CC BY
7
Научная статья/Research Article УДК 579.62:637.075
DOI: 10.36718/1819-4036-2023-2-158-164
Игорь Владимирович Левин1, Ольга Борисовна Иванченко2
^Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
1igor.lyovin93@mail.ru
2obivanchenko@yandex.ru
СОЗДАНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ЛЕВОФЛОКСАЦИНА И ОЦЕНКА ЕЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ LISTERIA MONOCYTOGENES
Динамика увеличения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов растет ежедневно, хотя за последние несколько десятилетий новых молекул антибиотиков разработано не было. Большие убытки в связи с этим несет животноводство. Одним из решений проблемы антибиотикорезистентности бактерий может быть улучшение уже существующих антимикробных препаратов посредством инкапсулирования действующего вещества в наноконтейне-ры. Цель исследования - получение липосомальной формы левофлоксацина и оценка ее эффективности в отношении Listeria monocytogenes. В ходе работы рассмотрены подходы к созданию липосом как структурам, доставляющим антибиотики к месту действия. Пустые липосомы получали конвекционным методом. Для уменьшения размера липосом была использована обработка в ультразвуковой бане при температуре 20±2 °С и частоте звука 35 кГц. Включение ле-вофлоксацина в липосомы проведено методом активной загрузки, созданием градиента концентрации сульфата аммония. Левофлоксацин растворяли в 1 % растворе уксусной кислоты, после чего инкубировали с ранее подготовленными липосомами. Были получены липосомы левофлок-сацина с концентрацией 1 мг/мл и проведена оценка эффективности липосомального левофлок-сацина в сравнении с обычной формой антибиотика и липосомами, не нагруженными антибиотиком по отношению к клеткам Listeria monocytogenes. Для оценки эффективности антибактериального эффекта была произведена совместная инкубация бактериальной суспензии микроорганизмов Listeria monocytogenes 766 в LMX Broth в течение 24 ч при 37 °С. Показано, что эффективность липосомальной формы отличается от классической. Снижение жизнеспособности тест-объекта при использовании нанокапсулированного левофлоксацина составляет 27,5 % в сравнении с использованием классического левофлоксацина. Липосомы без антибиотика не проявляли антибактериального эффекта вообще.
Ключевые слова: антибиотики, антибиотикорезистентность, липосомы, липосомальная форма, наноконтейнеры
Для цитирования: Левин И.В., Иванченко О.Б. Создание липосомальной формы левофлоксацина и оценка ее эффективности в отношении Listeria monocytogenes // Вестник КрасГАУ. 2023. № 2. С. 158-164. DOI: 10.36718/1819-4036-2023-2-158-164.
Igor Vladimirovich Levin1, Olga Borisovna Ivanchenko2
12Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, Russia
1igor.lyovin93@mail.ru
2obivanchenko@yandex.ru
© Левин И.В., Иванченко О.Б., 2023
Вестник КрасГАУ. 2023. № 2. С. 158-164. Bulliten KrasSAU. 2023;(2):158-164.
LEVOFLOXACIN LIPOSOMAL FORM CREATION AND ITS EFFECTIVENESS EVALUATION AGAINST LISTERIA MONOCYTOGENES
The dynamics of the increase in antibiotic-resistant strains of microorganisms is growing daily, although over the past few decades, new antibiotic molecules have not been developed. As a result, animal husbandry bears great losses. One of the solutions to the problem of antibiotic resistance in bacteria can be to improve existing antimicrobials by encapsulating the active substance in nanocontainers. The aim of the study is to obtain a liposomal form of levofloxacin and evaluate its effectiveness against Listeria monocytogenes. In the course of the work, approaches to the creation of liposomes as structures that deliver antibiotics to the site of action are considered. Empty liposomes were obtained by the convection method. To reduce the size of the liposomes, ultrasonic bath treatment at a temperature of 20±2 °C and a sound frequency of 35 kHz was used. The inclusion of levofloxacin in liposomes was carried out by the active loading method, by creating an ammonium sulfate concentration gradient. Levofloxacin was dissolved in 1 % acetic acid solution, after which it was incubated with previously prepared liposomes. Liposomes of levofloxacin with a concentration of 1 mg/ml were obtained and the effectiveness of liposomal levofloxacin was evaluated in comparison with the usual form of the antibiotic and liposomes not loaded with the antibiotic in relation to Listeria monocytogenes cells. To assess the effectiveness of the antibacterial effect, a bacterial suspension of Listeria monocytogenes 766 microorganisms was co-incubated in LMX Broth for 24 hours at 37 °C. It was shown that the effectiveness of the liposomal form differs from the classical one. The decrease in the viability of the test-object when using nanocapsulated levofloxacin is 27.5 % in comparison with the use of classical levofloxacin. Liposomes without antibiotic showed no antibacterial effect at all.
Keywords: antibiotics, antibiotic resistance, liposomes, liposomal form, nanocontainers
For citation: Levin I.V., Ivanchenko O.B. Levofloxacin liposomal form creation and its effectiveness evaluation against Listeria monocytogenes // Bulliten KrasSAU. 2023;(2): 158-164. (In Russ.). DOI: 10.36718/ 1819-4036-2023-2-158-164.
Введение. Бактериальные инфекции были и остаются одной из важнейших современных проблем, уносят жизни и причиняют огромный экономический ущерб в совершенно разных областях экономики [1-4]. Активно используемые на сегодняшний день антимикробные препараты, из-за нерационального использования и приобретения микроорганизмами резистентности к ним, уже не являются столь эффективными, а дальнейшие прогнозы ученых пугают [5, 6].
Одним из наиболее спорных направлений использования антибиотиков является животноводство. Да, безусловно, в условиях до сих пор не решенной проблемы мирового голода, дефицита белка, увеличения потребности в продукции на фоне продолжающейся эпидемии ООУЮ-19 и тяжелых геополитических обстоятельствах невозможно говорить об отказе от антимикробных препаратов или сокращении применения их в животноводстве, однако в странах Европы на сегодняшний день реализуются направленные на это стратегии [7, 8].
Также необходимо отметить, что увеличение темпов производства неизбежно влечет за собой
и увеличение контрафактной продукции, а именно - остаточное количество антибиотиков в продукции животного происхождения [9]. В ветери-нарно-санитарных правилах установлены сроки, при которых животному перестают давать антибиотики в лечебных или профилактических целях перед убоем, однако на практике нередко ветеринарные врачи, боясь экономических потерь, данные сроки не соблюдают [10]. Результатом этого является наличие в готовом продукте остаточных количеств антибиотиков и дальнейшее накопление их в организме человека [11].
Для решения данных проблем возможно использование стратегии повышения эффективности антимикробных препаратов [12]. Одним из перспективных направлений по данной теме является инкапсулирование биологически активных веществ в наноразмерные контейнеры. Из большого разнообразия наноконтейнеров, которые рассматриваются в качестве переносчиков антибиотиков, особо выделяются на текущий момент липосомы [13].
Липосомы - однослойные или многослойные липидные визикулы, содержащие в своем внут-
реннем слое водное ядро. Строение липосомы позволяет включать в ее состав различные биологически активные вещества, что открывает широкие перспективы и позволяет добиться ряда преимуществ:
• снижение для организма токсичности многих препаратов позволяет использовать препараты с низким терапевтическим индексом;
• включение в липосомы препаратов повышает их защиту от инактивирующих их агентов;
• липосомы биосовместимы с клетками организма, так как основным компонентом для их создания являются природные фосфолипиды. Они не являются токсичными для организма, легко биодеградируемы, не вызывают иммунных реакций [14].
Также необходимо отметить, что липосомы возможно модифицировать для достижения желаемых функций, например покрытие липосом оболочкой из полиэтиленгликоля позволяет повысить устойчивость и предотвратить неспецифическое всасывание, а установление на поверхности липосомы специфического лиганда дает возможность осуществления направленного транспорта к клеткам-мишеням [13-15].
Цель исследований - разработка и получение липосомальной формы левофлоксацина и оценка ее эффективности в отношении Listeria monocytogenes.
Задачи: создание липосом и липосомальной формы левофлоксацина; исследование эффек-
тивности липосомальной формы левофлоксацина в отношении Listeria monocytogenes.
Материалы и методы. Для создания липосомальной формы левофлоксацина в исследовании использовались следующие материалы: соевый лецитин (Lecigran M, Россия), холестерин (PanReac Applichem, США), левофлоксацин (Millipore, Sigma-Aldrich, Supelco, США), сульфат аммония (Merk, Германия), хлороформ ХЧ (Компонент-реактив, Россия), физиологический раствор, уксусная кислота (PanReac Applichem, США).
Получение липосом с включенным антибиотиком проходило в несколько стадий. На первой стадии получали пустые липосомы конвекционным методом. Лецитин и холестерин с соотношении 7:3 помещали в круглодонную колбу и растворяли в хлороформе. Далее колбу помещали в роторный испаритель RV10 digital V (IKA, Германия) и отгоняли хлороформ под вакуумом при температуре 37 °С и скорости вращения 90 об/мин, до полного удаления хлороформа в колбе. Образовавшуюся липидную пленку регидратировали 0,3 М раствором сульфата аммония до концентрации липидов 1 мг/мл, в результате была получена суспензия липосом различного размера и строения (рис. 1). Для отделения не включившегося в ли-посомы сульфата аммония использовался метод диализного мешка.
Рис. 1. Полученная суспензия «пустых» липосом разного размера и строения (*10)
Включение левофлоксацина в липосомы было проведено методом активной загрузки, созданием градиента концентрации сульфата аммония. Левофлоксацин растворяли в 1 % р-ре уксусной кислоты, после чего инкубировали с ранее подготовленными липосомами в течение 20 мин при температуре 50 °С на водяной бане ПЭ-4312 (Экохим, Россия) [16].
Количественная оценка микроорганизмов проводилась c помощью автоматического анализатора Tempo (ЫоМепеих,Франция) и коммерческого набора для оценки общей микрофлоры Tempo AC (ЫоМепеих,Франция). Исследования проводились в 5-кратной повторности. Рассчитывали среднее арифметическое значение, среднеквадратичное отклонение результатов и доверительный интервал при вероятности а = 0,95.
Результаты и их обсуждение. Одним из наиболее важных свойств липосом является их размер [17]. Для уменьшения размера липосом была использована обработка в ультразвуковой бане Elmasonic S 150 (ELMA, Швейцария) при температуре 20±2 °С и частоте звука 35 кГц. Как известно, увеличение дисперсности липо-сом сопровождается увеличением оптической плотности. Время воздействия ультразвука определяли экспериментально. Замеры оптической плотности проводили на спектрофотометре UNICO 2800 (UNICO, США) при длине волны 640 нм и толщине слоя 10 мм. Обработку ультразвуком проводили до тех пор, пока оптическая плотность суспензии не переставала изменяться, что свидетельствует о достижении максимально возможной дисперсности системы при используемых технологических параметрах, результаты представлены на рисунке 2.
280
<
л h О
0
1 h О
4 С
и о <и
ÍT
5 h С
О
270
260
250
240
230
220
210
200
5 10 15 20 25 30 Продолжительность обработки, мин
35
0
Рис. 2. Зависимость оптической плотности (А) от продолжительности ультразвуковой обработки
Для определения количества левофолокса-цина, которое возможно включить в липосомы при используемом соотношении липидов, был проведен ряд опытов с различной концентрацией антибиотика.
После инкубации 1 мл опытной суспензии фильтровали через нейлоновые фильтрующие насадки c диаметром пор 0,2 мкм Millipore (Merk, Германия). Фильтрат исследовали на наличие
антибиотиков группы хинолонов методом мультиплексного иммунно-ферментного анализа на полуавтоматическом анализаторе Кап^х ЕпуеБ-ИдаЬг (Randox, Великобритания).
При концентрации 1 мг/мл наблюдается наличие антибиотиков хинолоной группы, что свидетельствует о максимально возможном пределе включения левофлоксацина в липосомы.
Для оценки эффективности антибактериального эффекта была произведена совместная инкубация бактериальной суспензии микроорганизмов Listeria monocytogenes 766 в LMX Broth (bioMeriux, Франция) в течение 24 ч при 37 °C. Исходное количество микроорганизмов в суспензии составляло 105 КОЕ/мл, с классической формой антибиотика, полученной липосомаль-ной суспензией с антибиотиком и липосомаль-ной суспензией без антибиотика. Поскольку минимальная подавляющая концентрация лево-
флоксацина в отношении Listeria monocytogenes составляет 1-2 мг/л, липосомальная суспензия с антибиотиком была разведена до концентрации 2 мкг/мл [18]. Полученные результаты представлены в таблице. Контрольный образец представляет собой питательную среду без добавлений, поскольку минимальный предел обнаружения прибора составляет 100 КОЕ/мл, то есть значение менее 100 интерпретируется как стерильный образец.
Количественная оценка микроорганизмов Listeria monocytogenes после инкубации с классической формой антибиотика, липосомальной формой антибиотика и пустыми липосомами, КОЕ/мл
Показатель Значение
Липосомальная суспензия с левофлоксацином 3,72 ■ 106 ± 0,78 ■ 106
Классический левофлоксацин 5,1 ■ 106 ± 0,78 ■ 106
«Пустые» липосомы Более 1,0 -108 ± 0,78 ■ 106
Суспензия микроорганизмов без добавления левофлоксацина Более 1,0 ■ 108 ± 0,78 ■ 108
Контроль Менее 100
Заключение. В ходе работы были получены липосомы левофлоксацина с концентрацией 1 мг/мл и проведена лабораторная оценка эффективности липосомального левофлоксацина в сравнении с обычной формой антибиотика и ли-посомами, не нагруженными антибиотиком. По результатам исследования можно заключить, что по эффективности липосомальная форма незначительно отличается от классической. Зафиксировано снижение числа жизнеспособных клеток на 27,5 %. Кроме этого, как показывают данные литературы, одним из главных преимуществ ли-посомальной формы лекарств является долгая элиминация из организма, следовательно, для более информативной и корректной оценки эффективности необходимо провести дальнейшие исследования с использованием макроорганизмов. Липосомы без антибиотика не проявляли антибактериального эффекта.
Список источников
1. Видовой состав и оценка производственных потерь при субклинических маститах коров в хозяйствах Костанайской области (Казахстан) / Г.Д. Чужебаева [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2021. № 11. С. 116-122.
Disability weights for the Global Burden of Disease 2013 study / J.A. Salomon [et al.] // Lancet Glob Health. 2015. № 1. Р. 712-723. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2020 году: государственный доклад / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. М., 2021. 256 с. Михеева М.А., Михеева И.В. Динамика рейтинга экономического ущерба от инфекционных болезней как критерий эффективности эпидемиологического контроля // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020. № 2. С. 174-181. Намазова-Баранова Л.С, Баранов А.А. Ан-тибиотикорезистентность в современном мире // Педиатрическая фармакология. 2017. № 14 (5). С. 341-354. Оценка риска появления резистентности к антибиотикам условно-патогенной и патогенной микрофлоры, выделяемой из продуктов животного происхождения / А.М. Мен-дыбаева [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2022. № 2. С. 147-156. DOI: 10.36718/1819-40362022-2-147-156.
7. Щепеткина С.В. Антибиотики в птицеводстве: запретить нельзя нормировать // Эффективное животноводство. 2019. № 4 (152). С. 80-84.
8. Ветвицкая А. Мифы и реальность замены антибиотиков в птицеводстве // Эффективное животноводство. 2020. № 7 (164). С. 52-57.
9. Батаева Д.С., Зайко Е.В. Риски, связанные с наличием в мясе и в продуктах убоя животных остаточных количеств антимикробных препаратов // Теория и практика переработки мяса. 2016. № 3. С. 4-12.
10. Детекция патогенных микроорганизмов рода LISTERIA методом полимеразной цепной реакции в реальном времени / Е.В. Соколова [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2020. № 12. С. 117-125.
11. Заугольникова М.А., Вистовская В.П. Изучение контаминации животноводческой продукции остаточными количествами антибиотиков // Acta Biológica Sibirica. 2016. № 3. С. 9-20.
12. Эффективность применения липосомаль-ных форм антибиотиков при лечении некоторых инфекционных заболеваний в эксперименте / Г.К. Исмаилова [и др.] // Вестник ВолГМУ. 2007. № 1 (21). С. 69-72.
13. Липосомы как система таргетной доставки лекарственных средств (обзор) / В.С. Горбик [и др.] // Российский биотерапевтический журнал. 2021. № 1. С. 33-41.
14. Толчева Е.В., Оборотова Н.А. Липосомы как транспортное средство для доставки биологически активных молекул // Российский биотерапевтический журнал. 2006. № 1. С. 54-61.
15. Пат. 2014112220. Российская Федерация МПК A61K 39/39. Пегтлированные липосомы для доставки кодирующей иммуноген РНК / Джилл Эндрю, Верма Аюш; заявитель и патентообладатель Новартис А.Г. № 2014112220/10; заявл. 31.08.2012; опубл. 07.03.2013, Бюл. № 28.
16. Создание и изучение свойств липосомаль-ной формы левофлоксацина / Г.М. Соро-коумова [и др.] // Тонкие химические технологии. 2013. № 8 (5). C. 72-76.
17. Характеристика и оценка стабильности ли-посомальных препаратов / М.В. Дмитриева
[и др.] // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2018. № 3. С. 36-44.
18. Падейская Е.Н. Фармакокинетика левофлоксацина как основа режима дозирования и оптимизации схем лечения // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2005. № 2. С. 58-71.
References
1. Vidovoj sostav i ocenka proizvodstvennyh poter' pri subklinicheskih mastitah korov v hozyajstvah Kostanajskoj oblasti (Kazahstan) / G.D. Chuzhebaeva [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2021. № 11. S. 116-122.
2. Disability weights for the Global Burden of Disease 2013 study / J.A. Salomon [et al.] // Lancet Glob Health. 2015. № 1. P. 712-723.
3. O sostoyanii sanitarno-'epidemiologicheskogo blagopoluchiya naseleniya v Rossijskoj Fede-racii v 2020 godu: gosudarstvennyj doklad / Federal'naya sluzhba po nadzoru v sfere za-schity prav potrebitelej i blagopoluchiya chelo-veka. M., 2021. 256 s.
4. Miheeva M.A., Miheeva I.V. Dinamika rejtinga 'ekonomicheskogo uscherba ot infekcionnyh boleznej kak kriterij 'effektivnosti 'epidemio-logicheskogo kontrolya // Zhurnal mikrobio-logii, epidemiologii i immunobiologii. 2020. № 2. S. 174-181.
5. Namazova-Baranova L.S., Baranov A.A. Anti-biotikorezistentnost' v sovremennom mire // Pediatricheskaya farmakologiya. 2017. № 14 (5). S. 341-354.
6. Ocenka riska poyavleniya rezistentnosti k antibiotikam uslovno-patogennoj i patogennoj mikroflory, vydelyaemoj iz produktov zhivotno-go proishozhdeniya / A.M. Mendybaeva [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2022. № 2. S. 147-156. DOI: 10.36718/1819-4036-2022-2-147-156.
7. Schepetkina S.V. Antibiotiki v pticevodstve: zapretit' nel'zya normirovat' // 'Effektivnoe zhivotnovodstvo. 2019. № 4 (152). S. 80-84.
8. Vetvickaya A. Mify i real'nost' zameny antibio-tikov v pticevodstve // 'Effektivnoe zhivotnovodstvo. 2020. № 7 (164). S. 52-57.
9. Bataeva D.S., Zajko E.V. Riski, svyazannye s nalichiem v myase i v produktah uboya zhivot-nyh ostatochnyh kolichestv antimikrobnyh
preparatov // Teorlya i praktlka pererabotkl myasa. 2016. № 3. S. 4-12.
10. Detekclya patogennyh mikroorganizmov roda LISTERIA metodom pollmeraznoj cepnoj reak-cll v real'nom vremenl / E.V. Sokolova [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2020. № 12. S. 117-125.
11. Zaugol'nikova M.A., Vistovskaya V.P. Izuche-nle kontaminacii zhivotnovodcheskoj produkcll ostatochnyml kollchestvaml antibiotikov // Acta Biológica Sibirica. 2016. № 3. S. 9-20.
12. Effektlvnost' primeneniya llposomal'nyh form antibiotikov prl lechenll nekotoryh infekcionnyh zabolevanlj v 'eksperlmente / G.K. Ismailova [i dr.] // Vestnik VolGMU. 2007. № 1 (21). S. 69-72.
13. Llposomy kak sistema targetnoj dostavkl lekar-stvennyh sredstv (obzor) / V.S. Gorbik [i dr.] // Rossijskij bloterapevtlchesklj zhurnal. 2021. № 1. S. 33-41.
14. Tolcheva E.V., Oborotova N.A. Llposomy kak transportnoe sredstvo dlya dostavkl blologl-
cheskl aktlvnyh molekul // Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal. 2006. № 1. S. 54-61.
15. Pat. 2014112220. Rossljskaya Federaclya MPK A61K 39/39. Pegtllrovannye llposomy dlya dostavkl kodlruyuschej immunogen RNK / Dzhill 'Endryu, Verma Ayush; zayavltel' i paten-toobladatel' Novartis A.G. № 2014112220/10; zayavl. 31.08.2012; opubl. 07.03.2013, Byul. № 28.
16. Sozdanle i izuchenie svojstv llposomal'noj for-my levofloksacina / G.M. Sorokoumova [i dr.] // Tonkie himicheskie tehnologii. 2013. № 8 (5). C. 72-76.
17. Harakteristika i ocenka stabll'nostl llposomal'nyh preparatov / M.V. Dmitrieva [i dr.] // Razra-botka i registraciya lekarstvennyh sredstv. 2018. № 3. S. 36-44.
18. Padejskaya E.N. Farmakokinetika levofloksa-clna kak osnova rezhlma dozlrovanlya l optl-mlzacll shem lechenlya // Farmakoklnetlka l farmakodinamika. 2005. № 2. S. 58-71.
Статья принята к публикации 22.11.2022 / The article accepted for publication 22.11.2022. Информация об авторах:
Игорь Владимирович Левин1, магистрант высшей школы биотехнологии и пищевых производств Ольга Борисовна Иванченко2, доцент высшей школы биотехнологии и пищевых производств, кандидат биологических наук, доцент
Information about the authors:
Igor Vladimirovich Levin1, Master Student at the Higher School of Biotechnology and Food Production Olga Borisovna Ivanchenko2, Associate Professor at the Higher School of Biotechnology and Food Production, Candidate of Biological Sciences, Associate Professor
