CC BY
30ФТИЗИАТРИЯ
ияиныш
тч
Современный алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза
Л. Н. Черноусова; ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, г. Москва
Отечественный и международный опыт борьбы с туберкулезом свидетельствует о необходимости совершенствования существующих и разработки новых методов лабораторной диагностики туберкулеза. Основными методами лабораторной диагностики туберкулеза являются бактериологические методы. Выделение чистой культуры микобакте-рий, идентификация и определение лекарственной чувствительности необходимы при подтверждении диагноза, а также для назначения адекватной терапии и контроля эффективности лечения.
Основным недостатком традиционных методов бактериологического анализа является длительность получения результатов, что связано с биологическими свойствами возбудителя туберкулеза — низкой скоростью роста. В итоге подготовка результатов полного исследования, включая данные по устойчивости к резервным препаратам, занимает около 70 суток.
Современныйалгоритммикробио-логической диагностики туберкулеза и определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) микобакте-рий, не отменяя традиционные методы (микроскопию и культураль-ные исследования диагностического материала на плотной питательной среде), включает новые ускоренные методы обнаружения микобакте-рий, оценки резистентности к противотуберкулезным препаратам и идентификации до вида (рис. 1). В последнее время многие лаборатории были оснащены современным оборудованием, позволяющим значительно сократить время проведения анализа, стандартизовать его процедуру, уменьшить влияние человеческого фактора на результат исследования.
Золотым стандартом микробиологической диагностики туберкулеза является культивирование в обогащенной жидкой питательной среде в системе ВАСТЕС MGIT 960 США) с автоматизированным учетом роста микобактерий, который
регистрируется каждый час. При поступлении в лабораторию диагностический материал одновременно подвергается бактериоскопии, культуральным исследованиям на жидкой питательной среде, при отсутствии ВАСТЕС MGIT 960 — на плотной питательной среде, а также молекулярно-генетическим исследованиям на ДНК M.tuberculosis методом ПЦР в режиме реального времени.
При выделении культуры из питательных сред обязательно должна быть проведена идентификация выросших бактерий. Для этого применяются:
• микроскопия с окраской по Цилю — Нильсену
(для уточнения морфологии икислотоустойчивости бактерий);
• посев на кровяной агар (для обнаружения контаминирующей микрофлоры);
• идентификационный
иммунохроматографический тест TBc Ю, основанный на обнаружении микобактериального белка МРТ64, который выделяется из клеток МТЬс в процессе культивирования.
Использование TBc Ю-теста сократило время проведения дифференциации микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезных микобактерий до 20 минут. Тест обладает достаточной чувствительностью и специфичностью и удобен для повседневной практики микобактериологической лаборатории.
После идентификации культуры как микобактерий туберкулеза проводится тестирование на чувствительность к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда. Культивирование диагностического материала в жидких питательных средах и определение
Рис. 1. Алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза
www.akvarel2002.ru №5 (36) • 2013 45
Ш11Ы111
ЖРЛЧ
гастроэнтерология
лекарственной чувствительности в автоматизированной системе ВА-СТЕС MGIT 960 значительно сокращает сроки получения результатов (до 28 дней).
Повышению эффективности лабораторной диагностики туберкулеза также способствует использование молекулярно-генетических методов. Метод ПЦР позволяет обнаружить ДНК M.tuberculosis в диагностическом материале в течение 1—2 дней. При выявлении ДНК M.tuberculosis образцы анализируются на устойчивость к рифампи-цину, изониазиду и фторхинолонам методом ПЦР в режиме реального времени (Синтол, Россия), технологией ДНК-стрипов (Hain lifescience, Германия), основанной на детекции мутаций в геноме M.tuberculo-sis, определяющих устойчивость к препаратам первого и второго ряда. Результаты лекарственной чувствительности из БК+ образцов могут быть получены в срок до трех дней с момента поступления диагностического материала в лабораторию.
Для скрининга устойчивости M.tuberculosis из диагностического материала к рифампицину можно использовать картриджи вепеХрег! ТБ/Я!Р (ОеАеЮ, США).
Необходимо подчеркнуть, что по результатам молекулярно-генетических исследований выбирается режим химиотерапии в начале лечения, а коррекция химиотерапии проводится по результатам расширенного тестирования устойчивости ко всем противотуберкулезным препаратам при культивировании M.tuberculosis в жидких или плотных средах.
Внедрение высоких технологий в алгоритм бактериологической диагностики туберкулеза позволяет проводить коррекцию химиотерапии в интенсивной фазе лечения, что дает возможность добиться абациллирования мокроты в более короткие сроки и ускорить инволюцию деструктивных изменений в легких.
В настоящее время в алгоритм диагностики включена идентификация нетуберкулезных микобактерий
до вида на основе геномного анализа на ДНК-стрипах (Hain lifescience, Германия) или протеомного анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Учитывая, что нетуберкулезные микобактерии, как правило, устойчивы к противотуберкулезным препаратам и этим маскируют МЛУ- и ШЛУ-штаммы туберкулезных микобактерий, в лаборатории проводят определение чувствительности НТМБ с помощью тест-системы SENSITITRE (TREK Diagnostic system, Англия), которая позволяет определять минимальные подавляющие концентрации 18 антибактериальных препаратов для быстро и медленно растущих микобактерий.
Новейшие методы бактериологической диагностики туберкулеза позволяют повысить эффективность лечения, сократить сроки пребывания пациентов в стационаре и предотвратить распространение лекарственно-устойчивых штаммов.
Методика «ХЕЛПИЛ-тест» и устройства для ее осуществления
В. Е. Милейко; ООО «Синтана СМ», г. Санкт-Петербург
Быстрый «сухой» уреазный тест для анализа уреаз-ной активности биоптата, известный сегодня под названием «методика ХЕЛПИЛ-тест», изобретен в начале 1997 года инициативной группой разработчиков в составе М. А. Дмитриенко, В. Е. Корниенко и В. Е. Милейко и выпускается в Российской Федерации с 1997 года. Этот «сухой» уреазный тест на основе впитывающего волокнистого материала, субстрата и бромтимолового синего в качестве хромогенного вещества [1], как показали клинические испытания [2] и широкая длительная практика применения, обладает очень высокими диагностическими характеристиками: чувствительность и селективность (специфичность) составляет 96—98%, время анализа — 15—180 секунд.
В основе превосходства методики ХЕЛПИЛ-тест над другими уреазными тестами лежит подход, который принципиально отличает ее от других аналогичных тест-систем.
Во-первых, тест использует в качестве реакционной среды не стандартизованный раствор буфера, а как раз различную по свойствам межклеточную жидкость биопта-та, которая отличается между собой по рН и содержанию уреазы. Бактерия сама производит удобную для анализа среду, и незачем ее усреднять до среды, где активность бактериальной уреазы падает или нивелируется.
Во-вторых, пораженная ткань отличается морфологически. Она становится более рыхлой и содержит больше межклеточной жидкости, и отбираемую жидкую фазу не нужно усреднять по объему. Наоборот — чем больше биоптаты отличаются по содержанию межклеточной жидкости, тем больше ее впитывается в адсорбент и, следовательно, больше — в количественном отношении — поступает фермента для взаимодействия с субстратом.
Третьим отличительным качеством теста является то, что индикатор в кислой форме является гидрофильным материалом и начинает растворяться только выше определенного рН. То есть его растворение в водной среде начинается только после стартового взаимодействия субстрата и фермента, причем хромогенное вещество в растворенной форме тут же адсорбируется, главным образом, на поверхности волокон одного из компонентов сложного адсорбента, и тест-система приобретает интенсивную окраску не в объеме, а на поверхности волокон. При этом сам «отработанный» индикатор выводится из сферы реакции.
Таким образом, эти различия в свойствах биоптата и тест-системы при должном подборе количеств субстрата (карбамида), рН-индикатора и свойств самого кислотно-основного индикатора позволили удачно дифференцировать анализируемый биологический материал по присутствию Helicobacter pylori. «Сухой» уреазный тест HELPIL (ХЕЛПИЛ) позволил сократить время аналитической
№5 (36) • 2013
www.akvarel2002.ru
