CC BY
13стом побегов чайного растения. Физиология растений. -1969, т. 16. - с. 61
31. Программа импортозамещения [Электронный ресурс] URL: http://ib.ru/article/169121/importozameschenie (дата обращения: 01.02.2016)
32. Таможенная статистика [Электронный ресурс] URL: http://globus-ved.ru (дата обращения: 20.02.2016)
33. Рынок чая: комплексный анализ и прогноз до 2016 года [Электронный ресурс] URL: http://www.foodmarket.spb. ru/ marketing1.ru (дата обращения: 15.02.2016)
34. Маркетинговое исследование и анализ рынка черного байхового чая в России, 2014 г. [Электронный ресурс] URL: http://www. FoodMarkets.ru (дата обращения: 15.02.2016)
35. Информационное агентство. Краснодар, ноябрь 2015 г. [Электронный ресурс] URL: http://regnum.ru/news/ economy/1916917.html (дата обращения: 20.02.2016)
36. Подписано соглашение о долгосрочном сотрудничестве между ВНИИЦиСК и Дагомысчай [Электронный ресурс] URL: http://www.vniisubtrop.ru/novo&i (дата обращения: 16.11.2015)
37. Черноморские субтропики - краткий исторический очерк. Сочинское отделение Русского географического общества. [Электронный ресурс] URL: http://www.geo. opensochi.org. (дата обращения 24.03.2016)
СОЗДАНИЕ АМФИДИПЛОИДОВ - ФЕРТИЛЬНЫХ МЕЖВИДОВЫХ
ГИБРИДОВ В РОДЕ NICOTIANA
Ларькина Н.И.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт табака, махорки и табачных изделий», г. Краснодар, заместитель директора по научной работе и инновациям
CREATION OF AMPHIDIPLOIDS - FERTILE INTERSPECIAL NICOTIANA HYBRIDS Larkina N.I., FSBSI "All-Russian research institute of tobacco, makhorka and tobacco products", Krasnodar, deputy director for science and innovations
АННОТАЦИЯ
Результаты НИР свидетельствуют, что при экспериментальном удвоении наборов хромосом у стерильных межвидовых гибридов - амфигаплоидов можно в роде Nicotiana получить фертильные межвидовые гибриды - амфидиплоиды и путем селекционно-генетических отборов выделить лучшие растения по морфологическим, биологическим признакам и устойчивости к ряду болезней, характеризующиеся относительно нормальным мейозом в процессе микроспорогенеза, которые могут быть использованы в качестве базисного исходного материала в селекции при создании новых сортов табака.
ABSTRACT
Research results demon^rate that after experimental chromosome doubling for Serile interspecial Nicotiana hybrids (amphi-gaploids) fertile interspecial hybrids (amphidiploids) can be obtained. Their selection process can di^inguish plants with supreme morphological and biological properties, resi^ant to diseases, with normal meiosis during microsporogenesis. These plants can be used as initial selection material for new tobacco sorts breeding.
Ключевые слова: табак, дикие виды, устойчивость, мейоз, морфологические и биологические признаки, амфигаплоиды, амфидиплоиды, межвидовые гибриды.
Keywords: tobacco, wild species, resi^ance, meiosis, morphological and biological properties, amphigaploids, amphidiploids, interspecial hybrids.
Межвидовая гибридизация проведена в роде Nicotiana путём скрещивания культурного табака (Nicotiana tabacum Lin.), взятого материнской формой, с дикими видами секций Suaveolentes и Tomentosae.
При создании новых по генетической структуре форм отмечались все закономерности, которые наблюдаются у других видов во время отдалённых скрещиваний. Это затруднительное получение гибридов, полная стерильность первых гибридов, своеобразное наследование признаков, связанное с нарушением гаметостаза.
Для преодоления несовместимостей применялись и разрабатывались разнообразные селекционно-генетические методы, позволяющие создать новые гибридные формы растений, преодолеет их стерильность, получив из них фертильные межвидовые гибриды-амфидиплоиды. Новые межвидовые фертильные гибриды, выделенные как новый вид, несли различные геномы, выявленные при изучении морфологических, биологических признаков и прохождения мейоза в процессе макро- и микроспорогенеза, т.е. при образовании семяпочек и пыльцы.
Метод межвидовой гибридизации занимает значительное место в селекции табака и позволяет передавать полез-
ные признаки, особенно устойчивость к болезням, новым сортам табака.
Целью исследований были создание нового исходного селекционного материала при использовании межвидовой гибридизации в роде Nicotiana на плазме культурного табака, где Nicotiana tabacum Lin. является материнской формой и опыляется пыльцой диких видов (Ç); разработка комплекса методов и приёмов, позволяющих преодолеть возникающие несовместимости видов; изучение селекционно-генетических признаков у новых межвидовых гибридов и закономерностей их наследования.
Для проведения научно-исследовательских работ в принятом направлении был осуществлён поиск генетического материала и методов для разработки научно-методических аспектов создания нового исходного селекционного материала.
При межвидовых скрещиваниях применяли виды рода Nicotiana, семейства Паслёновых (Solatacea). В качестве исходной материнской формы (Ç) использовали культурный табак (n=24 хромосомы) - сорта восточной папиросной экологической группы, существенно различающиеся по мор-фо-биологическим признакам. Сорт Иммунный 580 - круп-
ный по габитусу, крупнолистный, позднеспелый, скелетного типа. Сорт Дюбек 44 - мелкий по габитусу, мелколистный, скороспелый, ароматичного типа. Взятые для скрещивания сорта табака характеризовались большой противоположностью.
Необходимо было определить, как будет происходить наследование этих признаков у будущих межвидовых гибридов.
Применение N. tabacum материнской формой явилось новым в исследованиях, так как были интересны результаты скрещивания на плазме культурного табака. Межвидовая гибридизация с разными видами проведена на плазме табака. В качестве отцовской формы $ служили опылителями дикие виды рода Nicotiana секции Suaveolentes Goodspeed и Tomentosae Goodspeed.
Дикие виды - опылители из секции Suaveolentes Goodspeed:
вид Nicotiana debneyi Domin (n=24 хромосомы) -однолетнее, травянистое растение, 50-120 см высотой, до 10 мелких листьев; алкалоиды - анабазин, следы никотина; устойчив к бронзовости томатов, бактериальной рябухе, черной корневой гнили, трипсу, пероноспорозу (Hill, 1966; Терновский, 1967).
вид Nicotiana rosulata Domin (n=20 хромосом) - однолетнее, травянистое растение 35-45 см высотой, имеющее до 7-10 мелких листьев; алкалоиды - норникотин, имеются следы никотина; устойчив к пероноспорозу и черной корневой гнили (Hill, 1966; Терновский, 1967).
Дикие виды - опылители из секции Tomentosae Goodspeed:
вид Nicotiana otophora Grisibach (n=12 хромосом)
- мелкодревесный, клейкий кустарник, высотой 1-2 м, имеющий до 20 крупных листьев; алкалоиды - никотин, нор-никотин; устойчив к табачной и огуречной мозаике, белой пестрице, пероноспорозу (Терновский, 1967; Подкина, 1973).
вид Nicotiana setchellii Goodspeed (n=12 хромосом)
- мелкодревесный, клейкий кустарник, 1-2 м высотой, имеющий до 20-25 крупных листа, 40 см длиной; алкалоиды -никотин, норникотин (Псарёва, 1963); устойчив к табачной и огуречной мозаике, мучнистой росе, белой пестрице, пе-роноспорозу (Терновский, 1967; Подкина,1973).
Представленные виды рода Nicotiana использовались для создания фертильных межвидовых гибридов - крупнолистных и мелколистных; скороспелых и среднеспелых; различных по содержанию никотина; устойчивых к болезням
- пероноспорозу, черной корневой гнили, мучнистой росе, белой пестрице, табачной и огуречной мозаике.
Стандартами при исследовании были сорта табака Им-муннный 580 и Дюбек 44.
Научно-исследовательская работа проводилась в условиях России, г. Краснодара, во Всероссийском научно-исследовательском институте табака, махорки и табачных изделий, в селекционно-генетическом направлении, в условиях стерильного бокса, камерах искусственного климата, теплице, парниках и на опытно-селекционном полевом участке. Почвенный покров - западный, предкавказский, выщелоченный чернозем, находящийся в зоне среднего увлажнения, с жарким летом и продолжительной, теплой осенью. Погодные условия пригодны для роста и развития табака.
Для проведения работ по межвидовой гибридизации применялись методы лабораторного и полевых исследований.
При создании межвидовых фертильных гибридов использовали методы культуры изолированных органов, тканей и клеток in vitro - опыление открытых семяпочек на плаценте N. tabacum стерилизованной пыльцой диких видов в стерильном боксе в условиях in vitro; индуцирование тканевого каллуса из семян, листа, стебля на определённых питательных средах и органогенеза - образование проростков- реге-нерантов, укоренение их на питательной среде в условиях пробирки. Для полиплоидизации стерильных межвидовых растений применяли культуру in vitro: шестикратное пассирование каллуса из листьев на среде с минеральными солями и определенными добавками различных питательных элементов; осуществление органогенеза для получения регенератов и укоренения их на питательный среде в пробирках. Растения выращивали в камере искусственного климата. Часть полученных стерильных растений с 5-7 листочками, высаженных их пробирок в горшечную культуру (специализированные вазоны), на 20-25 день обрабатывали 0,3 % раствором колхицина в 1 % метилцеллюлозе, 2 раза в день (утром и вечером) в течении 6 дней для получения фертильных гибридов.
Изучался у взрослых цветущих растений мейоз процесса микроспорогенеза на временных давленных препаратах недозрелых пыльников.
Материалы исследований обрабатывались на компьютере.
Методами полевого исследования межвидовых гибридов провели в теплицах и на полевом опытно-селекционном участке изучение: морфологических и биологических признаков; содержания никотина в листьях; урожая высушенных листьев с 1 растения; семенной продуктивности соцветия и устойчивости растений к болезням.
В процессе общего изучения находилось 3250 растений амфидиплоидов.
Для оформления результатов исследований употреблялись условные обозначения: материнские сорта Им 580 -сорт Иммунный 580, Д 44 - сорт Дюбек 44; Ад - амфиди-плоид: Ад1 - Им 580 х N. debneyi, Ад2 -Д 44 х N. debneyi, Ад3 - Д44 х N. rosulata, Ад4 - Им 580 х N. setchellii, Ад5
- Им 580 х N. otophora; F - поколение гибридов; $ - материнское растение; 3 - опылитель (отцовское растение); М
- средняя арифметическая признака, m - ошибка средней арифметической, v % - коэффициент варьирования признака; стадии мейоза при микроспорогенезе: М1 -метафаза1, А1 - анафаза 1, Т1 - телофаза 1, М2 - метафаза 2, А2 - анафаза 2, Т2 - телофаза 2; болезни табака: ВТМ - вирус табачной мозаики, МР - мучнистая роса, ЛМР - ложная мучнистая роса (пероноспороз), ЧКГ - черная корневая гниль, БП
- белая пестрица. [1,c. 38,126:2, с. 25,61]
Хромосомные ассоциации - это униваленты, биваленты, поливаленты в метафазе 1 мейоза, отмеченные при нарушении этого процесса. [3, с. 49].
Амфигаплоиды - стерильные межвидовые гибриды, созданные экспериментальным путем, имели гаплоидные наборы хромосом N. tabacum и вида - опылителя. Из них были выбраны наилучшие растения, из листьев которых выращен каллус в культуре ткани (in vitro), характеризующийся разной консистенцией, пигментацией и интенсивностью роста.
У гибридов с опылителем N. debneyi каллусная ткань зеленовато-белая,
средней плотности, с умеренной интенсивностью роста по всей поверхности.
Ткань каллуса у гибридов с N. rosulata плотная, белой пигментации с серебристым оттенком, разрастается всей поверхностью.
У гибридов с N. setchellii и N. otophora каллус резко отличался от каллуса предыдущих гибридов. Пигментация ткани в культуре in vitro - кремоватая с коричневым оттенком, консистенция очень рыхлая, с распадом каллуса на кусочки, рост ткани - интенсивный.
Из каллуса гибридов после второго пассирования получены растения - регенеранты. Растения всех гибридных комбинаций, доведенных до цветения, оказались стерильными. Вторую часть каллуса гибридов провели через шестикратное пассирование, т.е. шестиразовая посадка каллуса на среду Мурасига и Скуга (шесть поколений каллуса), и далее после органогенеза и укоренения проростков, вырастили в горшечной культуре растения - регенеранты. Среди них удалось выделить 3 фертильных гибридных растения с хромосомными наборами N. otophora и 12 - с N. setchellii.
Из гибридов с N. setchellii выбрано самое крупное растение с фертильностью пыльцы 79 %, у него получено 420 семян. На одном из фертильных форм гибрида с N. otophora собрали 250 семян.
В других гибридных комбинациях результаты по удвоению хромосом в культуре in vitro не были получены.
По 45 растений амфигаплоидов от N. debneyi, N. rosulata, размноженных методом in vitro и выращенных в горшечной культуре, обрабатывали точки роста путем 6-ти суточного колхицинирования 0,3 % раствором. По результатам проведенного закапывания точек роста колхицином в утренние и вечерние часы, когда происходит деление клеток, получено небольшое число фертильных гибридных растений с геномами N. debneyi и N. rosulata.
В гибридной комбинации Дюбек 44 х N. rosulata имелось 4 растения, у которых завязывались семенные коробочки. Одно растение дало 50 семян из 8 коробочек. В трех растениях было выявлено по 10-15 хорошо сформированных семян, остальные семена были щуплые и сморщенные. Все полученные семена высевали в условиях in vitro на питательную среду Уайта для укоренения. В пробирках, размещенных в камере искусственного климата, появилось незначительное количество проростков, из них 5 проростков укоренилось.
Из листа крупного хорошего растения в пробирке индуцировали каллус, из него органогенез, где на каллусе образовались проростки-регенеранты. Отобранные хорошие проростки высаживали на среду Уайта для укоренения. В
горшечной культуре выращено 25 растений, из них цветения достигли 10 растений. Они были фертильны, образовывали коробочки со значительным числом семян.
В гибридной комбинации Дюбек 44 х N. debneyi выявлено из всех обработанных колхицином растений одно плодовитое. С него собрано 27 коробочек с 5230 семенами, после высева которых в парник получена рассада, высаженная в поле, в условиях которого выращены фертильные межвидовые гибриды - амфидиплоиды.
В процессе проведения научно-исследовательских работ и анализа данных результатов их выполнения выявлены экспериментально созданные амфидиплоиды следующих комбинаций: Иммунный 580 $ х N. debneyi 3 (Ад 1); Дюбек 44 $ х N. debneyi 3 (Ад 2); Дюбек 44 $ х N. rosulata 3 (Ад 3); Иммунный 580 $ х N. setchellii 3 (Ад 4); Иммунный 580 $ х N. otophora 3 (Ад 5). Для их создания использовали методы:
- культуры in vitro;
- колхицирования;
- выращивания в горшечной культуре в камере искусственного климата, парниковой культуре и в условиях поля, используя агротехнологию табака.
У фертильных межвидовых гибридов - амфидиплоидов, выращенных в поле, изучены морфологические и биологические признаки, которые ранее были неизвестны.
По габитусу растений, форме и окраске листа, форме соцветия, окраске
цветка гибриды были близки к стерильным амфигаплои-дам, но значительно от них отличались по высоте растений, числу листьев и их размерам. Количественные признаки ам-фидиплоидов - высота растений, число листьев, их размеры находились в пределах среднего варьирования.
При сравнении с исходными сортами табака Иммунный 580 и Дюбек 44, взятыми как материнские формы, межвидовые гибриды, полученные при участии видов секции Suaveolentes - N. debneyi, N. rosulata, были значительно меньше по высоте растений, числу листьев и их размерам, а амфидиплоиды, созданные при опылении видами секции Tomentosae - N. setchellii и N. otophora, по данным признакам особо не отличались от сорта Иммунный 580.
Амфидиплоиды от N. debneyi и N. rosulata - раннецветущие и по вегетационному периоду близки к сорту Дюбек 44, а амфидиплоиды от N. setchellii и N. otophora - позднецвету-щие и более соответствовали сорту
Иммунный 580.
Таблица 1
Количественные признаки амфидиплоидов
Показатели Амфидиплоиды Д 44 И 580
Ад 1 Ад 2 Ад 3 Ад 4 Ад 5
Число растений 210 60 80 68 82 35 35
Высота растений, см M 110,9 113,3 82,5 176,7 215,5 145,1 221,3
m 3,5 3,1 3,1 4,4 8,6 3,1 8,2
v % 16,5 12,5 18,2 13,5 12,6 8,6 12,1
Число листьев, шт. M 13,5 20,6 22,3 42,0 40,1 32,6 43,4
m 0,3 1,1 0,9 0,9 2,1 0,8 1,1
v % 15,5 19,1 15,7 9,3 12,6 10,5 8,0
Длина среднего листа, см M 22,9 18,4 15,0 39,6 42,1 23,2 42,1
m 0,7 0,5 0,9 0,8 1,7 0,9 1,0
v % 14,7 3,2 20,9 8,9 14,2 13,2 6,0
Число дней до цветения M 55,4 53,5 54,1 124,2 128,6 57,2 132,1
m 0,6 0,5 0,5 1,9 3,4 0,8 1,8
v % 5,8 3,9 4,7 13,0 9,1 5,0 4,0
Число растений, шт. 23 18 29 25 31 9 9
Никотин, % M 0,8 1,4 2,6 2,4 3,0 2,5 2,6
m 0,25 0,45 0,5 0,49 0,4 0,1 0,1
v % 53,7 61,1 49,5 45,0 31,8 8,4 5,8
Число растений, шт. 18 12 28 14 11 10 10
Урожай сухих листьев с растения, г M 12,7 9,2 12,8 152,1 128,5 44,0 87,5
m 2,9 3,0 2,7 17,3 6,5 1,4 0,8
v % 46,2 67,0 31,3 30,2 12,4 14,0 4,0
Содержание никотина у всех амфидиплоидов весьма различное. Наиболее низконикотинные (0,79%) были гибриды с N. debneyi (Ад 1), а высоконикотинные (3 %) - гибриды с N. setcheШi (Ад 4). Никотин в гибридах зависел от хромосомного набора вида опылителя.
По урожаю сухих листьев с одного растения среди амфидиплоидов определилось две группы: малоурожайные - с генами N.debneyi и N. rosulata и урожайные - с N. setcheШi и N. ойр^га. Присутствие генома видов секции Suaveolentes
у амфидиплоидов резко снизило урожай по сравнению с исходными сортами (Дюбек 44, Иммунный 580). У амфидиплоидов с N. setcheШi (Ад 4) и N. ойр^га (Ад 5) урожай высушенных листьев с растения был на уровне сорта Иммунный 580, а в большинстве случаев превышал его.
Фертильные межвидовые гибриды - амфидиплоиды по морфологиче- ским признакам сильно не отличались от ам-фигаплоидов и занимали промежуточное положение между исходными родительскими видами.
№
225 200 175 150 125 100 75 50 25 0
JÍ
+
Высота растений, см Число листьев, шт.
Г^Ь
rh
и
а и
175 150 140 130 IIR 110 100 90 SO 70 60 50 40 30 20 10 О
Урожай сухих листьев с растения, г
Й
fob
- 2 - 1 .0
Никотин, %
Длина листа, см Ширина листа, см
Лист среднего яруса
Условные обозначения: 1,„5 - Амфидиплоиды (Ад); | | - признак;
И -Имунный 580: Д - Дюбек 44:
IE
A rfi f -
# -
4 5 fl и
125 100 75 50
гь
Число дней до цветения
Т -размах варьирования 1- признака
Рис. 1. Морфо-биологические признаки амфидиплоидов
Изучение процесса микроспорогенеза у амфидиплоидов показало, что, по сравнению с сортом табака Дюбек 44, он у амфидиплоидов проходил с аномалиями мейоза, особенно в метафазах и анафазах, это в значительной степени влияло отрицательно на фертильность пыльцы. Но при сравнении с амфигаплоидами - стерильными межвидовыми гибридами этот процесс у амфидиплоидов менее нарушен, пыльца жизнеспособная, образуются в достаточном количестве семена.
В метафазе 2 мейоза постепенно уменьшается процент аномалий. На этой стадии микроспорогенеза почти у всех амфидиплоидов увеличилось число клеток, имеющих меньше хромосом вне пластинок метафаз. Эта закономерность наблюдалась почти у всех гибридов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что у гибридов число отстающих хромосом в анафазе составляло 3-5, а метафазах чаще всего вне пластинки деления находилось 1-4 хромосомных ассоциаций.
При сравнении процесса микроспорогенеза у амфиди-плоидов и амфигаплоидов выявляется, что у стерильных гибридов он сильно нарушен, в мейозе встречалось 15 и более хромосом вне пластинок метафаз, а в анафазах до 8 унивалентов.
Анализ микроспорогенеза первого и последующих поколений, в частности шестого поколения фертильных гибридов, показал, что количество хромосом, находящихся вне пластинок в поколениях уменьшается. Отбор оказывал свое влияние на стабилизацию числа хромосом. Однако снижение хромосом было не значительно. Подсчет их числа показал, что большинство экспериментально полученных фертильных гибридов подходило к амфидиплоидам. В пыльцевых клетках можно было обнаружить варьирование гаплоидного числа хромосом от 28 до 52, что объяснялось наличием геномов разных диких видов рода №сойапа. У ги-
бридов с N. debneyi гаплоидное число хромосом в клетках варьировало от 38 до 52, а с N. rosulata - от 30 до 48, с N. seteheШi - от 28 до 40, с N. оЮр^га - от 28 до 37.
Изучение мейоза микроспорогенеза при образовании пыльцы выявило, что у амфидиплоидов с N. debneyi - Ад1, полученных на плазме сорта Иммунный 580, в метафазе 1 (М1) определяется от 44 до 48 хромосомных ассоциаций, в которых присутствовало спаренных по две хромосомы, а иногда и по три, а в метафазе (М2) - 40-43 хромосомы, при этом наблюдалось в М1 до 62 %, а в М2 до 36 % клеток, в которых число хромосом соответствовало гаплоидным наборам скрещиваемых видов. У Ад 2, гибридная комбинация Дюбек 44 х N. debneyi, встречали в М1 от 43 до 50 хромосомных ассоциаций, а в М2 от 38 до 52 хромосом, при этом в М1 до 58 %, а в М2 до 61 % клеток имели гаплоидные наборы скрещиваемых видов.
2, ?—Ml, Al, Т1;
Условные обозначения: | | Л^М... АД5 - амфидиплоиды; клетки с нарушениями, %: I—I -1, I—I - 4, 5, 6, - М2, А2, Т2; М - метафаза, А - анафаза, Т - телофаза; к. - 7 тетрады; | | - фертильность пыльцы, %; £ - размах варьирования фертильности пыльцы
Рис. 2. Нарушение мейоза при микроспорогенезе у амфидиплоидов
У гибрида Ад 3, гибридная комбинация Дюбек 44 х N. rosulata, было в М1 от 34 до 48 хромосом. Отмечалось с 44 ассоциациями в М1 63 % клеток, а с 44 хромосомами в М2 - 29,0 % клеток, что указывало на наличие гаплоидных наборов N. tabacum и N. rosulata.
Амфидиплоиды Ад 4 и Ад 5 (гибридные комбинации Иммунный 580 х N. setchellii, Иммунный 580 х КоЮр^га)
с хромосомами видов секции Tomentosae имели хромосомные ассоциации от 28 до 40 в М1 и от 28 до 37 хромосом в М2. Наибольший процент клеток (47 %, 49 %) был в М2-36 хромосом, т.е. гаплоидные наборы N. tabacum (п=24) и N. setchellii или N. оЮр^га (п=12).
Рис. 3. Число хромосом в метафазах мейоза при микроспорогенезе у амфидиплоидов
Иногда в метафазе 2 (М2) наблюдалось число хромосом Это выявилось во время неправильного расхождения хро-превышающее гаплоидные наборы скрещиваемых видов. мосом в анафазе 1 мейоза при процессе микроспорогенеза.
Таблица 2
Нарушения стадии тетрад при образовании пыльцы у амфидиплоидов
Показатели Амфидиплоиды
Ад 1 Ад 2 Ад 3 Ад 4 Ад 5
Тетрады с микроклетками в % по:
1 10,12 13,06 11,98 12,28 26,04
2 3,21 1,98 2,61 0,37 5,54
3 0,10 0,43 0,63 0,00 0,16
4 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00
Тетрады с микроядрами в % по:
1 6,01 10,18 8,94 18,84 9,09
2 6,21 3,82 0,75 2,93 6,71
3 5,61 2,88 4,33 0,00 2,03
4 1,51 0,77 4,54 0,00 0,22
5 0,00 0,00 3,21 0,00 0,09
6 1,30 0,00 2,33 0,00 0,02
7 0,00 0,00 1,15 0,00 0,06
8 0,00 0,00 1,33 0,00 0,00
9 0,00 0,00 0,39 0,00 0,00
10 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
12 0,00 0,00 0,02 0,00 0,00
13 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00
Тетрады с микроядрами и микроклетками
в %:
Монады в % 8,10 6,27 6,97 4,45 3,16
Диады в % 0,60 0,05 0,66 0,57 0,00
Триады в % 0,10 0,00 0,56 0,07 0,00
Пентады в % 0,20 0,55 0,27 0,50 0,56
Пентады в % 6,00 3,78 2,95 1,24 3,14
Гексады в % 0,30 0,88 0,89 0,17 0,00
Микроклетки и микроядра в %:
Диадах, % 0,70 0,05 0,35 0,21 0,00
Триадах, % 0,30 0,48 0,35 0,13 0,51
Пентадах, % 0,20 0,28 0,55 0,24 0,24
Образование тетрад у амфидиплоидов происходило также с большими отклонениями. Аномалии проявлялись в виде микроклеток, микроядер, диад, триад, пентад в разном процентном отношении. Но при сравнении с амфигаплоидами у исследуемых гибридов их было меньше.
Фертильность пыльцы у амфидиплоидов по сравнению с сортом Дюбек 44, где она была 100 %, не очень высокая (55-80 %). Фертильность пыльцы и ее возможность к оплодотворению семяпочек зависили видимо от числа хромосом в микроспорах пыльников и от аномалий мейоза при микроспорогенезе. Она варьировала у гибридов в больших пределах. В поколениях гибридов фертильность в процентном отношении не увеличивалась.
Все это еще раз подтверждало присутствие значительных нарушений в процессе микроспорогенеза у фертильных межвидовых гибридов - амфидиплоидов, полученных экспериментально. Из данных анализа микроспорогенеза у фертильных гибридов очевидно, что нарушений больше в первом делении мейоза (М1), но значительно меньше, чем у амфигаплоидов. По числу хромосом большая часть фертильных гибридов соответствуют амфидиплоидам. Фертильность их пыльцы понижена по сравнению с сортами из-за отмеченных нарушений.
После исследования пыльцы у гибридов, изучалась их семенная продуктивность. По морфологическим признакам соцветия - высота, диаметр, число коробочек и их размеры, амфидиплоиды были разнообразны. По высоте соцветия выделялись гибриды с хромосомным составом N. debneyi (Ад 1, Ад 2), тогда как у гибридов с N. rosulata (Ад 3), N. setchellii (Ад 4), N.otophora (Ад 5) она значительно меньше. Наиболее раскидистое соцветие наблюдалось у амфидиплоидов с N. debneyi и N. setchellii, а компактное у амфидиплоидов N. rosulata и N.otophora.
Число семенных коробочек на соцветиях гибридных растений варьировало от 10 до 164 штук. Меньше всего коробочек было обнаружено у фертильных межвидовых гибридов, полученных при участии видов секции Tomentosae - N. setchellii и N.otophora.
Семенные коробочки у всех амфидиплоидов мелкие. Наиболее раннее их созревание наступало у гибридов с N. debneyi и N. rosulata, а у гибридов с
N. setchellii и N.otophora было более позднее.
200 175 150 125 100 75 50 25 0
_ гЬ 1
- 1 2
3
4
5
Д
И
Число дней до созревания коробочек
40 35 30 25 20 15 10 5 0
Высота соцветия, см
50 40 30 20 10 0
200 175 150 125 100 75 50 25 0
А
ft
t
3 14 5 Д и| И 2|3 4 5IД I И
i ii Диаметр соцветия, см
Д
И
1 2 3 4 5 Д И
ад
Масса семян, мг
Масса 1000, мг
2
1 0
lil
-L f] -Ь rh -L
1 2 3 4 5
И
i-
3
4
Д
И
Длина, см Ширина, см
Средняя коробочка
25 20
15 10 5
-ri
2
3I45-
Д
И
Масса семян с соцветиями, г
1
2
1
0
Условные обозначения: 1...5 - амфидиплоиды^Ад); ^ - признак; И-Имунный 580; Д - Дюбек 44; - размах варьирования признака Рис. 4. Морфологические признаки соцветия и семенная продуктивность амфидиплоидов - фертильных межвидовых гибридов
Масса семян в коробочке у амфидиплоидов небольшая по сравнению со стандартами - сортами Иммунный 580, Дюбек 44. Наибольшая масса семян в коробочке у Ад5 (гибриды с хромосомным набором от КоЮр^га) - 55,2 мг, наименьшая у Ад3 (гибриды с хромосомным набором от N. rosulata) - 20,2 мг.
Характеристика семенной ]
По массе 1000 семян выделялись гибриды с хромосомным составом видов секции Suaveolentes - N. debneyi, N. rosulata. В поколениях ^5^6) у амфидиплоидов происходят увеличение массы 1000 семян. В последующих семенных поколениях, по сравнению с первым, произошел подъем величин массы 1000 семян у всех гибридов, кроме Ад5 (гибридная комбинация Иммунный 580 х КоЮр^га).
Таблица 3
одуктивности амфидиплоидов
Показатели Амфидиплоиды Д 44 И 580
Ад 1 Ад 2 Ад 3 Ад 4 Ад 5
Число дней до образования коробочек, шт. M 70 65,4 58,5 173,0 158,5 157,5 91
m 1,9 4,8 1,5 11,5 14,0 4,5 1,7
v % 7,1 16,7 5,3 14,5 27,8 7,0 4,0
Число коробочек на соцветии, шт. M 164,7 135,0 86,5 9,5 30,8 124,2 79,1
m 13,4 7,95 12,9 3,9 8,6 5,7 3,6
v % 20,9 15,1 38,4 67,9 88,6 11,9 11,0
Масса семян в коробочке, мг M 25,3 25,6 20,2 21,5 55,2 186,0 119,8
m 0,8 3,6 2,1 4,7 13,2 6,3 5,4
v % 12,4 34,5 27,4 57,3 60,0 9,0 11,0
Масса 1000 семян, мг M 124,3 113,2 100,7 99,0 85,1 100,4 96,8
m 2,7 2,6 3,3 2,8 3,0 2,3 1,7
v % 14,6 13,3 13,3 14,1 16,8 7,2 6,6
Масса семян с соцветия, г M 4,18 3,6 1,8 0,23 2,02 22,8 9,48
m 0,2 0,5 0,4 0,03 0,79 0,4 0,4
v % 17,5 40,0 58,2 70,5 91,0 4,0 10,0
Так же заметна, в большинстве случаев, стабилизация у растений массы 1000 семян в поколениях. Сравнивая ее у гибридов с исходными формами, взятыми для первичных скрещиваний, можно сказать о влиянии генома того или иного вида-опылителя на этот признак.
№сойапа debneyi имел наибольшую массу 1000 семян (101 мг) и у гибридов с его хромосомным составом масса больше. В то время, как у видов N. setcheШi и N. ойр^га она меньше, что, по-видимому, сказалось на этих показателях и у гибридов с этими видами.
Сравнивая массу 1000 семян и массу семян в коробочке у амфидиплоидов, можно сделать заключение, что в семенных коробочках менее 1000 семян, в то время как у исследуемых сортов насчитывается от 1500 до 2000 семян.
Вся масса семян с соцветия у гибридов низкая по сравнению с исходными материнскими сортами - Иммунным 580 и Дюбек 44. Кроме того, большой процент вариации этого признака свидетельствует о том, что наряду с хорошо осемененными формами встречаются и полустерильные формы растений. Наличие низкой семенной продуктивности у некоторых растений можно связать с сильными нарушениями мейоза при микроспорогенезе, а также видимо при макро-спорогенезе, и в связи с этим низкой фертильностью пыльцы, что обуславливало нарушение процесса оплодотворения при опылении семяпочек слабо фертильной пыльцой.
Таким образом, по результатам исследований отмечается, что на форму соцветия и семенную продуктивность ам-фидиплоидов оказали влияние виды -опылители, так как по всем этим признакам они отличались от исходных родительских сортов
Таблица 4
Отношение амфидиплоидов к болезням
Показатели Амфидиплоиды Д 44
Ад 1 Ад 2 Ад 3 Ад 4 Ад 5
Число растений Устойчивость к МР, % 120 120 160 160 200 100
33,3 25,0 0,0 0,0 96,0 75,0
Число растений Устойчивость к ЛМР, % 566 267 420 240 200 100
99,6 96,6 97,8 88,8 82,0 55,0
Число растений Устойчивость к БП, % 270 330 360 270 330 100
77,7 72,7 68,3 98,0 81,3 88,0
Число растений Устойчивость к ВТМ, % 165 112 120 144 140 100
5,5 7,2 8,3 90,3 90,7 85,0
Основным достоинством амфидиплоидов-фертильных межвидовых гибридов является устойчивость к болезням. В этой связи они представляют важное значение для селекции, как исходный материал при создании сортов табака устойчивых к ряду заболеваний.
Полученные в результате научно-исследовательских работ фертильные межвидовые гибриды относились по разному к болезням табака. К вирусу табачной мозаики (ВТМ) проявили устойчивость амфидиплоиды Ад4 (Иммунный 580 х N. setchellii) и Ад5 (Иммунный 580 х N. ойр^га). Гибриды Ад1 (Иммунный 580 х N. debneyi) и Ад2 (Дюбек 44 х N. debneyi) с геномом N. debneyi, а также с геномом N.
rosulata Ад3 (Дюбек 44 х N.rosulata) оказались сильно восприимчивы к этому заболеванию.
Большинство амфидиплоидов поражались мучнистой росой (МР) и только гибрид с N. ойр^га Ад 5 (Иммунный 580 х N. ойр^га) проявил высокую устойчивость к этому заболеванию.
Полученные гибриды, как и ранее предполагалось, проявили устойчивость к пероноспорозу (ЛМР) (82-97,5 %). В отличие от сорта Иммунный 580 (55 %) гибриды были намного устойчивее, что можно объяснить присутствием в их хромосомном наборе генов диких видов, проявляющих устойчивость к этому заболеванию.
Таблица 5
Отношение амфидиплоидов к пероноспорозу (ЛМР) в поколениях
Гибриды № Число расте- Растения с баллами Устойчивость
поколения ний 0 1 2 3 4 5 при 0; 1; 2б, %
Ад 1 И580 х F1 98 49 41 8 0 0 0 100,00
N. debneyi F2 103 75 66 22 0 0 0 100,00
F3 305 137 137 29 2 0 0 99,34
Ад 2 Д44 х F1 58 27 18 12 1 0 0 98,27
N. debneyi F2 31 10 11 8 2 0 0 93,54
Ад 3 Д44 х F1 23 5 15 2 1 0 0 95,65
N. rosulata F2 19 7 11 1 0 0 0 100,00
Ад 4 И580 х F1 29 9 7 12 1 0 0 96,55
N. otophora F2 75 0 8 38 26 3 0 61,33
Ад 5 И580 х F1 64 12 40 8 3 1 0 93,75
N. setchellii F2 56 16 23 7 10 0 0 82,14
В поколениях амфидиплоидов встречались растения разнообразные по устойчивости к пероноспорозу (ЛМР -ложная мучнистая роса): иммунные (0 баллов), высокоустойчивые (1 балл), устойчивые (2 балла) и небольшое число восприимчивых (3-4 балла), появление которых можно объяснить нарушениями макро-и микроспорогенеза. Нарушения в этих процессах проявились путем выбросов уни-валентов, которые могли быть хромосомами диких видов с генами устойчивости. Это вело к нарушениям оплодотворе-
Результаты оценки амфидиплоидов на у
ния и появлению растений с низкой устойчивостью к заболеванию. Наиболее устойчивыми к пероноспорозу (ЛМР) выявлены гибриды с геномами видов секции Suaveolentes - N.debneyi и N. rosulata (Ад1, Ад2, Ад3).
Белой пестрицей (у-вирус картофеля) амфидиплоиды поражались не сильно. Наиболее устойчивы к ней формы с геномом N.setchellii (98 %). Остальные гибриды (Ад1, Ад2, АД3, Ад5) менее устойчивы по сравнению с сортом Иммунный 580.
Таблица 6
ойчивость к черной корневой гнили (ЧКГ)
Гибриды Число растений Развитие ЧКГ, % Степень устойчивости к ЧКГ Оценка по внешнему виду, балл Здоровые растения %
Ад1 76 1,0 Устойчивость 2 42,3
Ад2 50 0,8 Устойчивость 1 65,0
Ад3 57 2,5 Устойчивость 2 53,2
Ад4 51 20,2 Восприимчивость 3 0,0
Ад5 58 15,0 Восприимчивость 3 0,0
И580 50 32,3 Восприимчивость 2-3 0,0
Гибриды с геномами видов секции Suaveolentes проявили высокую устойчивость к черной корневой гнили (ЧКГ), а гибриды с геномами видов
секции Tomentosae были восприимчивы. В заключении можно констатировать, что амфидиплоиды межвидовых гибридов: Иммунный 580 х N.debneyi (Ад1) устойчивы к пероноспорозу, черной корневой гнили; Дюбек 44 х N.debneyi (Ад2) - к пероноспорозу и черной корневой гнили; Дюбек 44 х N. rosulata (Ад3) - к пероноспорозу и черной корневой гнили; Иммунный 580 х N. setchellii (Ад4) - к вирусу табачной мозаики, пероноспорозу, белой пестри-це; Иммунный 580 х N. otophora (Ад5) - к вирусу табачной мозаики, мучнистой росе, пероноспорозу.
Результаты научно-исследовательских работ свидетельствуют о том, что при экспериментальном удвоении наборов хромосом стерильных межвидовых гибридов - амфигапло-идов можно получить фертильные межвидовые гибриды -амфидиплоиды и путем селекционно-генетических отборов выделить лучшие растения по морфологическим признакам
- крупнолистные, высокорослые, характеризующиеся относительно нормальным мейозом в процессе микроспорогене-за, высокой фертильностью пыльцы и хорошо осемененные, устойчивые к ряду болезней, которые могут быть использованы в качестве базисного исходного материала в селекции на устойчивость к болезням и другим морфо-биологиче-ским признакам при создании сортов табака.
Межвидовая гибридизация, сопровождаемая экспериментальным
удвоением числа хромосом, ведет к возникновению ал-лополиплоидов, у которых восстанавливается парность хромосом видов, участвующих в скрещиваниях, а следовательно и нормальная конъюгация. Таким путем частично преодолевается стерильность гибридов от инконгруэнтного скрещивания (Хвостова, 1975; Ларькина, 2015).
У экспериментально полученных амфидиплоидов (фер-тильные межвидовые гибриды) несовместимости между парными геномами культурного табака и диких видов Nicotiana проявлялись только у некоторых растений в виде
низкой фертильности пыльцы и малой семенной продуктивностью, на что влияли нарушения мейоза, приводящие к образованию анеуплоидных клеток. Образование разнохро-мосомных гамет давало начало неуравновешенным амфиди-плоидам, у которых деление еще больше нарушено, что вело к низкой семенной продуктивности межвидовых гибридов.
Амфидиплоиды - фертильные межвидовые гибриды, полученные экспериментально от N. tabacum с N.debneyi, N.rosulata, N.setchellii, N.otophora, имели также нарушения мейоза микроспорогенеза, но процент их был меньше, чем у амфигаплоидов. В геноме у гибридов в метафазе I обнаруживались биваленты табака и биваленты диких видов Nicotiana, этим можно объяснить меньшее число аномалий мейоза. Так как происходила нормальная конъюгация близкородственных хромосом, что отмечалось и у других амфидиплоидов, полученных от других отдаленных видов. Но в тоже время у гибридов встречались отклонения числа хромосом от амфидиплоидного, что происходило, видимо, в результате неправильного расхождения хромосом в анафазах и возможного образования тетравалентов в метафазе I при взаимодействии гомологичных хромосом диких видов Nicotiana и культурного табака. Разнохромосомные гаметы давали начало неуравновешенным амфидиплоидам, у которых деление еще больше нарушено, такие амфидиплои-ды встречались и в исследованиях других гибридов в роде Nicotiana (Жуков, 1961; Ларькина, 2004).
При образовании тетрад у амфидиплоидов наблюдались также нарушения, но уже меньше по сравнению с амфига-плоидами (Ларькина, 2004, 2015). Пыльца была фертильна.
Все встречающиеся аномалии мейоза, а особенно появление ане-уплоидных половых клеток, дали нестабильную по фертильности пыльцу, что способствовало слабой семенной продуктивности некоторых растений амфидиплои-дов, особенно у гибридов с N.otophora и N.setchellii. Отбор растений в поколениях с высокой фертильностью пыльцы уменьшал аномалии мейоза.
Таким образом, в процессе работы с гибридами в поколениях наступала относительная нормализация мейоза. В проведенных исследованиях отбор растений с правильным мейозом достигался путем экспериментальной полиплоидии, т.е. путем удвоения числа хромосом у амфигаплоидов.
Один из важнейших генетических методов при получении нового селекционного исходного материала была полиплоидия, позволившая преодолеть стерильность межвидовых гибридов. Для её применения использовали два пути. В культуре in vitro шестикратным пассированием каллуса, о чем ранее также упоминалось в работах Р.Г. Бутенко (1971), индуцированного из листа, образованием из него путем органогенеза стеблевых почек и проростков, укоренением их на питательной среде в пробирках, были получены расте-ния-регенеранты среди которых обнаружены амфидиплои-ды с геномами N.setchellii и N.otophora. С другими видами амфидиплоиды не были получены при использовании этого метода. У стерильных растений, индуцированных в изолированной пробирочной культуре in vitro, после обработки
точек роста 0,3 % раствором колхицина, способствующего образованию полиплоидов, были выделены фертильные межвидовые гибриды - амфидиплоиды с видами N.debneyi, N.rosulata.
Таким образом, применение различных способов преодоления несовместимости разных видов обеспечило успех проведенных гибридных скрещиваний и позволило получить фертильные межвидовые растения между N.tabaram и видами секций Tomentosae и Suaveolentes.
Основным методом, позволяющим получить новые формы растений, был пробирочный метод изолированной культуры тканей и органов in vitro, т.е. использование искусственного опыления и оплодотворения, способностей тканей табачных растений вегетативно в искусственных условиях, при определенных специализированных питательных средах в пробирках образовывать растения - реге-неранты новых гибридов. В этом случае, для представителей рода Nicotiana подбирались специальные минеральные питательные компоненты, создающие эмбриологические и генетические возможности получать жизнедеятельные растения в конечном результате. Применение биотехнологии - культуры in vitro открыло большие возможности использования межвидовых скрещиваний для объединения в одном организме признаков разных видов и создания новых перспективных форм гибридов, которые широко могут применяться в селекционном процессе при создании новых сортов с желаемыми признаками. Из отмеченного следует, что диапазон межвидовой гибридизации ещё неисчерпаем и неограничен. Роль разнообразных методических подходов в исследованиях очень важна и создает большие возможности для получения нового перспективного исходного селекционного материала.
Межвидовые гибриды являются ценным исходным материалом для создания новых сортов растений, так как они несут в себе свойства культурных растений, сочетающиеся с устойчивостью к болезням и другими ценными признаками, привнесенными от диких видов.
Литература
1. Виноградов В.А., Ларькина Н.И. и др. Болезни видов рода Nicotiana и иммуно-генетические основы селекции на устойчивость к ним // Коллективная монография.- Краснодар, Всероссийский НИИ табака, махорки и табачных изделий, 2013.
2. Виноградов В.А., Ларькина Н.И. и др. Атлас болезней табака и махорки // Методическое и учебное пособие.- Краснодар, Всероссийский НИИ табака, махорки и табачных изделий, 2014.
3. Ларькина Н.И. Научные основы межвидовой гибридизации на плазме Nicotiana tabacum Lin. Ç // Монография.-Краснодар, Всероссийский НИИ табака, махорки и табачных изделий, 2015.
