CC BY
26Ш11Ы111
ЖРЛЧ
гастроэнтерология
лекарственной чувствительности в автоматизированной системе ВА-СТЕС MGIT 960 значительно сокращает сроки получения результатов (до 28 дней).
Повышению эффективности лабораторной диагностики туберкулеза также способствует использование молекулярно-генетических методов. Метод ПЦР позволяет обнаружить ДНК M.tuberculosis в диагностическом материале в течение 1—2 дней. При выявлении ДНК M.tuberculosis образцы анализируются на устойчивость к рифампи-цину, изониазиду и фторхинолонам методом ПЦР в режиме реального времени (Синтол, Россия), технологией ДНК-стрипов (Hain lifescience, Германия), основанной на детекции мутаций в геноме M.tuberculo-sis, определяющих устойчивость к препаратам первого и второго ряда. Результаты лекарственной чувствительности из БК+ образцов могут быть получены в срок до трех дней с момента поступления диагностического материала в лабораторию.
Для скрининга устойчивости M.tuberculosis из диагностического материала к рифампицину можно использовать картриджи вепеХрег! ТБ/Я!Р (ОеАеЮ, США).
Необходимо подчеркнуть, что по результатам молекулярно-генетических исследований выбирается режим химиотерапии в начале лечения, а коррекция химиотерапии проводится по результатам расширенного тестирования устойчивости ко всем противотуберкулезным препаратам при культивировании M.tuberculosis в жидких или плотных средах.
Внедрение высоких технологий в алгоритм бактериологической диагностики туберкулеза позволяет проводить коррекцию химиотерапии в интенсивной фазе лечения, что дает возможность добиться абациллирования мокроты в более короткие сроки и ускорить инволюцию деструктивных изменений в легких.
В настоящее время в алгоритм диагностики включена идентификация нетуберкулезных микобактерий
до вида на основе геномного анализа на ДНК-стрипах (Hain lifescience, Германия) или протеомного анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Учитывая, что нетуберкулезные микобактерии, как правило, устойчивы к противотуберкулезным препаратам и этим маскируют МЛУ- и ШЛУ-штаммы туберкулезных микобактерий, в лаборатории проводят определение чувствительности НТМБ с помощью тест-системы SENSITITRE (TREK Diagnostic system, Англия), которая позволяет определять минимальные подавляющие концентрации 18 антибактериальных препаратов для быстро и медленно растущих микобактерий.
Новейшие методы бактериологической диагностики туберкулеза позволяют повысить эффективность лечения, сократить сроки пребывания пациентов в стационаре и предотвратить распространение лекарственно-устойчивых штаммов.
Методика «ХЕЛПИЛ-тест» и устройства для ее осуществления
В. Е. Милейко; ООО «Синтана СМ», г. Санкт-Петербург
Быстрый «сухой» уреазный тест для анализа уреаз-ной активности биоптата, известный сегодня под названием «методика ХЕЛПИЛ-тест», изобретен в начале 1997 года инициативной группой разработчиков в составе М. А. Дмитриенко, В. Е. Корниенко и В. Е. Милейко и выпускается в Российской Федерации с 1997 года. Этот «сухой» уреазный тест на основе впитывающего волокнистого материала, субстрата и бромтимолового синего в качестве хромогенного вещества [1], как показали клинические испытания [2] и широкая длительная практика применения, обладает очень высокими диагностическими характеристиками: чувствительность и селективность (специфичность) составляет 96—98%, время анализа — 15—180 секунд.
В основе превосходства методики ХЕЛПИЛ-тест над другими уреазными тестами лежит подход, который принципиально отличает ее от других аналогичных тест-систем.
Во-первых, тест использует в качестве реакционной среды не стандартизованный раствор буфера, а как раз различную по свойствам межклеточную жидкость биопта-та, которая отличается между собой по рН и содержанию уреазы. Бактерия сама производит удобную для анализа среду, и незачем ее усреднять до среды, где активность бактериальной уреазы падает или нивелируется.
Во-вторых, пораженная ткань отличается морфологически. Она становится более рыхлой и содержит больше межклеточной жидкости, и отбираемую жидкую фазу не нужно усреднять по объему. Наоборот — чем больше биоптаты отличаются по содержанию межклеточной жидкости, тем больше ее впитывается в адсорбент и, следовательно, больше — в количественном отношении — поступает фермента для взаимодействия с субстратом.
Третьим отличительным качеством теста является то, что индикатор в кислой форме является гидрофильным материалом и начинает растворяться только выше определенного рН. То есть его растворение в водной среде начинается только после стартового взаимодействия субстрата и фермента, причем хромогенное вещество в растворенной форме тут же адсорбируется, главным образом, на поверхности волокон одного из компонентов сложного адсорбента, и тест-система приобретает интенсивную окраску не в объеме, а на поверхности волокон. При этом сам «отработанный» индикатор выводится из сферы реакции.
Таким образом, эти различия в свойствах биоптата и тест-системы при должном подборе количеств субстрата (карбамида), рН-индикатора и свойств самого кислотно-основного индикатора позволили удачно дифференцировать анализируемый биологический материал по присутствию Helicobacter pylori. «Сухой» уреазный тест HELPIL (ХЕЛПИЛ) позволил сократить время аналитической
№5 (36) • 2013
www.akvarel2002.ru
гастроэнтерология
ияиныш
тч
реакции более чем в 10 раз по сравнению с самыми быстрыми вариантами «жидких» тестов. Контрольными точками в методике ХЕЛПИЛ-тест стали 30 секунд, 1 минута и 3 минуты. При этом следует помнить, что уже через 5 минут тест становился непригодным для оценки — это «плата» за скорость анализа. Поэтому некоторые пользователи «с непривычки» умудрялись пропускать контрольное время и попадали «под штраф».
Тест-система H ELPIL-test изначально выпускалась в виде дисков диаметром 4 или 5 мм (рис. 1) и упаковывалась либо в пакеты, либо в пробирки. Анализ предполагалось проводить либо на чашке Петри, либо путем контакта микросалфетки HELPIL (ХЕЛПИЛ) с биоптатом непосредственно в щипцах для биопсии до изъятия биоптата. В такой форме тест-системы под названием «Тест-система HELPIL-test» выпускаются и сегодня компанией ООО «Синтана СМ » (www. sintana.ru), так как упаковки по 50 (рис. 2), 500 и 1000 аналитических единиц (штук) пользуются достаточным спросом. Одновременно с выпуском дисков «в россыпь» появились различные дизайнерские варианты изделий. Так, компания ООО «АМА» (с 1997 года по 2003 год), ООО «Синтана СМ» (с 1999 года по настоящий момент) и ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики» (с 2003 года по настоящий момент) выпускали или продолжают выпускать тест-системы с различным закреплением диска HELPIL-тест на полимерную пленку в составе держателя из картона. Аналогичную продукцию под названием HelPil-tests, как и «жидкий» уреазный тест, выпускает SIA MedPro (Латвия). С 2009 года ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики» приступило к выпуску теста под названием ХЕЛПИЛ®лента, где группа дисков закреплена на нейтральную по отношению к тест-системе ХЕЛПИЛ® клеевую основу.
Недостатком методики является то, что тест-системы HELPIL-тест, будучи смоченными или влажными, чувствительны к аммиаку. Он может оказаться в газовой среде помещения в результате применения дезинфекан-тов или моющих средств, содержащих летучие амины. Кроме того, анализ, проводимый одновременно на близко расположенных тест-системах, может привести к ложному срабатыванию одной из них. К «дизайнерским» недостаткам можно отнести и то, что в контакте с другими материалами тест может утратить свои диагностические свойства или изменить аналитические характеристики. Например, картон и многие сорта бумаги обладают уреазной активностью, и прямой контакт с ними может привести к ложноположительному результату анализа. Поэтому при закреплении дисков HELPIL-test на картонном носителе (тест-системы HELPIL-test 1, HELPIL-тест 3, HELPIL-test 12) их приходится изолировать от картона, так как сам картон не является стерильным материалом и как таковой уже содержит уреазу различного происхождения. В этих тест-системах диск HELPI L-test закреплен непосредственно на прозрачный полимерный материал в круглом отверстии на краю носителя, изготовленного из ламинированного картона. В таком варианте оформления тест-системы прозрачное окно позволяет оценить размеры и характер пятна под исследуемым материалом, не снимая биоптата с поверхности теста. Однако спрос на эти системы на отечественном рынке невысок из-за их стоимости. Тест-системы, которые производит ООО «Синтана СМ», как в методике их использования, так и в конструктивном решении тест-системы, являются похожими авторскими вариантами оригинального теста для выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест. В то же время эти тест-системы, несмотря на их внешнее сходство, не являются идентичными конструктивно и технологически. Каждая
Рис. 1. Впитывающие диски НЕЬРШеэ^ импрегнированные индикаторной рецептурой для контроля уреазной активности
Рис. 2. Впитывающий диск тест-системы HELPIL-test, закрепленный на держателе из ламинированного картона
из них выпускается с оригинальными технологическими ноу-хау, что обуславливает их различную себестоимость. Таким образом, выбор остается за пользователем.
Кажущаяся простота конструкции тест-системы и непритязательность аналитической методики ХЕЛПИЛ-тест обуславливает не только широкое использование этого диагностического метода в реальном здравоохранении, но и создает условия для изготовления подделок и имитаций, не соответствующих по потребительским свойствам авторским вариантам тест-системы. Это негативно влияет на ситуацию с распространением оригинальных тест-систем и вводит пользователей в заблуждение на предмет качества тестов и дееспособности оригинальной методики.
Литература
1. Дмитриенко М. А., Корниенко Е. А., Милейко В. Е. Патент РФ №2184781, С 12 Q 1/04, 1/00 «Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления», опубл. 10.07.2002. Бюл. №19, приоритет от 30.09.1997.
2. Корниенко Е. А., Гольбиц С. В., Милейко В. Е. и др. О диагностике инфекции Helicobacter pylori у детей // Росс. вестник перинатологии и педиатрии. — 1998. — №5. — С. 34.
www.akvarel2002.ru
№5 (36) • 2013
