CC BY
60
DOI: 10.23868/202104002
СОЗДАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
А.С. Могиленских, С.В. Сазонов По^утт:28.11.2020
Принята к печати: 10.04.2021
Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия Опубликована on-line: 12.04.2021
Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург,
Россия
ESTABLISHMENT OF BREAST CARCINOMA CELL LINES
A.S. Mogilenskikh, S.V. Sazonov
Institute of Medical Cell Technologies, Yekaterinburg, Russia Ural State Medical University, Yekaterinburg, Russia
e-mail: prof-ssazonov@yandex.ru
Получение первичной культуры из клеток карциномы молочной железы необходимо как для изучения молекулярных и клеточных механизмов роста опухоли, так и для подбора персонализированной терапии. Однако при получении таких культур возникают технические сложности: плохая адгезия к подложке, повышенный рост фибробластов в культуре, раннее старение и другие. В обзоре описаны основные варианты культивирования клеток карциномы молочной железы — двухмерные культуры, трехмерные культуры, срезы тканей, а также рассмотрены способы их получения. Представлены результаты исследований по изменению рецепторного аппарата в процессе культивирования и оценке влияния противоопухолевых препаратов на клетки карциномы молочной железы in vitro.
Ключевые слова: карцинома молочной железы, первичная культура клеток, маммосферы, молекулярно-биологические подтипы карциномы молочной железы.
Obtaining of a primary cell culture of breast carcinoma is necessary both for the study of molecular and cellular mechanisms of tumor growth and for the selection of personalized therapy. However, when obtaining such culture, technical difficulties arise: poor adhesion to the substrate, increased growth of fibroblasts in culture, early aging, and others. The review describes the main options for culturing breast carcinoma cells — two-dimensional cultures, three-dimensional cultures, tissue sections, and also discusses methods for their preparation. The results of studies on changes in the receptor apparatus during cultivation and assessment of the effect of anticancer drugs on breast carcinoma cells in vitro are presented.
Keywords: breast carcinoma, primary cell culture, mammo-spheres, molecular biological subtypes of breast carcinoma.
Введение
Постоянные клеточные линии давно применяют для оценки in vitro подходов к лечению, диагностике, профилактике онкологических заболеваний. Они представляют собой уникальный объект исследования молекулярных и клеточных механизмов роста опухоли и анализа эффективности лекарственных препаратов [1]. Существует большое количество иммортализо-ванных клеточных линий карциномы молочной железы (КМЖ), более того, банк клеточных культур постоянно расширяется — появляются новые бессмертные клеточные линии с неограниченным числом пассажей [2], клеточные линии, полученные из циркулирующих в крови клеток [3], клеток плеврального выпота [4] и клеток различных подтипов кМж [5, 6]. Однако, КМЖ, как и другие опухоли, имеет высокую степень гетерогенности, поэтому в клеточной линии высока вероятность появления генетических и молекулярных изменений из-за большого количества пассажей [7].
J.P. Gillet с соавт. (2011) сравнивали полученные клеточные линии с клиническими образцами кМж и обнаружили, что все клеточные линии имеют большее сходство друг с другом, чем с клиническими образцами, которые они должны моделировать [8]. Эти проблемы, возникающие при использовании иммортализованных линий, приводят к более широкому применению первичных культур клеток, эксплантов клеток из первичной опухоли, а также клеточных линий раннего пассажа для повышения точности результатов при разработке лекарственных препаратов. В последние несколько лет к первичным культурам клеток проявляют все больший интерес, поскольку такие культуры имитируют опухолевое состояние in vivo лучше, чем постоянные клеточные линии [9, 10].
Получение первичной культуры из солидных опухолей приобрело большое значение в персонализированной терапии рака. Несмотря на многочисленные достоинства,
такие культуры имеют и недостатки: потеря эпителиальной природы при диссоциации, генетический дрейф при поддерживании культуры, технические сложности при ее получении, недостаточное воспроизведение микроокружения опухоли [11].
С развитием клеточных технологий предлагают все больше вариантов получения первичных культур: 2й-монослойные, 313-сфероиды, органоиды, срезы тканей. Какой из вариантов лучше подходит под те или иные цели исследования, в чем минусы и плюсы каждого из них, может ли культура клеток соответствовать клеткам ex vivo, эти и другие вопросы возникают при создании и использовании первичной культуры.
Получение первичной культуры из клеток
карциномы молочной железы
Первичная культура — культура клеток, полученная непосредственно из тканей опухоли пациента до первого пересева. Такая культура, с одной стороны, обладает характеристиками, более близкими к условиям ex vivo, поскольку содержит не только опухолевые клетки, но и включает элементы микроокружения: стромальные компоненты, клетки иммунной системы, клетки эндотелия сосудов, то есть все, что окружает опухоль в организме. С другой стороны, при получении таких культур возникает несколько проблем. Первой проблемой является низкое качество хирургического материала: получение образца из некротизированной области, контаминация клеток, длительная транспортировка образца из хирургического отделения в лабораторию, несоблюдение температурного режима при транспортировке. Эта проблема носит в большей степени организационный характер, а при развитии технологий персонализированной медицины и обоюдной заинтересованности со всех сторон (пациента, врача, сотрудников лаборатории) ее можно решить.
/ ч
Клетки карциномы молочной
железы \___/
S-\
Almari и
др.[18]
<-\
Janic и др.[17]
/-N
покрытие
Geltrex® <_>
/-\
среда ВСMP и фидерный
слой s_
t--
среда ВСMP покрытие Geltrex®
/-\
среда ВСMPпокрыт
ие коллаген I <_*
/-\
среда EpiCult покрытие Geltrex® i ¿
>
/-\
одинаковый рост клеток вне зависимости от
покрытия _
t-—N
меньший
рост клеток, чем в среде BCMP
(-\
среда Epicult
при создании аллотрансплантата эффективнее
среда CRC ч_>
уменьшает загрязненение фибробластами V_
Рис. 1. Схема экспериментального рабочего процесса — различные способы получения первичной культуры карциномы молочной железы
Вторая проблема возникает при выделении клеток из образцов. Существует механическая, химическая и ферментативная диссоциация клеток. От способа диссоциации зависит не только количество живых клеток в культуре, но и ее состав. В случае с КМЖ в образцах опухоли присутствует большое количество фибробла-стов. Фибробласты — стромальный компонент опухоли и важная часть микроокружения, но при культивировании они быстро приспосабливаются к условиям in vitro и пролиферируют гораздо быстрее, чем эпителиальные клетки, что ведет к потере эпителиальной природы клеток в культуре [12, 13].
Более 20 лет назад H.M. McCallum и G.W. Lowther (1996) разработали методику выделения клеток из ткани опухоли с применением механической диссоциации: образец опухоли разрезали на тонкие пласты и собирали клетки, мигрирующие в питательную среду [14]. С помощью этого метода авторы смогли получить 10 клеточных линий из 135 образцов опухолей молочной железы.
А.А. Нуштаева (2019) в своей работе описала метод выделения клеток КМЖ из среды, используемой для транспортировки образцов и объединенной с раствором после промывания и измельчения образцов ткани, сравнила полученные культуры с культурами, полученными после воздействия коллагеназы и показала, что клетки, выделенные по ее методу, обладали большей адгезивной способность (они прикреплялись к подложке в течение 36 ч., в отличие от клеток, полученных методом ферментативной диссоциации, которые адгезировали в течение 72 ч.) и имели эпителиоподобный фенотип [15].
Следующая проблема относится к получению клеточной линии из первичной культуры — поддержание эпителиальной природы клеток в ходе нескольких пассажей с помощью подбора соответствующей питательной среды.
Такую линию можно использовать для дальнейшего изучения свойств опухолевых клеток и сравнения их молекулярно-биологических характеристик с характеристикой клеток ex vivo, что позволит оценить их изменчивость в среде in vitro. Как было сказано выше, при выделении клеток из образца, в культуру может попасть
какое-то количество фибробластов, которые будут размножаться быстрее и изменят фенотип клеток в культуре. Помимо фибробластов, в ней могут оказаться также нормальные клетки эпителия молочной железы, что приведет к отсутствию рецепторов, характерных для КМЖ.
Чаще всего данную проблему решают подбором питательной среды, в которой клетки КМЖ более эффективно растут и составляют конкуренцию другим клеткам. Например, такой средой может быть питательная среда, дополненная ингибитором Rho-киназы (ROCK), гидрокортизоном и холерным токсином. [16].
В 2016 г. K. Janik с соавт. сравнивали рост культуры клеток рака молочной железы в коммерческой среде EpiCult и тканеспецифичной среде ВСMP и показали, что в коммерческой среде количество клеток меньше, даже при добавлении ингибитора ROCK (рис. 1) [17].
A.M. Almari с соавт (2016) также сравнивали воздействие на рост культуры клеток КМЖ двух культуральных сред — EpiCult и CRC и обнаружили, что при культивировании в среде CRC не только увеличивалось общее количество клеток в культуре, но также уменьшалось загрязнение культуры фибробластами (рис. 1) [18]. Однако при создании аллотрансплантанта быстрее размножались клетки, культивируемые в среде EpiCult. Следует отметить, что использование CRC способствует сохранению морфологии эпителиальных клеток, но не приводит к полному сохранению транскриптома рака в процессе культивирования [18].
В вышеописанной работе была использована среда, содержащая холерный токсин (CRC) [18]. Однако другие исследователи—J. Esparza-López с соавт. (2016) не добавляли в среду для культивирования первичной культуры RPMI 1640 холерный токсин, тем не менее, клетки хорошо пролиферировали, что может свидетельствовать о том, что холерный токсин не является основным компонентом, необходимым для роста клеток КМЖ [19].
Помимо подбора наиболее благоприятной среды для создания клеточной линии из первичной культуры, возникает необходимость культивировать клетки на специальных подложках, поскольку эпителиальные клетки плохо адгезируют к поверхности. Это привело к разработке
различных стратегий, в которых используют не только специальные обогащенные среды, но и фидерный слой клеток, синтезирующих необходимые факторы роста для культуры эпителиальных клеток. [20, 21]. Таким способом было получено несколько первичных культур клеток с доказанной эпителиальной природой [22, 23]. Однако, клетки фидерного слоя могут трансформироваться и подвергаться старению, а подготовка фидера занимает длительное время и не всегда есть техническая возможность сделать такую подложку, поэтому можно применять и другие варианты подложек — покрытие поверхности культуральных флаконом коллагеном или коммерческие покрытия [1 7]. Эксперимент, проведенный K. Janik с соавт. (201 6) показали, что первичные культуры КМЖ одинаково эффективно размножаются на фидерном слое и на коммерческом покрытии Geltrex®, тем не менее, после второго пассажа все меньше клеток прикреплялось к фидеру (рис. 1) [17]. При замене покрытия Geltrex® на коллаген I существенных изменений обнаружено не было, что позволяет покрывать культу-ральные флаконы коллагеном взамен дорогостоящего покрытия Geltrex® [17]. При сравнительном анализе культивирования клеток во флаконах с коллагеновым подложкой и в адгезивных флаконах без подложки было доказано, что коллаген способствует ускорению пролиферации и прикрепления клеток. Следует отметить, что культивирование в разных коммерческих средах, таких как Epicult и Mammocult, всегда приводило к положительному результату, как по скорости пролиферации, так и по скорости адгезии [24, 25].
Таким образом, проблемы при культивировании двухмерной клеточной культуры можно решить с помощью покрытия флаконов коллагеном и использованием обогащенной или коммерческой среды. Более того, появляются физиологические среды для культивирования, содержащие набор химических веществ, близкий по составу плазме крови человека, например, среда Plasmax [26]. Для предотвращения загрязнения культуры фибробластами можно выделять клетки КМЖ из среды безферментативным способом.
Маммосферы и органоиды
Для преодоления сложностей, возникающих с адгезией клеток к подложке при культивировании, а также для получения гетерогенной культуры с различными биологическими свойствами, содержащей клетки микроокружения опухоли in vivo, был предложен способ создания сфероидов, а в случае с КМЖ — маммосфер — неадгезивной сфероидной культуры, получаемой из клеток КМЖ in vitro.
Данный метод был разработан для размножения эпителиальных стволовых клеток молочной железы (MaSC) in vitro G. Dontu с соавт. (2003) [27] на основе полученной B.A. Reynolds с соавт. (1992) нейросферы [28]. Многие авторы указывают, что сфероиды содержат стволовые раковые клетки, поддерживающие рост опухоли [29-31], а гетерогенные популяции клеток при КМЖ — популяцию клеток, у которой отсутствует онкогенный потенциал [32].
M.J. Grimshaw с соавт. (2016) [4] и Н. Безденежкин (2008) с соавт. [33] выделили клетки из плеврального выпота больных с КМЖ и доказали, что маммосферы могут быть адекватной моделью для изучения чувствительности опухолевых «стволовых» клеток к терапии.
D. Ponti с соавт. (2005) предположили, что опухолевые стволовые клетки содержатся в опухоли и инициируют ее рост даже после проведенной терапии [34]. В своем исследовании они выделили 1 6 первичных культур,
из которых 7 обладали способностью образовывать маммосферы. В 4 культурах маммосферы прикреплялись и дифференцировались в течение нескольких пассажей, в остальных — сохраняли свои свойства на протяжении 40 пассажей и в них присутствовали самообновляющиеся клетки с эпителиальным фенотипом [34].
Позже J. Manuel Iglesias с соавт. (2013) показали, что маммосферы образуются только при наличии в культивируемых опухолевых клетках Е-кадгерина [35], что доказывает связь между образованием маммосфер и сохранением клетками эпителиального фенотипа [36-38].
Для использования маммосфер, как универсальной модели тестирования лекарственных средств и проведения других анализов, имеются ограничения, напрямую связанные с их главным отличием от адгезивных культур — наличием в них стволовых раковых клеток. Поскольку до сих пор нет полных данных в понимании процессов самообновления и дифференцировки этих клеток нет и возможности утверждать о корреляции результатов in vivo и ex vivo. Для решения этой проблемы Y. Lombardo (2015) с соавт. предлагают проведение дополнительных экспериментов по отслеживанию клонов раковых клеток с помощью ксенотрансплантантов [39].
В последнее время все больше исследований проводится с целью создания клеточной культуры в виде «органоидов». Первоначально этот термин использовали для описания аномального клеточного роста, органопо-добных структур или опухолей [40]. В настоящее время во многих источниках термин «органоид» зачастую употребляют при описании сфероидов, поэтому возникают разночтения в трактовке этого термина для определения органоидов из разных клеток. Так, в случае с органоидами, полученными из клеток опухоли молочных желез, термин характеризует модель эпителиальных протоков в геле трехмерного внеклеточного матрикса (ВКМ), а для органоидов, полученных из клеток опухоли кишечника, наоборот, это первичные эпителиальные стволовые клетки, выращенные без мезенхимы [40].
В отличие от маммосфер, которые являются результатом агрегации и скопления эпителиальных клеток молочных желез в суспензии, органоиды сохраняют трехмерную организацию, имитирующую строение ткани внутри организма [41]. Одновременно две группы ученых в 2009 г.: A. Ootani с соавт. [42] и T. Sato с соавт. [43] — получили такие органоиды из клеток опухоли кишечника и доказали, что они сходны с исходными опухолями по гистологическим и генетическим характеристикам. На их примере N. de Ligt Sach с соавт. (2018) создали биобанк, включающий в себя разные виды органоидов, полученных из клеток опухолей молочной железы: авторы диссоциировали ферментативным и механическим способами ткань КМЖ после мастэктомии, образовавшуюся суспензию помещали в суррогат базальной мембраны (элемент ВКМ) до затвердения и суспензировали в среде для клеток КМЖ, содержащей необходимые факторы роста [44]. При этом не отмечалось смещения подтипа опухоли относительно исходного, а органоиды демонстрировали различную морфологию: кистозные органоиды, органоиды, напоминающие виноград, и дис-когезивные органоиды.
Тем не менее, современные 313-системы не полностью отражают естественное микроокружение опухоли, так как искусственные системы для воссоздания ВКМ и многие инженерные модели похожи на натив-ные опухолевые ткани только морфологически. При использовании таких систем не воссоздается передача сигналов в клетках так, как это происходит в опухоли ex vivo, а также отсутствуют сосудистые и иммунные
Таблица. Сравнительная характеристика культур клеток КМЖ
Признаки Монослой Маммосферы Органоиды Метод срезов
Морфология Вытянутые Сфероидные Трехмерные структуры, Тонкие срезы тканей
клеток клетки, плотно образования, напоминающие
прилегают друг способные морфологию
другу, образуют формировать структурных элементов
монослой неадгезивную культуру молочной железы
Получение Диссоциация различными методами и посев в подходящую Формирование
культуральную среду тонких пластов ткани
Использование Использование Использование с последующим
адгезивного неадгезивного искусственных поддержанием
покрытия покрытия элементов ВКМ в питательной среде
Недостатки отсутствие нестабильность требует недолговечность;
микросреды, культуры; дополнительных сложность в анализе
пространственной недостаточная инженерных из-за высокой
организации изученность конструкций; неоднородности клеточного
клеток стволовых раковых дороговизна состава;
клеток; возможность сохранения
дешевизна стерильности при получении
Преимущества быстрый гетерогенная культура, морфологически ближе по морфологии
и дешевый метод состоящая из клеток выглядит как ткани и характеристикам
разных фракций, ex vivo: к опухоли, чем предыдущие
что приближает больше соответствует варианты
к состоянию клеток состоянию клеток
ex vivo ex vivo
компоненты, что крайне важно при определении транспорта лекарственных средств. Будущая тенденция усовершенствования 30- систем — усложнение их физиологических особенностей, моделирование кровеносной системы с применением инновационных химических материалов и инженерных разработок, компьютерного моделирования. Такие инженерные модели — следующий шаг в персонализированной терапии, мост между двухмерными моделями и ксенотрансплантантами, который позволит не только ускорить выпуск новых терапевтических средств, но и подбирать терапию индивидуально для каждого пациента [45].
Следующий способ получения первичных культур КМЖ — метод срезов: образцы опухоли нарезают на тонкие пласты и помещают в среду для культивирования в виде кусочков ткани. Остается открытым вопрос, насколько возможно сохранение стерильности при нарезке ультратонких срезов. Кроме того, существенным минусом является возможность их использования в течение ограниченного времени и однократно [46].
На основании приведенных данных можно заключить, что наиболее оптимальной моделью для изучения эффектов лекарственной терапии являются сфероиды, которые имеют преимущества перед монослойными культурами и менее сложны в воспроизводстве, чем органоиды. В таблице представлены некоторые ключевые характеристики описанных выше культур клеток КМЖ и выделены основные преимущества и недостатки.
Анализ рецепторного аппарата
культивируемых опухолевых клеток
КМЖ включает более 20 различных подтипов, которые отличаются морфологией, генетикой и клинической картиной течения заболевания [47-50]. Молекулярная характеристика КМЖ описана в статье Э. ОпеПо с соавт. (2015) [51], выявлено более 1600 вероятных мутаций в 93 генах [52]. Эти данные подтверждают значительную
гетерогенность опухоли. При рутинной диагностике сегодня выделяют пять основных молекулярно-биологи-ческих подтипов карциномы молочной железы: luminal А, luminal В, luminal В (HER2+), HER2-overexpression, basal-like, различающихся по прогнозам и чувствительности к различным видам лекарственной терапии [53].
Данные подтипы определяют по сочетанию наличия рецепторов к эстрогену, прогестерону, HER2 и Ki-67. Отмечается, что большая часть клинически наблюдаемой пластичности и гетерогенности происходит внутри подтипов, а не между основными биологическими подтипами КМЖ [54-58]. Согласно этим подтипам назначают терапию: пациентам с люминальным подтипом подходит эндокринно-направленная терапия, в то время как HER2-положительный подтип подлежит таргетной терапии и ассоциируется с более плохим прогнозом [59, 60]. Пролиферативная активность также зависит от подтипа опухоли: гормон-рецептор-негативные карциномы молочной железы по сравнению с гормон-рецептор-позитивными карциномами демонстрируют более высокий уровень Ki-67, что свидетельствует об их высоком уровне пролиферации [61]. В последние годы стало очевидным, что, помимо межопухолевой гетерогенности, имеется и значительная внутриопухолевая гетерогенность КМЖ. Более того, нельзя не учитывать проявления эпителиально-мезенхимального перехода в опухолевой ткани, который играет основную роль в формировании лекарственной резистентности и является причиной последующего развития рецидива заболевания у пациенток с КМЖ. Преимущество опухолевых стволовых клеток в том, что для получения первичной культуры достаточно небольшого количества исходных клеток [62-67].
А.А. Бриллиант с соавт. (2019) обнаружили, что количество стволовых клеток в опухоли зависит от иммуно-гистохимического подтипа опухоли: в группе с высоким содержанием опухолевых стволовых клеток преобладают случаи гормонрецепторнегативного HER2 позитивного и тройного негативного подтипов [68]. Опухоль часто
PR
'V!
■ ЩЩ шЩЖ
■ ^^^^ .Г
Hi ШШЖ^'Л^Ъ
■
... ^ у. у Vj . У ..w '
• .. • . - '■ ! Л5 . . • ,.1 г> HER2
Шт^Штй
К- Ч J '-.-¡у
О
- • . •• vi ■
, V- ■ • •-. . , ^ ,л .
Рис. 2. Первичный материал РМЖ. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к ЕЯ, РЯ, НЕЯ2 и К167. Световая микроскопия. Ув. х100
• < ER PR
• 1
л» ( . * V w » j> • А i '
% * 4 ^ ч IP
« ' Ч * % « V *
0 # 0 Ф
* ш HER2 ф W KI 67 ^ « PCK
• и « * • • ч ^ • *
• - • »
' * « • ф * 4 *
ф е
9 * • О
•
•
Рис. 3. Культура клеток КМЖ, 3 пассаж. Иммуноцитохимическое исследование с использованием антител к ЕЯ, РЯ, НЕЯ2, К167 и панцитокератину (РСК). Световая микроскопия. Ув. х400
представлена различными клеточными субпопуляциями, поэтому при получении первичной культуры клеток рака молочной железы важно учитывать соответствие подтипа опухоли и подтипа выделенной из нее культуры. С.В. Сазонов с соавт. (2018) в своей работе показали, что иммуногистохимический подтип, соответствующий первичной опухоли, был получен только на 3 пассаже и изменился в ходе дальнейшего культивирования клеток (на 4 и 5 пассажах) [69]. В первичном материале при иммуногистохимическом исследовании было выявлено, что уровень рецепторов к ЕЯ равнялся 5 баллам, РЯ — 4 баллам, НЕЯ2/пеи — 2+, амплификация гена ИЕЯ2 (при проведении дополнительного исследования
методом гибридизации in situ) отсутствовала. Данный тип карциномы был отнесен к Люминальному B подтипу РМЖ (рис. 2).
При типировании клеток 3 пассажа были получены следующие показатели: ER — 6 баллов, PR — 5 баллов, уровень HER2 — 1+. Клетки имели высокую пролифе-ративную активность: количество белка Ki67 (маркер пролиферации) равнялось 52% (рис. 3).
T. Nishikata с соавт. (2013) показали, что состав рецепторного аппарата в клетках первичной культуры часто отличался от такового в клетках экстрипированной злокачественной ткани [58]. Опухоль, первоначально охарактеризованная в клинических испытаниях как
БП-положительная по рецептору прогестерона и отрицательная по рецептору НБП2, в полученной первичной культуре не имела данных рецепторов, был выявлен только СК 19. Авторами был сделан вывод, что в первичной культуре сохраняются только некоторые характеристики первичной опухоли. Было обнаружено, что данная культура проявляет изменения, характерные для эпите-лиально-мезенхимального перехода, соответствующего развитию метастатического процесса в опухоли [58].
Подобное исследование было проведено _. М1па1га с соавт. (2012): первичные опухолевые клетки были выделены из ткани молочной железы пациентки с инвазивной протоковой карциномой со следующими биологическими характеристиками опухоли: умеренно дифференцированная, К1-67 (21%), БП+/РП+, НБП2 отрицательный [70]. Иммуноцитохимический анализ выполняли на культуре клеток 4 пассажа. Клеточная культура была классифицирована как положительная для вимен-тина, а-БМА, БЭБП, К1-67 и для маркера стволовых клеток СЮ44, слабо положительная — для панцитокератина (рапСК), люминального СК8/18; отрицательная — для базальных СК5/6, НБП2, БП и РП [70]. Таким образом, фенотип первичной культуры также отличался от фенотипа первичной опухоли, как и в работах Т. МэИИ^а с соавт. (2013) [58] и С.В. Сазонова с соавт. (2018) [69]. Для дальнейшего анализа определяли факторы эпи-телиально-мезенхимального перехода — виментин, мезенхимальный белок цитоскелета и а-БМА. Все клетки культуры синтезировали данные маркеры, что подтвердило наличие процесса эпителиально-мезенхимального перехода в культуре [71, 72].
В противоположность этим исследованиям, имеются работы, показывающие, что первичная опухоль может соответствовать молекулярно-биологической характеристике биопсийного образца, а изменения состава рецепторов связаны именно с эпителиально-мезенхимальным переходом [73].
Данных об исследовании рецепторного аппарата клеток КМЖ в культуре недостаточно для определения его отличий от рецепторного аппарата клеток в опухоли, а результаты некоторых работ противоречат друг другу. В основном, ученые концентрируются на изучении генных мутаций в опухоли и культуре КМЖ, тогда как терапия назначается согласно подтипам опухоли. Это может являться ограничением в использовании первичной культуры КМЖ как модели для персонализированной терапии.
Первичная культура как экспериментальная
модель для исследования влияния химиотерапии
на клетки карциномы молочной железы
В последние годы наблюдается тенденция к индивидуальной терапии КМЖ в связи с формированием устойчивости и отсутствию ответа на системную терапию. Появляются и разрабатываются все новые таргетные средства, которые проходят оценку в соответствующих клинических исследованиях. Однако такие исследования не всегда быстро могут предсказать исход лечения, и использование данного препарата может не подходить конкретному пациенту в силу гетерогенности клеточного состава опухоли. Изучение всех молекулярных свойств опухоли данного пациента может занять много времени и не всегда возможно, именно поэтому лечение КМЖ проводится согласно определенным подтипам. Кроме того, нет терапии для опухолей без специфичных рецепторов. Решением проблемы может стать использование первичной культуры, благодаря которой можно быстро и эффективно определить резистентность клеток
к данному препарату или, наоборот, его эффективное действие. Многие авторы характеризуют клеточные культуры как полезный инструмент для диагностики и лечения злокачественных опухолей [73-75].
В ходе длительного применения постоянных клеточных линий было доказано, что для определения лекарственной цитотоксичности эффективнее использование первичных культур, более того, данные показатели имеют большую релевантность [58, 75].
Как было сказано выше, могут быть использованы следующие варианты моделей для исследования препаратов: 2й-монослойные культуры, маммосферы, органоиды, срезы тканей.
Использование первичных 2й-культур определяется низкой трудозатратностью и стоимостью процедуры, однако по своей релевантности приближается к применению постоянных клеточных линий, поскольку они хуже соответствует опухоли ex vivo. Так, в работе Y. Imamura с соавт. (2015) было доказана большая устойчивость к действию противоопухолевых препаратов на 2й-культуре, чем на 3й-культуре КМЖ [76].
T. Nishikata с соавт. (2013) подвергали тепловому шоку клетки первичной культуры КМЖ: при сравнении реакции на тепловой шок постоянной клеточной линии КМЖ, нормальных клеток молочной железы и данной культуры была определена устойчивость клеток первичной культуры к тепловому шоку, в отличие от других исследуемых клеточных линий [58].
При работе со сфероидными культурами необходимо учитывать способность клеток образовывать плотные сферы, поскольку большая плотность клеток в сфере может затруднить количественную оценку клеток и повлиять на эффективность проникновения лекарственного препарата [77, 78]. Эту проблему можно решить, если контролировать плотность сфер и выполнять анализ цитотоксичности на этапе их формирования. Для оценки проникновения лекарственных препаратов в сфероид нужны методы, основанные на применении флуоресцентной визуализации с высоким разрешением [79].
Первичные опухолевые клетки также можно культивировать в виде органоидов в гелеобразной смеси, имитирующей внеклеточный матрикс. Основным недостатком этого подхода является медленный, в течение нескольких месяцев, рост таких органоидов, что не приемлемо для диагностических целей. Кроме того, возникают те же трудности при анализе, как и в случае со сфероидными культурами.
При использовании срезов ткани для получения первичной культуры клеток КМЖ также существуют ограничения. С одной стороны, они в полной мере соответствуют фенотипу опухоли, но, с другой стороны, в срезах тканей гетерогенность клеточного состава может быть меньше, чем в исходной опухоли, что может снизить степень релевантности показателей при испытаниях лекарственных препаратов. Более того, описанная в настоящее время методология, касающаяся получения срезов тканей, может не позволить прямое его внедрение в клинических условиях. При культивировании срезов проблемы с транспортировкой материала, его качеством и соблюдением температурного режима становятся более актуальными, чем при получении первичных культур другими методами. Для анализа влияния препаратов на клетки КМЖ, выделенные с помощью метода срезов ткани, следует изучать возможности автоматизации и высокой производительности конкретной лаборатории.
Однако есть работы, которые показывают возможность использования срезов тканей для разработки новых комбинаторных стратегий в лечении КМЖ.
Например, эффект фармакологических соединений, таких как ингибиторы сигнальной трансдукции и интерферирующие РНК (миРНК), специфически нацеленных либо на опухоль, либо на стромальный компонент [80], можно оценить только на этой модели, т. к. в других вариантах культур клеток стромальный компонент выражен слабо.
Кроме непосредственного определения реакции на конкретный препарат, предлагаются и модели, с помощью которых можно определить чувствительность цито-статиков т у^го, что будет способствовать повышению эффективности терапии [81].
с использованием различных сред и покрытий. Многие авторы указывают на преимущество именно сфероидных клеточных культур, поскольку они содержат в себе стволовые раковые клетки. Остается открытым вопрос, что будет лучшей моделью для подбора персонализированной терапии т у^го — двухмерные культуры, трехмерные культуры или срезы тканей. Несомненным остается то, что данные модели сегодня необходимы как для изучения общих закономерностей развития опухоли, так и для определения индивидуальной чувствительности клеток опухоли к проводимой химиотерапии.
Заключение
Основная проблема в доклинических исследованиях рака — создание клеточных моделей, клетки которых максимально точно по молекулярно-биологическим характеристикам соответствуют клеткам КМЖ пациента при сохранении внутриопухолевой гетерогенности и микроокружения опухоли. Получение первичных культур КМЖ является актуальной задачей, как для подбора противоопухолевых препаратов, так и для проведения молекулярно-биологических исследований, направленных на изучение закономерностей развития опухоли.
Для того чтобы полученная первичная культура стала релевантной моделью для опухоли in vivo, необходимо определение основных клеточных рецепторов. Однако до сих пор нет единого мнения относительно изменения рецепторного аппарата клеток КМЖ в процессе культивирования, остается открытым вопрос и о соответствии фенотипа опухоли и культуры, полученной из ее клеток.
Существует большое количество методик для создания двухмерных и сфероидных клеточных культур
Список сокращений
ВСМР — питательная среда DMEM:F12, дополненная сывороткой крови человека, EGF, аденином и др. CK 19 — цитокератин 19
CRC — питательная среда Ham-F-12, дополненная фетальной бычьей сывороткой, EGF, ROCK, холерным токсином и др. EGF — эпидермальный фактор роста ER — эстроген
HER2 — эпидермальный фактор роста
Ki67 — индекс (маркер) клеточной пролиферации
MaSC — эпителиальные стволовые клетки молочной
железы PR — прогестерон a-SMA — альфа-актин гладких мышц ROCK — ингибитор Rho-ассоциированной
протеинкиназы КМЖ — карцинома молочной железы ВКМ — внеклеточный матрикс
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Галимова Э.С., Галагудза М.М. Двухмерные и трехмерные модели культур клеток опухолей in vitro. Преимущества и недостатки. Бюллетень сибирской медицины 2018; 17(3): 188-96. [Galimova E.S., Galagudza M.M. 2D and 3D models of in vitro tumor cell cultures. Advantages and disadvantages. Bulletin of Siberian Medicine 2018; 17(3): 188-96].
2. Ali R., Samman N., Al Zahrani H. et al. Isolation and characterization of a new naturally immortalized human breast carcinoma cell line, KAIMRC1. BMC Cancer 2017; 17(1): 803.
3. Zhao P., Zhou W., Liu C. et al. Establishment and Characterization of a CTC Cell Line from Peripheral Blood of Breast Cancer Patient. J. Cancer 2019; 10(24): 6095-104.
4. Bezdieniezhnykh N., Lykhova A., Semesiuk N. et al. Establishment and characterization of new breast and ovarian cancer cell lines as a model for studying cellular plasticity in vitro. Exp. Oncol. 2016; 38(2): 94-100.
5. Ghaderi F., Mehdipour F., Hosseini A. et al. Establishment and Characterization of a New Triple Negative Breast Cancer Cell Line from an Iranian Breast Cancer Tissue. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2019; 20(6): 1683-9.
6. Gu M., Shen C. Novel cancer cell lines derived from primary breast tumors in Chinese patients. Am.J. Transl. Res. 2018; 10(12): 3956-68.
7. Геращенко Т.С., Денисов Е.В., Литвяков Н.В. и др. Внутриопухо-левая гетерогенность: природа и биологическое значение (обзор). Биохимия 2013; 78: 1531-49. [Gerashchenko T.S., Denisov E.V., Litvyakov N.V. et al. Intratumoral heterogeneity: nature and biological significance (review). Biochemistry 2013; 78: 1531-49].
8. Gillet J.P., Calcagno A.M., Varma S. et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anticancer drug resistance. PNAS USA 2011; 108(46): 18708-13.
9. Qu Y., Han B., Yu Y. et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells, https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMC4493126/.
10. Cree I.A., Glaysher S., Harvey A.L. Efficacy of anti-cancer agents in cell lines versus human primary tumour tissue. Curr. Opin. Pharmacol. 2010; 10(4): 375-9.
11. Mitra A., Mishra L., Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013; 31(6): 347-54.
12. Freshney R.I. Induction of differentiation in neoplastic cells. Anticancer Res. 1985; 5(1): 111-30.
13. Lasfargues E.Y., Ozzello L. Cultivation of human breast carcinomas. J. Natl. Cancer Inst. 1958; 21(6): 1131-47.
14. McCallum H.M., Lowther G.W. Long-term culture of primary breast cancer in defined medium. Breast Cancer Research and Treatment 1996; 39(3): 247-59.
15. Нуштаева А.А. Культуры онкотрансформированных клеток молочной железы и эндометрия для изучения опухолевой прогрессии и разработки терапевтических подходов [диссертация]. Новосибирск: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; 2019. [Nushtaeva A.A. Cultures of oncotransformed cells of the mammary gland and endometrium for the study of tumor progression and the development of therapeutic approaches [dissertation]. Novosibirsk: Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine S.B. RAS; 2019].
16. Liu X., Ory V., Chapman S. et al. ROCK Inhibitor and Feeder Cells Induce the Conditional Reprogramming of Epithelial Cells. The American Journal of Pathology 2015; 180(2): 599-607.
17. Janik K., Popeda M., Peciak J. et al. Efficient and simple approach to in vitro culture of primary epithelial cancer cells, https://www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC5146827/.
18. Alamri A.M., Kang K., Groeneveld S. et al. Primary cancer cell culture: mammary-optimized vs conditional reprogramming. Endocr. Relat. Cancer 2016; 23(7): 535-54.
19. Esparza-Lopez J., Ramos-Elias P.A., Castro-Sanchez A. et al. Primary breast cancer cell culture yields intra-tumor heterogeneous subpopulations expressing exclusive patterns of receptor tyrosine kinases. BMC Cancer 2016; 16(1): 740.
20. Cobleigh M.A., Kennedy J.L., Wong A.C. et al. Primary culture of squamous head and neck cancer with and without 3T3 fibroblasts and effect of clinical tumor characteristics on growth in vitro. Cancer 1987; 59(10): 1732-8.
21. Wang C.S., Goulet F., Tremblay N. et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 2001; 197(3): 175-81.
22. Krasna L., Dudorkinova D., Vedralova J. et al. Large expansion of morphologically heterogeneous mammary epithelial cells, including the luminal phenotype, from human breast tumours. Breast Cancer Res. Treat. 2002; 71: 219-35.
23. Matouskova E., Dudorkinova D., Pavlikova L. et al. Clonal expansion of epithelial cells from primary human breast carcinoma with 3T3 feeder layer technique. Folia Biol. 1998; 44(2): 67-71.
24. Могиленских А.С., Сазонов С.В., Демидов С.М. Оптимизация условий культивирования первичной карциномы молочной железы человека. В: Сборник научных докладов VI Петербургского международного онкологического форума «Белые ночи 2020»; 2020, 25-28 июня; Санкт-Петербург, Россия; 2020. с. 98. [Mogilenskikh A.S., Sazonov S.V., Demidov S.M. Optimization of cultivation conditions for primary human breast carcinoma. In: Collection of scientific reports of the VI St. Petersburg
International Oncological Forum «White Nights 2020»; 2020 June 25-28; St. Petersburg, Russia; 2020. p. 98]
25. Могиленских А.С., Седнева-Луговец Д.А. Сравнение роста первичной культуры карциномы молочной железы в различных условиях для культивирования. В: Цап Н.А., редактор. Материалы V Международной научно-практической конференции молодых учёных и студентов; 2020, 9-10 апреля; Екатеринбург, Россия; 2020. с. 128-32. [Mogilenskikh A.S., Sedneva-Lugovets D.A. Comparison of the growth of a primary culture of breast carcinoma under different culture conditions. In: Tsap N.A., editor. Materials of the V International Scientific and Practical Conference of Young Scientists and Students; 2020 April 9-10; Yekaterinburg, Russia; 2020. p. 128-32].
26. Vande Voorde J., Ackermann T., Pfetzer N. et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6314821/.
27. Dontu G., Abdallah W.M., Foley J.M. et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 2003; 17(10): 1253-70.
28. Reynolds B.A., Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 1992; 255: 1707-10.
29. Reya T., Morrison S.J., Clarke M.F. et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 2001; 414: 105-11.
30. Marx J. Mutant stem cells may seed cancer. Science 2003; 301: 1308-10.
31. Pardal R., Clarke M.F., Morrison S.J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat. Rev. Cancer 2003; 3(12): 895-902.
32. Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A. et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. PNAS USA 2003; 100(7): 3983-8.
33. Grimshaw M.J., Cooper L., Papazisis K. et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells, https://breast-cancerresearch.biomedcentral.com/ articles/10.1186/bcr2106.
34. Ponti D., Costa A., Zaffaroni N. et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 2005; 65(13): 5506-11.
35. Manuel Iglesias J., Beloqui I., Garcia-Garcia F. et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cad-herin, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3790762/.
36. Засадкевич Ю.М., Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Роль кадгери-нов в норме и при развитии рака молочной железы. Архив патологии 2015; 77(3): 57-64. [Zasadkevich Yu.M., Brilliant A.A., Sazonov S.V. The role of cadherins in the health and development of breast cancer. Archive of pathology 2015; 77(3): 57-64].
37. Засадкевич Ю.М., Сазонов С.В. Роль молекулы клеточной адгезии E-кадгерина в онтогенезе человека в норме и патологии. Морфология 2014; 146(5): 78-82. [Zasadkevich Yu.M., Sazonov S.V. The role of the cell adhesion molecule E-cadherin in human ontogenesis in health and disease. Morphology 2014; 146(5): 78-82].
38. Бриллиант Ю.М., Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Эпителиальные кадгерины и ассоциированные с ними молекулы при инвазивном долько-вом раке молочной железы. Архив патологии 2017; 79(1): 12-8. [Brilliant Yu.M., Brilliant A.A., Sazonov S.V. Epithelial cadherins and associated molecules in invasive lobular breast cancer. Archive of pathology 2017; 79(1): 12-8].
39. Lombardo Y., de Giorgio A., Coombes C.R. et al. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines, https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4401367/.
40. Simian M., Bissell M.J. Organoids: a historical perspective of thinking in three dimensions. J. Cell Biol. 2017; 216: 31-40.
41. Charlotte R., Frédéric H., Richard R. et al. Breast tumour organoids: promising models for the genomic and functional characterisation of breast cancer. Biochem. Soc. Trans. 2003; 47(1): 109-17.
42. Ootani A., Li X., Sangiorgi E. et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat. Med. 2009; 15(6): 701-6.
43. Sato T., Vries R.G., Snippert H.J. et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 2009; 459: 262-5.
44. Sachs N., de Ligt J., Kopper O. et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell 2018; 172: 373-86
45. Xu X., Farach-Carson M.C., Jia X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnol. Adv. 2014; 32(7): 1256-68.
46. Naipal K.A.T., Verkaik N.S., Sánchez H. et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer, https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4748539/.
47. Lakhani S.R. W.H.O. Classification of Tumours of the Breast. Fourth Edition. International Agency for Research on Cancer 2012; 4: 8-10.
48. Lee B.H. Commentary on: «Comprehensive molecular characterization of papillary renal-cell carcinoma» Cancer Genome Atlas Research Network. N. Engl. J. Med. 2016; 374(2): 135-45.
49. Sazonov S.V., Konyshev K.V. HER2/neu in local metastases and primary focus of breast cancer. European Journal of Patology (Virchows Archiv) 2015; 467(S1): 55.
50. Konyshev K., Sazonov S. Changes of estrogen receptor, progesterone receptor and Her2/neu statuses of local metastases compared with
primary tumor in breast cancer. European Journal of Patology (Virchows Archiv) 2019; 475(1): 84-5.
51. Ciriello G., Gatza M.L., Beck A.H. et al. Research Network Comprehensive molecular portraits of invasive lobular breast cancer. Cell 201 5; 163: 506-19.
52. Nik-Zainal S., Davies H., Staaf J. et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature 2016; 534: 47-54.
53. Сазонов С.В. Обеспечение качества молекулярно-биологических исследований при диагностике рака молочной железы. Екатеринбург, Россия: ВУМАН; 2018. [Sazonov S.V. Quality assurance of molecular biological research in the diagnosis of breast cancer. Yekaterinburg, Россия: VUMAN; 2018].
54. Perou C.M., Sorlie T., Eisen M.B. et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000; 406(6797): 747-52.
55. Prat A., Perou C.M. Deconstructing the molecular portraits of breast cancer. Mol. Oncol. 2011; 5(1): 5-23.
56. Rivenbark A.G., O'Connor S.M., Coleman W.B. Molecular and cellular heterogeneity in breast cancer: challenges for personalized medicine. Am.J. Pathol. 2013; 183: 1113-24.
57. Marusyk A., Almendro V., Polyak K. Intra-tumour heterogeneity: a looking glass for cancer? Nat. Rev. Cancer 2012; 12(5): 323-34.
58. Nishikata T., Ishikawa M., Matsuyama T. et al. Primary culture of breast cancer: a model system for epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cells. Anticancer Res. 2013; 33(7): 2867-73.
59. Семиглазов В.Ф., Палтуев Р.М., Манихас А.Г. и др. Клинические рекомендации РООМ по диагностике и лечению рака молочной железы. Клинические рекомендации РООМ. Санкт-Петербург: Издательский дом «АБВ-пресс»; 201 5. [Semiglazov V.F., Paltuev R.M., Manikhas A.G. et al. Clinical guidelines of the ROOM for the diagnosis and treatment of breast cancer. Clinical guidelines ROOM. St. Petersburg: Publishing house «ABV-press»; 2015].
60. Франк Г.А., Андреева Ю.Ю., Виноградов И.Ю. и др. 10 лет тестирования HER2-статуса рака молочной железы в России. Архив патологии 2012; 74(5): 3-6. [Frank G.A., Andreeva Yu.Yu., Vinogradov I.Yu. et al. 10 years of testing the HER2 status of breast cancer in Russia. Archive of pathology 2012; 74(5): 3-6].
61. Сазонов С.В., Бриллиант А.А., Бриллиант Ю.М. Связь состояния пролиферативных процессов и особенностей рецепторного аппарата опухолевых клеток карциномы молочной железы. Гены и Клетки 2017; 12(4): 76-81. [Sazonov S.V., Brilliant A.A., Brilliant Yu.M. Relationship between the state of proliferative processes and the characteristics of the receptor apparatus of breast carcinoma tumor cells. Genes and Cells 2017; 12(4): 76-81].
62. Сазонов С.В., Конышев К.В., Казанцева Н.В. и др. Гистологические и иммуногистохимические проявления эпителио-мезенхи-мального перехода при тройном негативном раке молочной железы. Вестник Уральской медицинской академической науки 2016; 2(57): 53-63. [Sazonov S.V., Konyshev K.V., Kazantseva N.V. et al. Histological and immunohistochemical manifestations of the epithelio-mesenchymal transition in triple negative breast cancer. Bulletin of the Ural Medical Academic Science 2016; 2(57): 53-63].
63. Сазонов С.В., Казанцева Н.В., Конышев К.В. и др. Проявления эпителиально-мезенхимального перехода при трижды негативном раке молочной железы. Успехи молекулярной онкологии 2018; 5(4): 77. [Sazonov S.V., Kazantseva N.V., Konyshev K.V. et al. Manifestations of epithelial-mesenchymal transition in thrice-negative breast cancer. Advances in Molecular Oncology 2018; 5(4): 77].
64. Brilliant A.A., Brillant Yu.M., Sazonov S.V. Characteristics of the relation between epithelial-mesenchymal transition and proliferative activity in breast carcinomas. European Journal of Cancer 2013; 49(2): 216.
65. Kazantseva N., Brilliant F., Brilliant Y. et al. The level of proliferation in cases of breast cancer with high and low maintenance of cancer stem cells. European Journal of Pathology (Virchows Archiv) 2018; 473(1): 205.
66. Demidov S., Sazonov S., Brilliant A. et al. Expression of WNT, Hedgehog and NOTCH signaling pathways in HER-2 overexpressed and triple negative subtypes of breast cancer with high and low content of cancer stem cells. Annals of Oncology 2020; 31(2): 30.
67. Brilliant A., Brilliant Y., Sazonov S. WNT, Hedgehog and Notch signalling pathways in triple negative breast cancer with high and low content of cancer stem cells. Annals of Oncology 2019; 30(3): 40.
68. Бриллиант А.А., Бриллиант Ю.М., Сазонов С.В. и др. ALDH1A1 позитивные клетки опухоли и их влияние на сигнальные пути NF-KB, PI3K PTEN, NOTCH, WNT, Hedgehog в случаях тройного негативного и гормон рецептор негативного HER2 позитивного иммуногистохи-мических подтипов инвазивных карцином молочной железы. Вестник уральской медицинской академической науки 2019; 16(1): 41-9. [Brilliant A.A., Brilliant Y.M., Sazonov S.V. et al. ALDH1A1 positive tumor cells and their influence on signaling pathways NF-KB, PI3K PTEN, NOTCH, WNT, Hedgehog in cases of triple negative and hormone receptor negative HER2 positive immunohistochemical subtypes of invasive breast carcinomas. Bulletin of the Ural Medical Academic Science 2019; 16(1): 41-9].
69. Сазонов С.В., Бриллиант А.А., Фадеев Ф.А. и др. Первый опыт культивирования клеток рака молочной железы. Вестник Уральской медицинской академической науки 2018; 15(6): 860-7. [Sazonov S.V., Brilliant A.A., Fadeev F.A. et al. The first experience in the cultivation of breast cancer cells. Bulletin of the Ural Medical Academic Science 2018; 15(6): 860-7].
70. Minafra L., Norata R., Bravata V. et al. Unmasking epithelialmesenchymal transition in a breast cancer primary culture: a study report. BMC Res. Notes 2012; 5: 343.
71. Drews-Elger K., Brinkman J.A., Miller P. et al. Primary breast tumor-derived cellular models: characterization of tumorigenic, metastatic, and cancer-associated fibroblasts in dissociated tumor (DT) cultures. Breast Cancer Res. Treat. 2014; 144(3): 503-17.
72. Nushtaeva A.A., Stepanov G.A., Semenov D.V. et al. Characterization of primary normal and malignant breast cancer cell and their response to chemotherapy and immunostimulatory agents. BMC Cancer 2018; 18(1): 728.
73. Suchy S.L., Hancher L.M., Wang D. et al. Chemoresponse assay for evaluating response to sunitinib in primary cultures of breast cancer. Cancer Biol. Ther. 2011; 11(12): 1059-64.
74. Nakanishi T., Chumsri S., Khakpour N. et al. Side-population cells in lumi-nal-type breast cancer have tumour-initiating cell properties, and are regulated by HER2 expression and signalling. Br.J. Cancer 2010; 102(5): 815-26.
75. Halfter K., Hoffmann O., Ditsch N. et al. Testing chemotherapy efficacy in HER2 negative breast cancer using patient-derived spheroids. J. Transl Med. 2016; 14(1): 112.
76. Imamura Y., Mukohara T., Shimono Y. et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol. Rep. 2015; 33(4): 1837-43.
77. Fang Y., Eglen R.M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 2017; 22(5): 456-72.
78. Hoarau-Vechot J., Rafii A., Touboul C. et al. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvi-ronment Interactions? Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(1): 181.
79. Han C., Takayama S., Park J. Formation and manipulation of cell spheroids using a density adjusted PEG/DEX aqueous two phase system. Sci. Rep. 2015; 5: 11891.
80. van der Kuip H., Murdter T.E., Sonnenberg M. et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer 2006; 6: 86.
81. Шуканова Н.А., Мартынова М.А., Козловская Н.А. и др. Влияние цитостатиков на функциональное состояние клеток рака молочной железы в первичной культуре. Онкологический журнал 2011; 5(2): 62-4. [Shukanova N.A., Martynova M.A., Kozlovskaya N.A. et al. Influence of cytostatics on the functional state of breast cancer cells in primary culture. Cancer Journal 2011; 5(2): 62-4].
