CC BY
99
Инюшкина Юлия Витальевна
Ю.В.Инюшкина — выпускница Малой академии морской биологии, Академии экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета, где получила диплом с отличием по специальности «биохимия». В 2003 г., еще студенткой третьего курса, была принята в группу биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН, которая в сотрудничестве с научными коллективами Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН и Алтайского государственного медицинского института работает над проблемой вторичного метаболизма в культуре растительных клеток. В основную задачу группы входит создание воспроизводимых источников биологически активных веществ, изучение механизмов регуляции биосинтеза фитоалексинов. Исследования поддерживаются грантами ДВО РАН, Президента РФ «Научные школы», Президиума РАН и РФФИ.
Объект изучения Ю.В.Инюшкиной — клеточная культура лекарственного растения Eritrichi-um sericeum, продуцента розмариновой кислоты и рабдозина, проявляющих разнообразную фармакологическую активность и перспективных для применения в медицине (тема ее курсовой и дипломной работ). В настоящее время Юлия Витальевна обучается в очной аспирантуре и готовит к защите кандидатскую диссертацию на тему «Влияние агробактериального гена rolC на синтез вторичных метаболитов в культурах растительных клеток» (научный руководитель — чл.-корр. РАН В.П.Булгаков). Результаты исследований молодого ученого опубликованы в международном журнале «Bioscience, Biotechnology and Biochemistry», две статьи приняты к печати в российских периодических изданиях «Биохимия» и «Химико-фармацевтический журнал». Участница международных конференций в КНР и Японии. Лауреат премии Международной конференции по биоинформатике — IMECS-2008 в Гонконге (март 2008 г.). Награждена премией им проф. А.И.Куренцова.
УДК 581.1
Ю .В .ИНЮШКИНА
Создание биотехнологического источника метаболитов кофейной кислоты
Впервые получен высокопродуктивный биотехнологический источник рабдозина и розмариновой кислоты — метаболитов кофейной кислоты — из культуры растительных клеток. Выявлен ген группы цитохром P-450-содержащих монооксигеназ (CYP98A3), обусловливающий высокий уровень продукции этих веществ в культуре клеток Eritrichium sericeum, изучена его экспрессия. Фармакологические исследования показали, что прием препарата клеток облегчает течение гломерулонефрита и в некоторых случаях предупреждает его развитие.
ИНЮШКИНА Юлия Витальевна - аспирант, младший научный сотрудник (Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток). E-mail: yulya.in@rambler.ru
Ключевые слова: культуры растительных клеток, вторичный метаболизм, метаболиты кофейной кислоты, розмариновая кислота, рабдозин, rolC, цитохром-Р-450 монооксигеназы, CYP98, экспериментальный гломерулонефрит.
Creation of biotechnological source of caffeic acid metabolites. Yu.V.INYUSHKINA (Institute of Biology and Soil Science, FEB RAS, Vladivostok).
A high-productive biotechnological source of rabdosiin and rosmarinic acid was obtained for the first time from plant cell cultures. The gene CYP98Â3 of Cytochrom P450 monooxygenases subfamily involved in high polyphenol production in cell cultures was revealed, and its expression was studied. Pharmacological study demonstrated that administration of Eritrichium sericeum callus biomass alleviated and in some cases prevented symptoms associated with glomerulonephritis.
Key words: plant cell cultures, secondary metabolism, caffeic acid metabolite, rosmarinic acid, rabdosiin, rolC, cytochrome P450 monooxygenase, CYP98, experimental glomerulonephritis.
Клеточные культуры в качестве сырья для получения вторичных метаболитов имеют ряд преимуществ перед природными растениями: в них содержится больше целевого продукта, а значит, есть возможность увеличения выхода ценных фракций. Кроме того, система растительной клетки in vitro - удобная модель для изучения метаболизма последней, поскольку исследователь может управлять ею, меняя условия культивирования или воздействуя на экспрессию генов.
Метаболиты кофейной кислоты (МКК), в частности розмариновая кислота (димер кофейной кислоты) и рабдозин (тетрамер кофейной кислоты), обладают широким спектром фармакологической активности. Помимо противовирусного, антибактериального и антиоксидантного действия эти вещества ингибируют активность ВИЧ-1-интегразы [11, 18], а также лимфоцит-специфическую киназу, ослабляя сигналы T-клеток и генерируя иммуносупрессию [3]. Для полифенолов - метаболитов кофейной кислоты - обнаружена следующая закономерность: чем больше остатков кофейной кислоты содержит вещество, тем выше его активность [10]. Следовательно, рабдозин более активен, чем розмариновая кислота.
В настоящее время широко изучается возможность создания новых эффективных препаратов и пищевых добавок для профилактики и лечения почечных заболеваний, связанных с нефритом, на основе растительных полифенолов. Так, известно, что развитие гломерулонефрита* у экспериментальных животных эффективно подавляет отвар Perilla frutescens [14]. Главными действующими веществами при лечении диабетической нефропатии являются МКК - кислоты розмариновая и литоспермовая Б (аналог рабдозина). Применение последней значительно снижало симптомы при заболеваниях почек и не вызывало побочных эффектов [13].
Цель работы - создание культуры растительных клеток, продуцирующих МКК, повышение биосинтетической активности культур и оценка влияния клеточной биомассы на крыс с индуцированным нефритом Мацуги.
Клеточные культуры Eritrichium sericeum - источник МКК
В 2003 г. были получены культуры корней (Es-корни) и каллусов - недифференцированных клеток (Es-контроль) незабудочника шелковистого Eritrichium sericeum. Качественным и количественным анализом полифенолов установлено, что культуры синтезируют два МКК - розмариновую кислоту и рабдозин [6]. Изначально культура корней накапливала больше полифенолов, чем каллусная линия [4]. Однако поскольку каллусы
* Гломерулонефрит является частным случаем нефрита (воспалительного заболевания почек), характеризуется поражением преимущественно почечных клубочков. Нефрит Масуги (Мацуги), или нефрит цитотоксический экспериментальный, вызывается введением животному цитотоксической (нефротоксической) сыворотки; используется в качестве модели гломерулонефрита человека.
имеют ряд преимуществ при промышленном культивировании, главной задачей являлось увеличение продуктивности каллусной культуры. В ходе селекции общее содержание розмариновой кислоты и рабдозина удалось повысить с 2,7 до 6,3% от сухой массы, что значительно выше содержания полифенолов в стеблях и корнях природного растения (0,01 и 0,39% соответственно). Другие методы, обычно используемые в биотехнологии, такие как изменение концентрации сахарозы, нитрата аммония, добавление в питательную среду предшественников биосинтеза полифенолов, использование индукторов шикимат-производного пути вторичного метаболизма, были неэффективны либо подавляли рост культуры. Тем не менее нами найдены два индуктора, которые оказывали значительное влияние на продукционную способность каллусов. Метилжасмонат, известный индуктор вторичного метаболизма растений, в культуре клеток E. sericeum стимулировал биосинтез как розмариновой кислоты, так и рабдозина. В этом случае общее содержание полифенолов в клетках повышалось на 20-38%. Интересный эффект был обнаружен при добавлении в питательную среду глицерата меди (комплекса, медленно освобождающего ионы Cu): его применение в достаточно высокой концентрации (0,25 мг/л) не повлияло на общее содержание полифенолов в культуре, однако изменило соотношение МКК в пользу более активного рабдозина. Количество последнего в каллусной культуре E. sericeum достигло 4,1%. По нашим данным, это самое высокое содержание рабдозина, известное для природных и биотехнологических источников [9].
Получение трансгенных культур Es-rolC
Известно, что ген rolC, содержащийся в плазмидах растительного патогена Agrobacterium rhizogenes, играет существенную роль в неопластической трансформации растений, результатом чего являются значительные морфологические и биохимические изменения в трансформированных тканях [17]. Экспрессия гена rolC в культивируемых клетках растений вызывает активацию вторичного метаболизма в трансформированных им клетках. Механизм активации биосинтетической активности трансформированных геном rolC клеток растений не известен. С целью повысить содержание полифенолов мы трансформировали культуру клеток E. sericeum конструкцией pPCV002-CaMVC, содержащей ген rolC под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Полученная в ходе трансформации каллусная культура была обозначена как Es-rolC. Вопреки ожидаемым результатам анализ МКК показал трехкратное уменьшение содержания МКК в rolC-каллусах по сравнению с контрольной культурой Es-контроль, т.е. в среднем на протяжении длительного периода культивирования rolC-каллусы продуцировали 1,4 ± 0,4% МКК от сухой массы ткани [4]. Однако далее было отмечено повышение биосинтетической активности rolC-клеток. Так, с ноября 2006 г. rolC-трансгенные каллусы продуцировали в среднем 4,7 ± 0,64% МКК, тогда как контрольная культура - 3 ± 0,23%. Причина изменения биосинтетической активности rolC-каллусов пока не ясна. Однако следует отметить, что сходный эффект наблюдался также для культур клеток женьшеня, трансформированных геном rolC [1]. Предположение об изменении экспрессии трансгена в течение продолжительного времени культивирования не подтвердилось [8]. В целом отмечается высокая стабильность экспрессии гена rolC в культурах трансформированных клеток растений. Возможно, он обусловливает медленно идущие продолжительные процессы модификации сигнальных путей клетки-хозяина [5]. По-видимому, эти процессы также определяют феноменологию биосинтеза вторичных метаболитов.
Экспрессия генов CYP98 в rolC-трансгенных клетках E. sericeum
Недавно японскими учеными был охарактеризован фермент, являющийся ключевым в биосинтезе розмариновой кислоты, и клонирован соответствующий
ген - CYP98A6. Упомянутый фермент осуществляет 3-гидроксилирование 4-кумароил-4'-гидроксифенилмолочной кислоты, непосредственного предшественника розмариновой [7, 15]. CYP98A6 - представитель обширного семейства генов цитохром P-450-содержащих монооксигеназ, играющих важную роль в метаболизме животных и растительных клеток [12]. Семейство CYP98 объединяет гены, кодирующие З'-гидроксилазы эфиров кумаровой кислоты. Эти ферменты, участвующие в биосинтезе лигниновых мономеров и хлорогено-вой кислоты, необходимы для биосинтеза фенольных соединений [16]. Мы попытались выявить ген CYP98A6 или его гомолог в культурах обычных и ro/C-трансгенных клеток E. sericeum и изучить его экспрессию. Для этого была проведена оценка общего уровня экспрессии при помощи специально разработанных вырожденных праймеров, ограничивающих часть междоменной области гена, результаты которой не показали разницы в уровне экспрессии генов CYP в контрольной и Es-rolC культурах (см. рисунок, а, б). На основе сиквенсов транскриптов были получены аминокислотные последовательности, представляющие собой междомен-ную область размером 74 аминокислотных остатка [2]. При их сравнении c известными подобными последовательностями CYP других видов растений оказалось, что сек-венированные фрагменты наиболее близки к известным цитохром P-450-содержащим монооксигена-зам растений семейства CYP98.
Аминокислотные последователь-
ности CYP98 незабудочника при выравнивании в программе Clust-alX разделились на три семейства:
CYP98A1, CYP98A2 и CYP98A3 и были идентичны между собой не менее чем на 71%. CYP98A3 на 94% гомологична CYP98A6 из культуры клеток воробейника Litospermum erythrorhizon [15]. Количественный анализ экспрессии этой изоформы в контрольной и rolC-культурах показал интересные результаты. Так, количество транскриптов CYP98A3 в Es-rolC-каллусах было примерно в 5 раз выше, чем в контрольной культуре (см. рисунок, в). При этом уровень экспрессии CYP98A2 не изменился, а CYP98A1 уменьшился в ~2 раза.
Полученные результаты говорят о том, что продукт гена rolC может
Экспрессия генов CYP E. sericeum в контрольной культуре Es-контроль и rolC-трансгенной каллусной культуре Es-rolC. При проведении ОТ-ПЦР просчитывали ПЦР-продукты («Agilent 2100 Bioanalyzer», Agilent Technologies, США). а - гель-электрофорез продуктов ПЦР на кДНК генов CYP E. sericeum. Сигналы получены с использованием вырожденных праймеров. Размер продукта 256 п.о. 1, 2 - каллусная культура Es-контроль, разведение матрицы кДНК 1:3 и 1:1 соответственно; 3, 4 - каллусная культура Es-rolC, разведение матрицы кДНК 1:3 и 1:1 соответственно; М - маркер молекулярной массы; НК - негативный контроль; б - количественная оценка экспрессии генов CYP; в — нормализованная экспрессия подсемейств генов CYP. Значения получены на основе данных относительной общей экспрессии генов CYP и количественного распределения сек-венированных клонов
обусловливать дифференциальную активацию транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма. Преобладание транскриптов СУР98Л3 в го/С-каллусах свидетельствует о том, что ген го/С избирательно активирует отдельные формы генов из этого семейства, направляя поток метаболитов в русло биосинтеза специфических вторичных метаболитов.
Влияние препарата клеток Е. зепсеиш
на крыс с индуцированным нефритом Мацуги
Для того чтобы исследовать эффект МКК при индуцированном гломерулонефрите, экспериментальным животным скармливали препарат, приготовленный из клеточной биомассы Е. Бепсеит. Для оценки антинефротической активности использовали особей с индуцированным нефритом Мацуги. В результате инъекции специфической нефротоксической сыворотки у животных развивалась острая форма патологии почек, сопровождающаяся протеинурией, увеличением уровня диуреза и экскрецией креатинина. Развитие заболевания диагностировалось наличием протеинурии. Животные с индуцированным нефритом Мацуги были разделены на две группы: I -не получавшие каллусы (14 экз.), II - получавшие клеточную биомассу Е. вепсеит (13 экз.). После индукции нефрита крысам группы II на протяжении 30 дней скармливали крахмальную суспензию каллусов Е. Бепсеит; эффективная доза препарата составила 100 мг/кг массы в день (см. таблицу). Это привело к увеличению диуреза на 42%, снижению экскреции креатинина на 24 и экскреции белка на 25%.
Следует отметить, что к концу эксперимента у четвертой части животных группы II не были обнаружены симптомы заболевания, в то же время оно развилось у всех крыс группы I, не принимавших сухую биомассу. В группе II было вдвое меньше животных с тяжелыми нефрогенными симптомами, чем в группе I. Таким образом, прием препарата Е. Бепсеит облегчает течение болезни и в некоторых случаях предупреждает развитие гломерулонефрита. Следует отметить, что эффективная доза каллусов составила 100 мг/кг массы тела в день. В этом количестве ткани содержится 6 мг МКК, т.е. 1,5 мг рабдозина и 4,5 мг розмариновой кислоты. Это намного меньше, чем используемая для тех же целей доза аналога рабдозина - соли литоспермовой кислоты Б (20 мг/день) [9]. По-видимому, именно комбинированное введение розмариновой кислоты и рабдозина имеет благоприятный эффект при лечении заболеваний почек. Таким образом, полифенолы незабудочника существенно снижают симптомы нефропатии, т.е. перспективны для применения в медицине.
ЛИТЕРАТУРА
1. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М. и др.: тез. докл. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология», Алматы, 1993 г. Алматы, 1993. С. 170.
2. Инюшкина Ю.В., Киселев К.В., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Специфические изоформы генов цитохром Р-450-содержащих монооксигеназ вовлечены в биосинтез метаболитов кофейной кислоты в го/С-трансгенных культурах клеток ЕгйпсЫит Бепсеит // Биохимия. 2008. Т. 73 (в печати).
Влияние каллусов ЕгйпсЫиш 8ег1сеиш на развитие гломерулонефрита у крыс (% от общего количества животных)
Симптомы (экскрекция белка, мг/день) Группа животных
I II
Отсутствуют (<10) Слабые (10-30) Средней тяжести (31-100) Тяжелые (>100) 0 23 28.5 16 28.5 38 43 23
Примечание. I - кормление 2%-й крахмальной суспензией, II - 2%-й крахмальной суспензией и сухим измельченным каллусом (Ев-контроль), 100 мг/кг. Длительность эксперимента 30 сут.
3. Ahn S., Oh W., Kim B. et al. Inhibitory effect of rosmarinic acid on Lsk SH2 domain binding to a synthetic phos-phopeptide // Planta Med. 2003. Vol. 69. P. 642-646.
4. Bulgakov V.P, Veselova M.V., Tchernoded G.K. et al. Inhibitory effect of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene on rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon transformed cell cultures // Planta. 2005. Vol. 221. P 471-478.
5. Bulgakov V.P Functions of rol genes in plant secondary metabolism // Biotechnol. Advances. 2008. D0I:10.1016/j. biotechadv.2008.03.001.
6. Fedoreyev S.A., Veselova M.V., Krivoschekova O.E. et al. Caffeic acid metabolites from Eritrichium sericeum cell cultures // Planta Med. 2005. Vol. 71. P 446-451.
7. Gang D.R., Beuerle T., Ullmann P. et al. Differential production of meta hydroxylated phenylpropanoids in sweet basil peltate glandular trichomes and leaves is controlled by the activities of specific acyltransferases and hydroxylases // Plant Physiol. 2002. Vol. 130. P. 1536-1544.
8. Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P. et al. The Agrobacterium rhizogenes rolC-gene-induced somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Panax ginseng transformed calluses // Planta. 2006. Vol. 223. P. 457-467.
9. Inyushkina Y.V., Bulgakov V.P, Veselova M.V. et al. High rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum callus cultures and effect of the calli on Masugi-nephritis in rats // Biosci. Biotecnol. Biochem. 2007. Vol. 71. P. 1286-1293.
10. Ito H., Miyazaki T., Ono M., Sakurai H. Antiallergic activities of rabdosiin and its related compounds: chemical and biochemical evaluations // Bioorg. Med. Chem. 1998. Vol. 6. P. 1051-1056.
11. Kashiwada Y., Nishizawa M., Yamagishi T. et al. Anti-AIDS agents, 18. Sodium and potassium salts of caffeic acid tetramers from Arnebia euchroma as anti-HIV agents // J. Nat. Prod. 1995. Vol. 58. P. 392-400.
12. Li L., Cheng H., Gai J., Yu D. Genome-wide identification and characterization of putative cytochrome P450
genes in the model legume Medicago truncatula // Planta. 2007. Vol. 226. P. 109-123.
13. Li H., Lee H., Jung M., Shah S. U.S. Patent 6267992 (Jul. 31, 2001).
14. Makino T., Ito M., Kiuchiu F. et al. Inhibitory effect of decoction of Perilla frutescens on cultured murine mesan-gial cell proliferation and quantative analysis of its active constituents // Planta Med. 2001. Vol. 67. P. 24-28.
15. Matsuno M., Nagatsu A., Ogihara Y. et al. CYP98A6 from Lithospermum erythrorhizon encodes 4-couma-royl-4P-hydroxyphenyllactic acid 3-hydroxylase involved in rosmarinic acid biosynthesis // FEBS Lett. 2002. Vol. 514. P. 219-224.
16. Morant M., Hehn A., Werck-Reichhart D. Conservation and diversity of gene families explored using the CODEHOP strategy in higher plants // BMC Plant Biology. 2002. Vol. 2.
17. Spena A., Schmulling T., Koncz C., Schell J.S. Independent and synergistic activity of rolA, B and C loci in
stimulating abnormal growth in plants // EMBO J. 1987. Vol. 6. P. 3891-3899.
18. Tewtrakul S., Miyashiro H., Nakamura N. et al. HIV-1 integrase inhibitory substances from Coleus parvifolius // Phytother. Res. 2003. Vol. 17. P. 232-239.
Еляков Г.Б. Природные соединения. Синтез, химическое строение и биологическая активность: избранные труды.
Владивосток: Дальнаука, 2007. - 352 с. - (Памятники отечественной науки. XX век). -ISBN 978-5-8044-0821-4.
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН
690022, Владивосток, пр. 100 летия Владивостока, 159. Fax: (4232) 314050.
E-mail: piboc@eastnet.febras.ru
Книга представляет собой сборник научных работ академика Г.Б.Елякова - крупного ученого в области органической и биоорганической химии, основателя Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, многие годы руководившего академической наукой на Дальнем Востоке. В данном издании приводится более 40 статей по основным направлениям научной деятельности Г.Б.Елякова: исследования в области органического синтеза; изучение строения и биологической активности природных соединений растительного происхождения; изучение структур и свойств морских природных соединений; вклад в развитие морской микробиологии и биотехнологии, основанной на применении морских микроорганизмов. Даны также выдержки из выступлений на заседаниях Президиума РАН, Президиума ДВО РАН и газетных публикаций.
Для ученых, аспирантов, студентов, специализирующихся в области органической и биоорганической химии, микробиологии и биотехнологии, а также людей, интересующихся историей науки в нашей стране.
Л
