CC BY
51
728
БИОЛОГИЯ
УДК 577.218:582.951.4
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГАПЛОТИПОВ ГЕНА WX ПЫРЕЯ СРЕДНЕГО
(THINOPYRUM INTERMEDIUM)
© М. Г. Дивашук*, М. В. Климушина, Г. И. Карлов
Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева Россия, 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.
E-mail: [email protected]
Для изучения потенциальной ценности генов, контролирующих синтез амилозы (Wx), дикорастущих сородичей пшеницы и исследования эволюции данных генов были получены нук-леотидные последовательности гена Wx для Thinopyrum intermedium,имеющих размеры 2685 пн и 2646 пн. На основе полученных нуклеотидных последовательностей был разработан молекулярный маркер, позволяющий отличить гены Wx, принадлежащие Th. intermedium, от генов Wx мягкой пшеницы. Благодаря данному маркеру стало возможно идентифицировать наличие генов пырея в геноме пшенично-пырейных гибридов и оценить возможное влияние данных генов на формирования крахмала.
Ключевые слова: Thinopyrum intermedium, интрон.
Введение
Пшеница - важная продовольственная культура, одним из направлений использования которой является получение крахмала, широко применяемого в различных отраслях пищевой и непищевой промышленности. Содержание крахмала в зерновке пшенице составляет 65-75% на сухую массу. Физические и химические свойства крахмала зависят от отношения содержания его компонентов: амилозы и амилопектина. GBSSI или белок Waxy отвечает за синтез амилозы в запасающих тканях зерновых культур. У мягкой пшеницы присутствуют три изоформы белка Waxy, молекулярный вес которых составляет 59-70 kDa. Они кодируются тремя генами: Wx-A1 (2.781 пн), Wx-B1 (2.794 пн) и Wx-D1 (2.862 пн), каждый из которых состоит из 11 экзо-нов и 10 интронов [1]. Было обнаружено несколько типов аллелей генов Wx, по-разному влияющих на синтез амилозы крахмала. Однако по сравнению с другими запасными белками эндосперма, формирующими качество зерна, у мягкой пшеницы идентифицировано небольшое число функциональных аллелей, отличных от дикого типа [2-4]. Поэтому поиск и вовлечение в селекционный процесс мягкой пшеницы различных аллелей генов Wx считается перспективным и позволит получать линии с контролируемым содержанием амилозы.
Дикорастущие сородичи пшеницы являются ценными источниками генетического материала для улучшения пшеницы. Исследование структуры и функции генов Wx у дикорастуших сородичей пшеницы имеет значение для изучения эволюции этих хозяйственно-ценных генов и видов в целом, а так же для изучения потенциальной ценности этих генов и перспектив их интрогрессии в геном пшеницы различными методами. Одним из наиболее интересных видов является Thinopyrum intermedium. Он является преимущественно гексаплоидным злаком (2n = 6x = 42) и имеет большую практическую ценность, как потенциальный донор различных генов устойчивости в геном пшеницы. В лите-
гены Wx, пшенично-пырейные гибриды, экзон,
ратуре так же имеются данные об улучшении качества пшеницы благодаря интрогрессии в ее геном ряда генов Th. intermedium.
Одной из важных проблем при направленной интрогрессии каких либо генов от дикорастущих сородичей непосредственно в геном пшеницы является создание молекулярных маркеров. При этом особое внимание должно быть уделено возможности различения пырейных и пшеничных генов в одном геноме.
В связи с этим целью нашей работы было сек-венирование гена Wx у вида Thinopyrum intermedium и создание молекулярного маркера для его идентификации.
Материалы и методы
Растительный материал. В работе использовали семена Thinopyrum intermedium, Thinopyrum bessarabicum, Ps. strigosa и сорт мягкой пшеницы Старшина.
Выделение ДНК из проростков проводили по методу Bernatzky и Tanksley [5].
ПЦР, клонирование, секвенирование. В работе использовали следующие праймеры: WxF3, WxVTIR, WxBAF, WxBAR, WxVTIF, WxVTR [6]. Полимеразную цепную реакцию проводили на Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler («Bio_Rad», США) при условиях, рекомендуемых авторами праймеров. 25 мкл реакционной смеси содержали: IxTaq-полимеразный буфер («Силекс», Москва), 1.0 U Taq_ДНК_полимеразы («Силекс», Москва), 200 мкМ каждого dNTP («Promega»), 0.2 мкМ каждого праймера и 100-150 нг ДНК-матрицы. Концентрация хлорида магния для праймеров 4F, 4R составляла 3.0 мкМ, в остальных случаях -2.5 мкМ. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трисборатном буферном растворе (ТВЕ). В качестве маркера размеров использовали «100 bp Ladder» («Fermentas», Литва). Лигирование амплифицированной ДНК осуществляли в pGEM®-T Easy Vectors. Секвенирование проводили на на секвенаторе ABI-3130XL.
■ автор, ответственный за переписку
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2013. Т. 18. №3
729
Рис. 1. Выравнивание последовательностей генов Wx Th. intermedium, полученных в нашей работе, с последовательностями генов Wx мягкой пшеницы. Черным цветом отмечены экзоны, цифрами обозначены номера экзонов.
Рисунок 2. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера Th1. 1, 3 - Ps. strigosa; 2 - T. aestivum сорт Старшина; 4 - Thinopyrum bessarabicum; 5, 6 - Thinopyrum intermedium; 7 - отрицательный контроль; М-маркер молекулярных размеров.
Результаты и обсуждение
До настоящего времени полноразмерные последовательности генов Wx дикорастущих сородичей отсутствовали. Для получения полноразмерных последовательностей данных генов мы условно поделили ген на три части, каждая примерно по 1000 пн, амплифицировали их, клонировали в вектор pGEM®-T и секвенировали каждую часть гена по отдельности. Нами по литературным данным были отобраны несколько комбинаций праймеров, которые ранее использовали для получения полноразмерных последовательностей генов Wx у различных видов пшеницы - твердой, мягкой, спельты.
В результате проведенной работы нами было получены две нуклеотидные последовательности гена Wx для Thinopyrum intermedium. Одна размером 2685 пн и вторая размером 2646 пн (рис. 1).
В целом, как и ожидалось, наибольшая вариативность наблюдалась в интронах. При этом экзо-ны оказались достаточно консервативными, и, как правило, отличия составляли однонуклеотидные замены. За исключением начала пятого экзона. На основе полученных нуклеотидных последовательностей, нами был разработан молекулярный маркер Th1, позволяющий отличить гены Wx, принадлежащие Th. intermedium, от генов Wx мягкой пшеницы. Амплификация при использовании данного маркера наблюдается только с генов Wx пырейного происхождения (рис. 2). Благодаря данному маркеру стало возможно идентифицировать наличие генов пырея в геноме пшенично-пырейных гибридов и оценить возможное влияние данных генов на
формирования крахмала. В случае выявления положительного эффекта пырейных генов на крахмал пшеницы, их достаточно легко можно будет ин-трогрессировать в коммерческие сорта пшеницы с использованием разработанных нами молекулярных маркеров и системы ph-мутации.
Благодарности. Работа поддержана грантом Министерства образования Соглашение № 8137 по теме «Молекулярно-генетическая характеристика генов контролирующих синтез амилозы крахмала (Wx) у дикорастущих злаков и оценка возможности их использования в улучшении мягкой пшеницы»
ЛИТЕРАТУРА
1. Murai J., Taira T., Ohta D. Isolation and characterization of the three Waxy genes encoding the granule-bound starch synthase in hexaploid wheat // Gene. 1999. V. 234. P. 71-79.
2. Divashuk M. G., Klimushina M. V., Karlov G. I. Molecular genetic characteristics of the Wx-B1e allele from common wheat and applicability of the DNA markers for its identification // Russian Journal of Genetics. 2011. Т. 47. №12. С. 1428-1432.
3. Климушина М. В., Гладких Н. И., Дивашук М. Г., Беспалова Л. А., Васильев А. В., Карлов Г. И. Распределение аллелей генов Wx в коллекции мягкой пшеницы краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16. № 1. С. 187-192.
4. Абдулина И. Р., Вафин Р. Р., Ржанова И. В., Гараева А. Л., Асхадуллин Д. Ф., Василова Н. З., Зайнуллин Л. И., Алимова Ф. К. Молекулярная идентификация генотипов яровой пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов // Фундаментальные исследования. 2013. №1-1. С. 13-17.
5. Bernatzky R., Tanksley S. D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozymes and random cDNA sequences // Genetics. 1986. Vol. 112. P. 887-898.
6. Guzman C., Caballero L., Alvarez J. B. Molecular characterization of the Wx-Bl allelic variants identified in cultivated emmer wheat and comparison with those of durum wheat // Mol. Breeding. 2010. V. 28. P. 403-411.
Поступила в редакцию12.08.2013 г.
