Научная статья на тему 'Быстрые сухие уреазные тесты для диагностики хеликобактериоза'

Быстрые сухие уреазные тесты для диагностики хеликобактериоза Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

CC BY
480
23
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Быстрые сухие уреазные тесты для диагностики хеликобактериоза»



Быстрые сухие уреазные тесты для диагностики хеликобактериоза

В. Е. Милейко, ООО «Синтана СМ», г. Санкт-Петербург

В 1984-1986 гг. Барри Маршалл и Робин Уоррен установили, что в возникновении и развитии ан-трального гастрита и язвенной болезни этиопатогенную роль играет бактерия Helicobacter pylori. Впоследствии за это открытие они были удостоены звания лауреатов Нобелевской премии.

Благодаря этому открытию существенно изменилось само восприятие гастроэнтерологии как науки. Кардинально изменилась и терапия гастродуоденальных патологий. Гастроэнтерология стала современной, динамично развивающейся частью медицинской науки, причем для решения вопросов эффективной диагностики и лечения хелико-бактериоза были задействованы значительные интеллектуальные и финансовые средства.

Несмотря на проблемы, связанные с «перестройкой», к началу 2000 года в России были созданы и внедрены в широкую практику оригинальные диагностические методики, позволяющие быстро и точно выявить присутствие Helicobacter pylori в организме человека.

Эти методики весьма разнообразны. Самые надежные и простые в исполнении построены на оценке уреазной активности бактерии. В основе этих инвазивных и неинвазивных методик лежит уникальная способность Helicobacter pylori синтезировать в огромных количествах высокоактивный фермент уреазу, что выделяет ее из числа других бактерий - продуцентов уреазы и дает возможность создать на этой основе селективные и высокочувствительные методики медицинской диагностики.

Первая из них по широте применения в медицинской среде - методика диагностики по оценке уре-азной активности биоптата. Анализ выполняется in vitro после того, как биоптат получен инвазивно и травматично в ходе эндоскопического исследования. При выполнении квалифицированной прицельной биопсии этот диагностический метод достаточно достоверен и эффективен

как для первичной диагностики, так и для контроля терапии (эрадикации хеликобактера). В отечественной практике достаточно широко используется так называемый «сухой» уреазный тест — методика ХЕЛПИЛ-тест тест-системы ХЕЛПИЛ® (HelPil-test, HELPIL-тест, HELPIL-test, патент РФ №2184781). Этот тест отличается от гелевого варианта КЛО-теста (CLO-test), предложенного для этой цели Б. Маршаллом, не только названием, но и аналитическим подходом.

Следует отметить, что для оценки уреазной активности биологического образца традиционно применялись жидкие среды, содержащие карбамид (мочевину) и кислотно-основной индикатор с рН перехода, близкой к нейтральной среде [1]. Большинство этих жидких сред содержало в своем составе фосфатный или цитратный буфер. Количество и состав буфера зачастую влияют не только на хранимость раствора, но и определяют характер кислотно-основного перехода индикатора и скорость срабатывания тест-системы. Причем ионная сила раствора влияет на характер цветового перехода, а тип и концентрация буфера, в свою очередь, — на активность фермента. Активность фермента, в том числе уреазы Helicobacter pylori, существенно зависит и от рН среды. Это делает подбор реакционной среды весьма щепетильным делом. Тем не менее, рецептуры на основе фосфатного или сложного составного буфера с консервантами (например, азид натрия [2]) или без таковых получили широкое распространение [3]. Стандартизованные тест-системы выпускались и сегодня выпускаются как в виде растворов, так и в виде гелевых таблеток. Промежуточным, «двухкомпонентным», вариантом является «Де-Нол»®-тест, где к лиофилизированному субстрату непосредственно перед тестированием добавляется жидкая фаза тест-системы, и уже в образовавшийся раствор помещается биоптат.

Наилучшими «жидкостными» тест-системами были стеклянные микроампулы, заполненные раствором индикатора фенолового красного в фосфатном буфере. Буфер был предварительно оттитрован до начала цветового перехода с бесцветного на красный (соломенно-желтая окраска). Ампулы заполнялись жидкостью в емкости с горячим раствором, а затем запаивались в стерильных условиях. В процессе применения носик ампулы отламывался, и биоптат помещался в раствор индикатора непосредственно в ампуле. Уреазная активность оценивалась по времени появления малинового окрашивания. Такая тест-система выпускалась с 1992 по 1996 годы в Санкт-Петербурге компанией СТ «Синтана Прозум». Данная методика позволяла достаточно быстро оценить уреазную активность биологического образца. Время первой оценки результата соответствовало трем минутам (+++), пятнадцати минутам (++) и трем часам (+). За время, не превышающее трех часов, и без термостатирова-ния и другого специального оборудования удавалось весьма достоверно установить наличие инвазии Helicobacter pylori с чувствительностью и селективностью 94—95%. Другие аналогичные тест-системы, включая «гелевые», не превосходили описанную выше ампулированную тест-систему по реальной чувствительности, специфичности, времени срабатывания, хранимости и другим рабочим, аналитическим и диагностическим характеристикам. Однако аналогам жидкого уреазного теста в микроампулах в продвижении на российский рынок мешала не только их высокая цена, но и низкая сохраняемость (требовались специальные условия хранения), потребность в термостатировании при температуре выше комнатной на сутки и более в ходе проведения самой аналитической реакции.

Именно поэтому перед инициативной группой разработчиков (Дми-триенко М. А., Корниенко В. Е. и Ми-лейко В. Е.) встала новая задача:

www.akvarel2002.ru

№4 (35) • 2013

■dim j

гастроэнтерология

разработать простой в использовании и высокоэффективный уреазный тест, который позволял бы не только быстро и эффективно анализировать жидкую фазу биоптата на уре-азную активность, но и сохранить возможность использования того же самого биоптата для гистологических (морфологических) исследований по традиционным методикам. В начале 1997 года эта задача была успешно решена [4] путем создания «сухого» уреазного теста (далее по тексту — тест-система HelPil-test) на основе впитывающего волокнистого материала, субстрата и бром-тимолового синего в качестве хро-могенного вещества [5]. Наилучшим материалом для тест-системы была «бумага» для биохимических тестов Малинской фабрики.

В основе превосходства методики ХЕЛПИЛ-тест (первоначальное авторское назание тест-системы и методики его применения) над другими уреазными тестами лежит аналитический подход, который принципиально отличает HelPil-test от других тест-систем.

Во-первых, HelPil-test использует в качестве реакционной среды не стандартизованный раствор буфера, а как раз различную по свойствам межклеточную жидкость био-птата, которая отличается между собой по рН и содержанию уреазы. Бактерия сама производит удобную для анализа среду, ее незачем усреднять до среды, где активность бактериальной уреазы падает или нивелируется.

Во-вторых, пораженная ткань отличается морфологически: она становится более рыхлой и содержит больше межклеточной жидкости; отбираемую жидкую фазу незачем усреднять по объему. Наоборот — чем больше биоптаты отличаются по содержанию межклеточной жидкости, тем больше ее впитывается в адсорбент и, следовательно, больше фермента в количественном отношении поступает для взаимодействия с субстратом.

Третьим отличительным качеством тест-системы HelPil-test является то, что кислотно-основной индикатор в кислой форме является гидрофильным материалом и начинает растворяться только выше определенного рН. То есть растворение индикатора в водной среде начинается только после стартового

взаимодействия субстрата и фермента, причем хромогенное вещество в растворенной форме тут же адсорбируется силами Ван-дер-Ваальса на поверхности волокон одного из компонентов сложного адсорбента, и тест-система приобретает интенсивную окраску не в объеме, а на поверхности волокон. При этом сам «отработанный» индикатор выводится из сферы реакции.

Таким образом, эти различия в свойствах биоптата и тест-системы HelPil-test при должном подборе количеств субстрата (карбамида) и рН-индикатора и свойств самого кислотно-основного индикатора позволили удачно дифференцировать анализируемый биологический материал по присутствию Helicobacter pylori. «Сухой» уре-азный HelPil-test позволил сократить время аналитической реакции более чем в 10 раз по сравнению с самыми быстрыми вариантами «жидких» тестов. Контрольными точками в методике HelPil-test стали 30 секунд, 1 минута и 3 минуты. При этом следует отметить, что тест-система HelPil-test является быстродействующей, и уже через 5 минут после начала аналитической реакции тест становится непригодным для оценки инвазии Helicobacter pylori. Такие сроки выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест могут привести к диагностическим ошибкам, потому что некоторые пользователи «с непривычки» умудряются пропускать контрольное время, рекомендованное в экспресс-методике для оценки степени инвазии Helicobacter pylori.

Тест-система HelPil-test изначально выпускалась в виде дисков диаметром 4 или 5 мм и упаковывалась в пакеты или в пробирки. Анализ предполагалось проводить либо на чашке Петри, либо путем контакта микро салфетки HelPil-test с био-птатом непосредственно в щипцах для биопсии до изъятия биоптата. В такой форме тест-системы под названием HelPil-test и сегодня выпускаются компанией ООО «Синтана СМ» (сайт компании www.sintana.ru), так как упаковки по 50, 100 и 500 аналитических единиц (штук) пользуются достаточным спросом. Одновременно с выпуском дисков HelPil-test «в россыпь» появились различные дизайнерские варианты изделий. Так, компании ООО «АМА»

(с 1997 по 2003 год), ООО «Синтана СМ» (с 1999 года по настоящее время) и ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики» (с 2003 года по настоящее время) выпускали или продолжают выпускать тест-системы HelPil-test с различным закреплением диска HelPil-test на полимерной пленке в составе держателя из картона. Аналогичную продукцию под наименованием HelPil-tests, как и «жидкий» уреазный тест, выпускает SIA MedPro, Латвия.

С 2009 года ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики» приступила к выпуску теста под названием ХЕЛПИЛ®лента, где группа дисков закреплена на нейтральную — по отношению к тест-системе ХЕЛПИЛ® — клеевую основу.

К недостаткам методики можно отнести то, что эти тест-системы чувствительны к газовой среде, содержащей аммиак, и анализ, проводимый одновременно на близко расположенных друг к другу тест-системах, может привести к ложному срабатыванию одной из них. К «дизайнерским» недостаткам можно отнести и то, что в контакте с другими материалами тест может утратить свои диагностические свойства или изменить аналитические характеристики. Например, ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики» выпускает тест-системы на картонном носителе под названием «ХЕЛПИЛ®бланк», «ХЕЛПИЛ®стандарт» и «ХЕЛПИЛ® планшет». Диски ХЕЛПИЛ® при этом приходится изолировать от картона «клеевой» основой, так как сам картон не является стерильным материалом и как таковой уже содержит уреазу различного происхождения, которая обладает достаточно высокой ферментативной активностью. В этом легко можно убедиться с помощью воды и уреазного теста HelPil-test.

ООО «Синтана СМ» также выпускает похожие модификации теста под названиями «HELPIL-тест 1», «HELPIL-тест 3» (рис. 1), «HELPIL-тест 12» (цифры обозначают число дисков на бланке), соответственно, на одну, три и двенадцать аналитических единиц. В этих тест-системах диск HelPil-test закреплен непосредственно на прозрачном полимерном материале в круглом отверстии на краю носителя, изготовленного из ламинированного картона.

м

№4 (35) • 2013 www.akvarel2002.ru

HELPtL - тест 3

HP-

HP +

JfrtfM-W л—--"J*

HP-

HP +

HP-

(

HP +

IMWW

Работа с тестом: Тест поместить на предметное стекло ипи чешку Петри. Био-птат поместить на поверхность тесте (можно накрыть биоптат тестом, поместив 620 н& предметное стекло). Зафиксировать время различимого изменения цвета с желто-so не синий в зоне контенте С биоптатом,

Еспи время изменения окраски меньше 3 минут, то тест положительный (НР+), если от 3 до 5 минут, то ИР (±). Во всех других случаях тест отрицателен {HP-}. Коагулировать окраску болев чем через 5 минут недопустимо.

партия № 118 Тест изготонлен 10,03,2011

Годен до 10,03,2016 ООО «Синтана СМ», С-Пб, 8-812-3429664 E-mail: iriileiko@maiLru

Рис. 1. Тест-система НЕ1_Р11_-тест 3

В таком варианте оформления тест-системы прозрачное окно позволяет оценить размеры и характер пятна под исследуемым материалом, не снимая биоптата с поверхности теста. Однако спрос на эти системы на отечественном рынке невысок из-за их большой стоимости.

Тест-системы Не!Р1Мев1, которые производят ООО «Синтана СМ» и ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики», являются схожими авторскими вариантами оригинального теста [4] как в методике их использования, так и в конструктивном решении тест-системы. В то же

время эти тест-системы, несмотря на их внешнее сходство, не являются идентичными конструктивно и технологически, так как производятся из разных впитывающих материалов и разного химического сырья. Каждое из них выпускается с оригинальными технологическими ноу-хау. Последнее обуславливает их различную себестоимость и разнообразие выпускаемых форм, а в конечном итоге — цену аналитической единицы в той или иной форме выпуска. Поэтому выбор остается за пользователем, то есть за врачом-эндоскопистом.

В завершение хотелось бы отметить, что кажущаяся простота конструкции тест-системы и непритязательность аналитической методики ХЕЛПИЛ-тест стимулирует не только широкое применение данного метода диагностики в реальном здравоохранении, но и провоцирует изготовление подделок и имитаций, не соответствующих по потребительским свойствам оригинальным запатентованным авторским вариантам, описанным выше. Это негативно влияет на ситуацию с распространением оригинальных тест-систем HelPil-test и вводит пользователей в заблуждение на предмет качества тестов и дееспособности оригинальной методики ХЕЛПИЛ-тест.

Литература

1. Григорьев П. Я., Исаков В. А., Розенталь В. М. и др. Авторское свидетельство СССР от 18.04.88 №1564192 «Способ определения Campylobacter pyloridis при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки».

2. Сафонова Н. В., Жебрун А. Б. Гастрит, язвенная болезнь и хелико-бактериоз. Рекомендации для врачей. — СПб, 1993. — 40 с.

3. Аруин Л. И., Григорьев П. Я., Исаков В. А., Яковенко Э. П. Хронический гастрит. — Амстердам, 1993. — 362 с.

4. Дмитриенко М. А., Корниенко Е. А., Милейко В. Е. Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления. — Патент РФ №2184781, С 12 Q 1/04, 1/00, опубл. 10.07.2002 Бюл. №19, приоритет от 30.09.1997.

5. Корниенко Е. А., Гольбиц С. В., Милейко В. Е. и др. О диагностике инфекции Helicobacter pylori у детей // Российский вестник перинатоло-гии и педиатрии. — 1998. — №5. — С. 34.

www.akvarel2002.ru №4 (35) • 2013

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.