1002/ma-me.202400018.
9. Chitosan: an overview of its properties and applications / I. Aranaz [et al.] // Polymers. -
2021. - Vol. 13, № 19. - Art. 3256. D0I:10.3390/ polym13193256.
10. Amelioration of cancer employing chitosan, its derivatives, and chitosan-based nanoparticles: recent updates / T. Virmani [et al.] // Polymers. -2023. - Vol. 15, № 13. - Art. 2928. D0I:10.3390/ polym15132928.
11. Chitosan, chitosan derivatives, and chi-
tosan-based nanocomposites: eco-friendly materials for advanced applications (a review) / A. El-Araby [et al.] // Frontiers in Chemistry. -2024. - Vol. 11. - Art. 1327426. D01:10.3389/ fchem.2023.1327426.
12. In vivo immunological activity of chitosan-derived nanoparticles / C. Xu [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. - 2024. -Vol. 262(Pt 2). - Art. 130105. D01:10.1016/j. ijbiomac.2024.130105.
13. Base-catalysed, one-step mechanochemical conversion of chitin and shrimp shells into low molecular weight chitosan / X. Chen [et al.] // Green Chem. - 2017. - Vol. 19. - P. 2 783-2 792. D0I:10.1039/C7GC00089H.
14. Purification and characterization of chitin deacetylase active on insoluble chitin from Nitratireductor aquimarinus MCDA3-3 / J. L. Chai [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. -2020. - Vol. 152. - P. 922-929. D0I:10.1016/j. ijbiomac.2020.02.308.
15. Enzymatic modifications of chitin, chitosan, and chitooligosaccharides / M. B. Kaczmarek [et al.] // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2019. -Vol. 7. - Art. 243. D0I:10.3389/fbioe.2019.00243.
16. Screening of chitin deacetylase producing microbes from marine source using a novel receptor on agar plate / G. M. Pawaskar [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2019. - Vol. 131. -P. 716-720. D0I:10.1016/j.ijbiomac.2019.03.118.
17. Investigation of the effects of molecular parameters on the hemostatic properties of chitosan / Z. Hu [et al.] // Molecules. - 2018. - Vol. 23. -Art. 3147. D0I:10.3390/molecules23123147.
18. Raval, R. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells / R. Raval, R. Simsa, K. Raval // Int. J. Biol. Macromol. - 2017. - Vol. 104. - P. 1 692-1 696.
D0I:10.1016/j.ijbiomac.2017.01.151.
19. A chitin deacetylase from the endophytic fungus Pestalotiopsis sp. efficiently inactivates the elicitor activity of chitin oligomers in rice cells / S. Landwehr [et al.] // Sci. Rep. - 2016. -Vol. 6. - Art. 38018. D0I:10.1038/srep38018.
20. Aktuganov, G. E. Specific features of chitosan depolymerization by chitinases, chitosanases, and nonspecific enzymes in the production of bioactive chitooligosaccharides / G. E. Aktuganov, A. I. Melent'ev // Appl. Biochem. Microbiol. - 2017. - Vol. 53. - P. 611627. D0I:10.1134/S0003683817060023.
21. Isolation, characterisation, and genome sequencing of Rhodococcus equi: A novel strain producing chitin deacetylase / Q. Y. Ma [et al.] // Sci. Rep. - 2020. - Vol. 10. - Art. 4329. DOI: 10.1038/s41598-020-61349-9.
22. Araki, Y. A pathway of chitosan formation in Mucor rouxii: Enzymatic deacetylation of chitin / Y. Araki, E. Ito // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1974. - Vol. 56. - P. 669-675.
23. Gao, X. D. Purification and characterization of chitin deacetylase from Absidia coerulea / X. D. Gao, T. Katsumoto, K. Onodera // J. Biochem. - 1995. - Vol. 117. - P. 257-263.
24. Process evaluation and kinetics of recombinant chitin deacetylase expression in E. coli Rosetta pLysS cells using a statistical technique / G. M. Pawaskar [et al.] // Journal of Visualized Experiments: Jove. - 2023. - Vol. 193. D0I:10.3791/64590.
25. Cloning and characterization of chitin deacetylase from Euphausia superba / X. Wang [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2024. - Vol. 25, № 4. - Art. 2075. D0I:10.3390/ijms25042075.
M. A. Vinter, A. I. Zinchenko
ENGINEERING OF RECOMBINANT BACTERIAL CHITIN DEACETYLASE PRODUCTION STRAIN
State Scientific Institution "Institute of Microbiology of the National Academy of Sciences of Belarus" 2 Kuprevich St., 220084 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: [email protected]
The study results are demonstrated on the development of the domestic recombinant strain Escherichia coli producing chitin deacetylase — an enzyme capable of catalyzing the reaction of the conversion of the chemically inert natural polymer chitin into the chitosan polymer, which is characterized by better solubility, biodegradability and non-toxicity, and therefore, it has good prospects for use in medicine, food industry and agriculture.
Traditional methods of constructing of genetically engineered bacteria were used in work, which made it possible to develop the E. coli strain characterized by the production ability of Bacillus cereus chitin deacetylase, which is 0.5 mg/l of the culture broth.
The results obtained may contribute to the development of technology that provides an environmentally friendly alternative to the conventional.
Keywords: recombinant bacterium, chitin, chitosan, chitin deacetylase, Escherichia coli, Bacillus cereus.
Дата поступления в редакцию: 11 апреля 2024 г.
