CC BY
110
УДК 577.21
СОЗДАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ НА ГЕНЫ DREB ПЫРЕЙНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ПОВЫШЕНИЕ ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТИ В ГЕНОМАХ ЗЛАКОВ
© А. А. Почтовый, Г. И. Карлов, М. Г. Дивашук*
Российский государственный аграрный университет им. К. А. Тимирязева Россия, 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.
E-mail: divashuk@gmail.com
В результате клонирования и секвенирования были получены нуклеотидные последовательности генов-кандидатов DREB у дикорастущих сородичей пшеницы (Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum, Thinopyrum elongatum). Разработан молекулярный маркер позволяющий отличить гены-кандидаты DREB пырейного происхождения от генов DREB мягкой пшеницы, при их одновременном присутствии в геноме.
Ключевые слова: DREB, Thinopyrum intermedium, elongatum, клонирование, секвенирование.
Thinopyrum ponticum, Thinopyrum
Введение
Пшеница является важной продовольственной культурой. Рост населения Земли требует повышения производства продуктов питания к 2050 году в 2 раза, что делает необходимым увеличение объемов производства пшеницы во всем мире. В настоящее время пшеница занимает посевных площадей больше, чем какая-либо другая культура, уступая по валовому сбору только кукурузе и рису. Однако стабильное возделывание пшеницы и его расширение сталкивается с рядом проблем. Они, в первую очередь, связаны с глобальным изменением климата на планете, нерациональным природопользованием и генетической эрозией пшеницы. Изменение климата в ряде регионов, в том числе и России, как показали последние годы, связаны с аномально высокими температурами, совпадающими с малым количеством осадков, что приводит к весенним и летним засухам. Существующие сорта пшеницы не приспособлены к таким жестким условиям выращивания, что приводит к существенным потерям.
Факторы транскрипции играют важную роль в регулировании экспрессии генов в ответ на абиотический стресс, в том числе засуху и засоление. Транскрипционные факторы привлекательны для усиления толерантности к стрессам с помощью генной инженерии, потому что чрезмерная экспрессия отдельного транскрипционного фактора может привести к повышенной или пониженной регуляции широкого спектра генов участвующих в реакции на стресс. Многие транскрипционные факторы, включая DREB1/CBF, DREB2, AREB/ABF можно использовать для усиления толерантности к абиотическим стрессам. Например, фактор транскрипции засухоустойчивого дикорастущего ячменя H. spontaneum HsDREBIA, находясь под транскрипционным контролем индуцируемого стрессом промотора HVA1, был внедрен в апомиктичный вид Paspalum notatum сорта Argentine. Полученные трансгенные растения выносили тяжелый солевой стресс и повторяющиеся циклы тяжелой дегидратации по сравнению с нетрансгенными растениями.
Изолированные DREB-подобные гены рапса, пшеницы, ржи, томата, риса, ячменя, кукурузы и острого перца чрезмерно экспрессируются при встраивании их в геном других видов, что усиливает толерантность трансгенных растений к различным абиотическим стрессам [1-5].
Недавно была показана важность транскрипционных факторов DREB в маркер-опосредованной селекции и стратегии улучшения сельскохозяйственных культур. Кроме того, изучение генов-кандидатов DREB и создание функциональных маркеров для MAS и аллельного маркирования в селекционных программах позволит создавать сорта сельскохозяйственных культур с повышенной толерантностью к стрессу путем генетических манипуляцией.
Цель нашей работы была изучение частичных нуклеотидных последовательностей генов-кандидатов DREB у дикорастущих сородичей пшеницы (Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum, Thinopyrum elongatum) и разработка молекулярных маркеров позволяющих отличить гены-кандидаты DREB пырейного происхождения от генов DREB мягкой пшеницы, при их одновременном присутствии в геноме.
Материалы и методы
Растительный материал. В работе были использованы образцы Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum, Thinopyrum elongatum.
В качестве контроля были использованы следующие сорта мягкой пшеницы: Немчиновская, Айвина, Старшина, Безостая 1.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley.
ПЦР, клонирование, секвенирование. Последовательности используемых в нашей работе прайме-ров приведены ниже [6].
P22F CTGGCACCTCCATTGCCGCT
PRa
AGTACATGAACTCAACGCACAGGACAAC
Лигирование амплифицированной ДНК осуществлялось в вектор pGEM®-T Easy. Секвенирование осуществлялось на ABI-3130XL.
* автор, ответственный за переписку
746
БИОЛОГИЯ
Рис. 2. Сайты узнавания рестриктазы PvuII, отмеченные цветом и стрелочками.
Результаты и обсуждение
Для изучения нуклеотидной последовательности генов Dreb-типа у видов дикорастущих сородичей пшеницы Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum первоначально мы провели апробацию праймеров разработанных на гены Dreb мягкой пшеницы. В ходе оптимизации ПЦР с праймерами P22F/PRa были подобраны условия для амплификации продукта ожидаемого размера 500-600 п.н. Затем полученный ПЦР продукт был клонирован в вектор pGEM®-T и секвенирован.
Все полученные нами в ходе работы последовательности отличались крайне высокой степенью гомологии к генам Dreb мягкой пшеницы. Отличия между сиквенсами пшеницы и ее дикорастущих сородичей представляли собой лишь несколько SNP (рис. 1).
На один из SNP по которым отличались полученные нами сиквенсы Dreb-подобных генов пырей-ного происхождения от сиквенсов генов мягкой пшеницы, нами была подобрана эндонуклеаза рестрикции PvuII (рис. 2). Данный фермент должен расщеплять только гены Dreb мягкой пшеницы, благодаря чему можно будет выявлять присутствие тех генов пырейного происхождения по которым в ходе нашей работы были получены частичные сиквенсы.
После рестрикции PvuII ПЦР продукта с праймерами P22F/PRa на контрольных образцах, было экспериментально подтверждена работа данного CAPS маркера (рис. 3).
123 4 5678
Рис. 3. Рестрикция ПЦР с праймерами P22F/PRa продукта PvuII. 1 - Thinopyrum elongatum; 2 - Thinopyrum intermedium; 3 - Thinopyrum ponticum; 4 - Thinopyrum ponticum; 5 - T. aestivum, сорт Старшина; 6 - T.aestivum, сорт Коротышка; 7 - T.aestivum, сорт Безостая; 8 - T. aestivum, сорт Айвина. Стрелочками обозначены специфические отличительные бенды.
Таким образом, в ходе выполнения работ нами были получены частичные нуклеотидные последовательности для генов-кандидатов DREB пырейного происхождения. В общей сложности с разных пар праймеров было получено: для Thinopyrum ponticum - 3 гаплотипных последовательности; Thinopyrum intermedium - 2 гаплотипных последовательности. У всех полученных гаплотипных последовательностей по сравнению с пшеницей и друг с другом наблюдались в основном только SNP различия. Это свидетельствует о высокой консервативности данного типа генов у злаков. Данные различия приводят как к синомическим, так и к несиномическим заменам. В полученных нами последовательностях стоп-кодоны
не встречались. Несмотря на наличие лишь SNP различий, судя по литературным данным, они могут приводить к существенному усилению или ослаблению реакции растения на абиотические стрессы. Нами разработан CAPS маркер, Р22F/PRa/PvuII позволяющий отличить гены-кандидаты DREB пырей-ного происхождения от DREB генов мягкой пшеницы в их присутствии.
Выводы:
1. Клонированы и секвенированы частичные нуклеотидные последовательности для генов-кандидатов DREB пырейного и пшеничного происхождения, в которых наблюдались, в основном, SNP различия. Этот факт свидетельствует о высокой консервативности данного типа генов у злаков.
2. Нами разработан CAPS маркер, Р22F/PRa/PvuII позволяющий отличить гены-кандидаты DREB пырейного происхождения от DREB генов мягкой пшеницы в их присутствии.
Благодарности. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», ГК № 14.518.11.7043 от 19 июля 2012 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Jaglo K. R., Kleff S., Amundsen K. L., Zhang X., Haake V., Zhang J. Z., Deits T. & Thomashow M. F. (2001) Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species. Plant Physiology 127, 910-917.
2. Dubouzet J. G., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga M., Dubouzet E. G., Miura S., Seki M., Shinozaki K. & Yamaguchi-Shinozaki K. (2003) OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt-and cold-responsive gene expression. The Plant Journal 33, 751-763.
3. Qin F., Sakuma Y., Li J., Liu Q., Li YQ., Shinozaki K., Ya-maguchi-Shinozaki K. 2004. Cloning and functional analysis of a novel DREB 1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L. Plant and Cell Physiology 45, 1042-1052.
4. Hong J.P. & KimW.T. (2005) Isolation and functional characterization of the Ca-DREBLP1 gene encoding a dehydratio-nresponsive element binding factor like protein 1 in hot pepper (Capsicum annuum L. cv. Pukang). Planta 220, 875-888.
5. Xu Z. S., Ni Z. Y., Li Z. Y., Li L. C., Chen M., Gao D. Y., Yu X. D., Liu P. & Ma Y. Z. (2009) Isolation and functional characterization of HvDREB1, a gene encoding a dehydration-responsive element binding protein in Hordeum vulgare. Journal of Plant Research 122, 121-130.
6. Wei B., Jing R. L.,Wang C. S., Chen J. B., Mao X. G., Chang X. P. & Ji a J. Z. (2009) Dreb1 genes in wheat (Triticum aesti-vum L.): development of functional markers and gene mapping based on SNPs. Molecular Breeding 23, 13-22.
Поступила в редакцию 03.08.2013 г.
