CC BY
66
УДК 615.014.2
© Е.В. Симонян, Ю.В. Шикова, 2016
Е.В. Симонян1, Ю.В. Шикова2 ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ АЛЬБУМИНА И ЭКСТРАКТА ПРОПОЛИСА
'ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск 2 ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа
Подобраны оптимальные условия получения липосомальной лекарственной формы альбумина и экстракта прополиса. Исследован процесс включения лекарственных средств в липосомальную мембрану в зависимости от различных факторов. Максимальная степень включения альбумина наблюдается после обработки ультразвуком. Для повышения стабильности липосомальной лекарственной формы предложено использовать лиофилизацию. Подобраны криопротектор и условия проведения лиофилизации. Для оценки степени включения альбумина использовали гель- хроматографию. На выходе из колонки получали две фракции: очищенный липосомальный препарат и не включившийся в липосомы альбумин. Собранные фракции использовали для дальнейшего количественного анализа и оценки эффективности включения методом УФ-спектрофотометрии по реакции с бриллиантовым зеленым. Для повышения стабильности липосомальной мембраны в качестве антиоксиданта предложено вводить экстракт прополиса. По реакции с тиобарбитуровой кислотой установили, что концентрация малонового диальдегида изменяется незначительно. Индекс окисляемости липосом в присутствии прополиса также изменяется недостоверно.
Ключевые слова: альбумин, экстракт прополиса, липосомы, криопротектор, лиофилизация, малоновый диальдегид, ти-обарбитуровая кислота.
E.V. Simonyan, Yu.V. Shikova THE CHOICE OF OPTIMAL CONDITIONS FOR OBTAINING LIPOSOMAL FORMULATIONS OF ALBUMIN AND PROPOLIS EXTRACT
The study determined optimum conditions for obtaining liposomal formulations of albumin and extract of propolis. The process of inclusion of medicines in the liposomal membrane, depending on various factors has been studied. The maximum degree of inclusion of albumin was observed after processing with ultrasound. Lyophilization has been suggested in order to o increase the stability of liposomal formulations. Cryoprotectant and conditions for lyophilization have been selected. To assess the degree of inclusion of albumin gel chromatography was used. Two outlet fractions were obtained: purified liposomal drug and albumin not included in the liposomes. The collected fraction was used for further quantitative analysis and evaluation of the effectiveness of the inclusion by the method of spectrophotometry by reaction with brilliant green. It is suggested to add propolis extract as an antioxidant to increase the stability of liposomal membranes. Reaction with thiobarbituric acid showed that the concentration of malondialdehyde varies slightly. The index of the oxidability of liposomes in the presence of propolis also changes unreliably.
Key words: albumin, propolis extract, liposomes, cryoprotectants, lyophilization, malonic dialdehyde, thiobarbituric acid.
Липосомы - это микроскопические сферические частицы, оболочка (мембрана) которых состоит из молекул липидов, чаще всего -фосфолипидов. Как известно, липиды - это гидрофобные соединения, т.е. соединения, отталкивающие от себя молекулы воды; они являются одним из основных компонентов биологических клеточных мембран, создающих в организме энергетический резерв, а также способные образовывать защитные покровы. Это особенно важно, поскольку включенные в ли-посомы лекарственные средства становятся более устойчивыми в организме, так как полностью защищены от повреждающих воздействий внешних условий и в меньшей степени оказывают общетоксическое действие на организм [1]. В связи с этим актуальным является вопрос о создании новых лекарственных форм с белковыми компонентами.
Целью исследования явился подбор оптимальных условий получения липосомаль-ной лекарственной формы альбумина и экстракта прополиса.
Материал и методы. В качестве объекта исследования нами был выбран альбумин,
который широко применяется для лечения тяжелых патологий, связанных с потерей плазменного белка. Кроме того, он обладает регенерирующими свойствами. Однако его лекарственные формы в основном представлены только инфузионными растворами.
Для получения липосом использовали метод обращения фаз [2]. В качестве компонента липосомальной эмульсии предложен лецитин, содержащий комплекс фосфолипидов. В предварительных исследованиях установлено, что альбумин образует прочные связи с полиэтиленгликолями (ПЭГ) различной молекулярной массы, препятствующими его высвобождению [3]. Поэтому использовать их в качестве компонента оболочки нецелесообразно.
Для исследования процесса включения альбумина в лекарственную форму использовали процесс гель-хроматографирования с последующим определением альбумина методом УФ-спектрофотометрии. Гель-хроматографию осуществляли на колонке C 10/20 (Amersham Biosciences, Швеция). Диаметр колонки 10 мм, высота колонки 20 см, объем колонки 14 мл, высота геля в колонке 18 см. Материалы для
хроматографии (гель-фильтрация, ТСХ) Сефа-декс (Sephadex) G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Швеция). Для определения эффективности включения лекарственных средств на хроматографическую колонку C 10/20, заполненную сефадексом G-50 и предварительно уравновешенную 0,15 М раствором хлорида натрия (при скорости 0,5 мл/мин), наносили 1 мл липосомальной дисперсии. На выходе из колонки получали две фракции: 1 - очищенный липосомальный препарат; 2 - не включившийся в липосомы альбумин. Собранные фракции использовали для дальнейшего количественного анализа и оценки эффективности включения методом УФ-спектрофотометрии по реакции с бриллиантовым зеленым.
Результаты и обсуждение
Эффективность включения альбумина при использовании метода обращения фаз составила около 60%.
Для повышения эффективности включения альбумина повышение температуры нецелесообразно, поскольку происходит денатурация белка. В связи с этим нами предпринята попытка получения липосом методом обращения фаз с предварительной обработкой ультразвуком. Раствором альбумина гидрати-ровали пленку фосфолипида после полного удаления органического слоя. Обработку ультразвуком проводили несколько раз с целью выбора оптимальных условий.
Установлено, что для оптимального включения альбумина достаточно двукратной обработки ультразвуком. В этом случае эффективность включения альбумина максимальная - 91,2%.
При многократной обработке ультразвуком происходит частичная денатурация белка и липосомы расслаиваются при стоянии (белок выпадает в осадок).
Поскольку альбумин - это крупная молекула, способная к агрегации, то нами проведен цикл экструдирования. Установлено, что стабильные молекулы с размером частиц 192±3 нм получены после 9 циклов экструзии. При увеличении количества циклов уменьшается эффективность включения альбумина в липосомы (таблица).
В процессе изучения стабильности было установлено, что альбумин является средой для развития микроорганизмов, что приводит к уменьшению срока хранения липосомаль-ной дисперсии. Поэтому целесообразно было использовать лиофилизацию с предварительным введением криопротектора. Для этих целей использовали сахарозу, глюкозу и лактозу в концентрации от 5 до 15%. Предварительно
изучили влияние криопротектора на размер везикул до и после лиофилизации. В этом случае может происходить укрупнение молекул, поэтому экструзию проводили через фильтры с размером пор 400 нм. Оптимальные результаты получены при использовании в качестве криопротекора сахарозы в концентрации 10%. Для стабилизации процесса хранения липосом разрабатывали режим лиофи-лизации. Свежеприготовленную липосомаль-ную дисперсию дозировали по 1 мл во флаконы вместимостью 10 мл. Флаконы с липосо-мальным альбумином замораживали при температуре -80 °С в течение 3 часов, а затем выдерживали при температуре -50 °С в течение 30 минут. В течение последующих трех часов температуру повышали до -10 °С под давлением 0,530 мБар, затем доводили температуру до - 5°С и оставляли на 1 час. После чего, создавая давление 0,9 мБар, устанавливали температуру 0°С, и в таком режиме липосомаль-ная суспензия выдерживалась 1 час. После этого повышали температуру до +20°С.
Таблица
Изменение размера липосом и эффективности включения альбумина в них в зависимости от количества циклов экструзии
Количество Размер липосом Эффективность
циклов экструзии после экструзии, нм включения альбумина, %
1 163±4 91,4
2 167±2 90,8
3 175±5 91,2
4 177±4 90,6
5 181±3 91,4
6 184±2 91,7
7 186±3 90,8
8 187±4 92,1
9 186±3 92,6
10 182±1 89,6
11 187±3 85,4
12 190±3 85,1
В процессе хранения липосом и препаратов, полученных на их основе, наблюдается окисление липидов с образованием малонового диальдегида и гидроперекисей липидов, а также увеличивается содержание непредельных группировок в липидах. Подобные изменения напрямую отражаются на стабильности липо-сомальной мембраны и могут приводить к снижению времени сохранения целостности мембраны и разрушению липосомального препарата. Введение в препарат стабилизирующих добавок может как ингибировать процесс окисления, так и ускорять его. В связи с этим нами были приготовлены пустые липосомы и липосомы с альбумином по предложенной выше методике, а также липосомы с альбумином и экстрактом прополиса. Экстракт прополиса 10%, приготовленный с использованием спирта этилового 70%, вводился в фосфоли-
пидную пленку до гидратирования ее раствором лекарственного вещества. Готовые липо-сомы хранились в морозильной камере при -20оС. Забор образцов для исследования производился на 1, 2, 6, 10-е сутки хранения в объеме 1 мл. Полученные образцы инкубировались при температуре +37оС. В них определяли содержание малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК -активные продукты) (рисунок).
12
10
1 2 3 4 5 6
Исследуемые образцы
■ первый день □ второй день
■ шестой день □ десятый день
Рис. Динамика накопления малонового диальдегида в липосо-мах: 1 - пустые липосомы; 2 - липосомы с альбумином; 3 -липосомы с альбумином и экстрактом прополиса; 4 - пустые липосомы с добавлением раствора пероксида водорода; 5 -липосомы с альбумином с добавлением раствора пероксида водорода; 6 - липосомы с альбумином и экстрактом прополиса с добавлением раствора пероксида водорода
Было установлено, что в пустых липо-сомах наблюдается существенное увеличение ТБК-активных продуктов уже к 10-му дню. В присутствии пероксида водорода этот процесс ускоряется и увеличение их концентрации более чем на 30% происходит уже на второй день. Присутствие альбумина снижает динамику накопления МДА, однако при наличии пероксид-ионов также концентрация ТБК-продуктов на второй день повышается на
25%. Незначительное уменьшение концентрации МДА в присутствии альбумина указывает на наличие антиоксидантного действия препарата. Однако для увеличения стабильности целесообразно вводить антиоксиданты, которые потенциируют данный эффект альбумина. Присутствие спиртового экстракта прополиса значительно увеличивает срок годности липосомальной лекарственной формы. В присутствии пероксида водорода только на 10-й день наблюдается существенное изменение концентрации МДА. Для подтверждения полученных данных нами был определен пе-рекисный индекс Кляйна (индекс окисления ИО), который характеризует степень окис-ленности фосфолипида по содержанию конъ-югированных диенов. Установлено, что ИО в пустых липосомах к концу 10-го дня увеличился на 32,25% по сравнению с исходным значением. В липосомах с альбумином и содержащих альбумин и экстракт прополиса этот показатель составил 20,0% и 16,7% соответственно. Причем значение ИО в липосомах с альбумином на 10-е сутки было ниже данного показателя пустых свежеприготовленных липосом. Присутствие в качестве антиокси-данта экстракта прополиса уменьшает величину данного показателя.
Выводы
1. Предложены оптимальные условия для получения липосомальной лекарственной формы альбумина с экстрактом прополиса. Изучено влияние различных факторов на стабильность липосом. Разработаны режимы лиофилизации.
2. Исследована динамика накопления малонового диальдегида в липосомах с альбумином. Показано снижение интенсивности окисления лекарственной формы в присутствии экстракта прополиса.
Сведения об авторах статьи: Симонян Елена Владимировна - к.фарм.н., доцент, зав. кафедрой химии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России. Адрес. 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. E-mail: elenasimonian@yandex.ru. Шикова Юлия Витальевна - д.фарм.н., доцент, зав. кафедрой фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450058, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: shikmann@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
Балкина, А.С. Липосомальные формы белковых ингибиторов протеиназ: получение и специфическая активность/ А.С. Балкина, А.А. Селищева, Н.И. Ларионова// Биомедицинская химия. - 2008. - Т. 54, № 5. - С. 561-569.
Разработка технологии получения липосомальной лекарственной формы с кислотой янтарной и экстрактом прополиса // Е.В. Симонян [и др.]// Фундаментальные исследования. - 2015. - N° 2. - С. 1432- 1435.
Средство с альбумином и экстрактом прополиса, обладающее репаративной активностью при анемиях различного генеза/ Ю.В. Шикова [и др.] // Патент на изобретение RUS 2571071 06.05.2014
1.
2.
3
