CC BY
133
УДК 578.7
И.А. хаснатинов, Г.А. Данчинова
современные способы мониторинга вирусных патогенов и перспективы создания системы эколого-эпидЕмиологичЕского мониторинга вирусов в окружающей среде
Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи
и репродукции человека Сибирского отделения РАМН (Иркутск)
В работе дан краткий обзор современных систем мониторинга вирусных инфекций. Показано, что для. эффективного слежения за распространением, вирусных инфекций необходимо функционирование системы, в форме «рабочих сетей» («network») из нескольких организаций различной ведомственной, региональной и. национальной, принадлежности; широкое применение генетических и. биологических методов для. раннего обнаружения вирусов и. оценки, их патогенного потенциала; обязательное использование биоинформационного анализа и. обязательное использование геоинформационных технологий.
С учетом, последних достижений биохимии, биологии и. инженерии в настоящее время возможно создание эколого-эпидемиологической системы, упреждающего мониторинга вирусных инфекций, который предоставлял бы. углубленную прогностическую информацию об эволюционных трендах в вирусных популяциях, о пространственно-временном, направлении, вирусных миграций, о выявлении новых ранее неизвестных вирусов и. их потенциальной, опасности для человека. Приводится краткая теоретическая схема методической, реализации, подобной системы..
Ключевые слова: патогенные вирусы, мониторинг, молекулярная вирусология, новые и возвращающиеся
modern approaches to the surveillance of viral pathogens and prospects of development of the eco-epidemiological network for survey of the viruses in the environment
M.A. Khasnatinov, G.A. Danchinova
Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction SB RAMS, Irkutsk
The article presents brief review of modern systems of surveillance of viral infections. It was shown, that the system in the form of networks from several organizations of different departmental, regional and national belonging, wide use of genetic and biological methods for early detection of viruses and. estimation of their pathogenic potential, obligatory use of bioinformational analysis and. geoinformational technologies were necessary for the effective viral infections spreading tracking.
Taking into account latest achievements of biochemistry, biology and. engineering today it is possible to create ecological and. epidemiological system, of predictive surveillance of viral infections that would, present profound, prognostic information, about evolutional trends in viral populations, space-time direction of viral migrations, detection new previously unknown viruses and. their potential risk for the human. Short theoretical scheme of methodical realization, of this system, is presented.
Key words: pathogenic viruses, surveillance, molecular virology, new and coming back
актуальность
В современном мире как со стороны национальных правительств, так и со стороны международных и общественных организаций большое внимание уделяется лечению, профилактике и мониторингу вирусных инфекций. Однако эффективность профилактических мероприятий существенно снижается в том случае, если заболевание вызвано новой формой возбудителя. Вот лишь несколько недавних примеров вспышек вирусных инфекций вызванных появлением новых форм возбудителей:
1. 1999 г.: в Новосибирской области произошла вспышка необычного клещевого энцефалита с геморрагическим синдромом, приведшая к гибели 8 человек. Исследования причин вспышки показали, что необычно тяжелое течение болезни связано с появлением новых вариантов вируса клещевого энцефалита [16].
2. 2003 г.: в городе Иркутске произошла эпидемия энтеровирусной инфекции, вызванная
внедрением нового варианта вируса Е^о30, при этом эффективную профилактику удалось наладить только через несколько месяцев после начала вспышки [2, 3].
3. 2002 — 2003 гг.: вспышка тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) вызванная появлением в Китае нового варианта коронавируса [13].
4. 2009 г.: пандемия гриппа НШ12009, новый вирус гриппа А перешел в популяцию человека в марте 2009 г., пик заболеваемости прошел в ноябре-декабре 2009 г. [15]. При этом мониторинг инфекции и профилактические мероприятия начались только после того, как были обнаружены случаи заболевания, в том числе и со смертельным исходом.
Таким образом, одной из острых проблем профилактики вирусных инфекционных заболеваний является отсутствие эффективной технологии раннего выявления новых патогенных вирусов в окружающей среде до появления случаев заболе-
вания человека. В данной работе мы попытались проанализировать современные теоретические предпосылки для создания системы упреждающего мониторинга вирусных инфекций, который предоставлял бы углубленную прогностическую информацию об эволюционных трендах в вирусных популяциях, о пространственно-временном направлении вирусных миграций, а также позволял бы выявлять новые формы вирусов и оценивать их потенциальную опасность для человека.
обсуждение
Разработка систем непрерывного наблюдения за вирусными инфекциями является одним из наиболее перспективных направлений развития способов контроля вирусных инфекций. Мы проанализировали 8 современных систем мониторинга вирусов и попытались определить их сильные и слабее стороны. Наиболее яркими примерами действующих региональных, национальных и международных сетей наблюдения за вирусами могут послужить следующие проекты:
1. Pennsylvania's West Nile Virus Control Program — Программа контроля вируса Западного Нила (ВЗН) в Пенсильвании, США [12], которая направлена на борьбу с распространением ВЗН. Эта программа представляет сеть из 67 станций, на которых проходит сбор материалов от птиц, комаров, млекопитающих и больных людей. В дальнейшем материалы, поступившие на станции, тестируют на зараженность ВЗН. Все результаты вносятся в гео-информационную систему и предоставляются всем желающим свободно в режиме реального времени как в виде оригинальных табличных данных, так и в обработанном виде (например, в форме оценки конкретных территорий по риску заражения ВЗН). С учетом полученных данных принимается решение о проведении конкретных профилактических мероприятий (санитарно-гигиеническая обработка территории, обработка водоемов пестицидами, разъяснительная работа с населением, раннее выявление заболевших и др.).
2. NREVSS — Национальная Система наблюдения за респираторными и энтеровирусными инфекциями США [11], позволяющая вести одновременный мониторинг респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1—4, аденовируса, ротавируса, метапневмовируса человека и вирусов гриппа человека. Данные наблюдений отображаются в реальном времени. Полученные результаты нанесены на интерактивные географические карты и представляют текущую информацию о состоянии заболеваемости соответствующими инфекциями на всей территории США.
3. Epizone — Европейская экспертная Сеть по диагностике и контролю зоонозных инфекций [6]. Включает 17 институтов медицинского, ветеринарного и биологического профиля из Евросоюза (14 институтов), Турции (1) и Китая (2) а также Продовольственную и сельскохозяйственную организацию ООН. Главной целью сети является обмен информацией и технологиями между учеными Ев-
росоюза, однако Сеть проводит 7 собственных научных тем (23 рабочих проекта), в том числе направленных на мониторинг вирусных инфекций среди животных и оценку опасности этих инфекций для людей. Сеть ведет наблюдения за циркуляцией на территории Евросоюза 15 зоонозных вирусных инфекций, включая такие важные патогены человека, как вирус гриппа птиц H5N1, вирус западного Нила, вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки. В рамках проекта используются унифицированные экспериментальные протоколы, для участников проекта обобщен доступ к полевым образцам, банкам клеточных и вирусных культур, коллекциям сывороток крови и т.п. Однако доступ к базам данных проекта ограничен, и информация доступна только по согласованию с одним из участников Сети.
При сравнении организационных схем и методического вооружения проанализированных систем мы выделили следующие основные принципы организации современной системы мониторинга патогенных вирусов:
• функционирование в форме «рабочих сетей» («network») из нескольких организаций различной ведомственной, региональной и национальной принадлежности;
• широкое применение генетических и биологических методов для раннего обнаружения вирусов и оценки их патогенного потенциала;
• обязательное использование биоинформа-ционного анализа;
• обязательное использование геоинформаци-онных технологий;
• свободный обмен информацией внутри системы и (во многих случаях) свободное предоставление большей части информации внешним пользователям.
При этом некоторые системы могут обладать функциями принятия решений о проведении профилактических мероприятий и возможностями по проведению таких мероприятий. Как правило, такие системы ориентированы на мониторинг и профилактику 1—2 инфекций в региональном масштабе. Более крупные системы, работающие на национальном и международном уровне и контролирующие 10 и более инфекций, действуют скорее как экспертно-аналитические центры. Они собирают и анализируют данные, обеспечивают ученым, врачам и ветеринарам свободный обмен первичными образцами и коллекционными материалами, технологиями, экспертными и материально-техническими возможностями и предоставляют национальным организациям здравоохранения готовую прогностическую информацию для принятия информированных решений по проведению профилактических мероприятий.
В Российской Федерации целенаправленные наблюдения за вирусными инфекциями проводятся только в связи с ухудшением эпидемической ситуации по заболеваемости гриппом и другими острыми респираторными вирусными инфекциями — ОРВИ (Приказ Минздравсоцразвития № 883
от 10 ноября 2009 г.) в рамках «Системы мониторинга и профилактики гриппа, вызванного вирусом А/НШ1 и сезонными штаммами, других ОРВИ и вирусных пневмоний» [1]. Кроме этого, существует программа Государственного надзора за особо опасными и природно-очаговыми инфекциями бактериальной и вирусной этиологии, ориентированная на выполнение в учреждениях, институтах и региональных центрах Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзора). С одной стороны, эта программа рассчитана на более широкий спектр возбудителей, однако, с другой стороны, в ее задачи не входит целенаправленное исследование миграций и эволюции вирусов в реальном времени. Последнее обстоятельство тормозит возможности своевременной оценки экологических угроз населению и не позволяет заблаговременно прогнозировать возникновение эпидемической ситуации и принимать предупредительные профилактические меры. Получаемая в рамках этой программы информация зачастую носит закрытый характер и не доступна большинству специалистов из других ведомств, что также снижает прогностическую и научную ценность полученных данных.
Общий недостаток всех существующих систем слежения состоит в том, что целенаправленная борьба с вирусными инфекциями начинается только тогда, когда уже есть заболевшие, а в некоторых случаях - даже погибшие люди. В настоящее время во всем мире нет ни одной системы слежения, которая давала бы исчерпывающую характеристику вирусов, циркулирующих в природе, в режиме упреждения заболеваний человека. Кроме этого, большинство систем слежения за вирусами направлены на изучение нескольких хорошо известных возбудителей заболеваний и не позволяют выявлять и оценивать патогенный потенциал новых, либо ранее неизвестных видов вирусов для конкретной местности. Вследствие этого, современные схемы профилактики вирусных инфекций начинают работать только после начала массовых заболеваний людей, вызванных появлением новых вариантов вирусов.
Современной наукой уже в значительной мере разработаны методы выявления, идентификации, анализа биологических и генетических характеристик вирусов в тканях человека, беспозвоночных и позвоночных и животных, а также в объектах окружающей среды. Существует целостное учение о природной очаговости болезней, об эколого-эпидемиологических проявлениях очагов, о молекулярной эпидемиологии вирусов, о возможностях высокотехнологичной диагностики, эффективной профилактики и лечения и пр. Все это наводит на мысль, что в настоящее время имеются все необходимые теоретические и практические возможности создания системы упреждающего мониторинга вирусных инфекций. Подобный мониторинг предоставлял бы углубленную прогностическую информацию
об эволюционных трендах в вирусных популяциях, о пространственно-временном направлении вирусных миграций, о выявлении новых ранее неизвестных вирусов и их потенциальной опасности для человека.
Наиболее перспективным при создании такой системы, на наш взгляд, является сочетание современных экологических и эпидемиологических подходов с комбинированным использованием биологических, генетических, вирусологических, био- и геоинформационных методов. Возникновение новых форм вирусов обусловлено генетическим разнообразием вирусных популяций. Новые генетические варианты вирусов могут спонтанно приобрести качественно новые биологические характеристики, в том числе изменить патогенность и представить серьезную опасность для людей. Поэтому для успешной оценки патогенного потенциала необходим анализ генетического разнообразия вирусных популяций и того, как обнаруженные генетические изменения сказываются на биологических свойствах вирусов.
Анализ генетического разнообразия основан на сочетании двух подходов. Первый — неспецифическая селекция и амплификация вирусных геномов с помощью градиентного центрифугирования, ультрафильтрации, лизиса ДНК/РНК хозяина, сиквенс-независимой амплификации геномной кДНК с помощью полимеразы phi29, shotgun-клонирования и секвенирования полученных библиотек клонов [4, 5, 8]. Эти методы позволяют выявить генетический материал любых вариантов вирусов даже с неизвестной структурой генома. Второй — амплификация и расшифровка специфичных фрагментов генома уже известных патогенов с помощью методов обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования [7, 14, 17]. Эти методы позволят охарактеризовать генетическую вариабельность обнаруженных вирусов.
На следующем этапе необходим анализ полученной генетической информации, включающий в себя изучение эволюционных тенденций с помощью филогенетических и биоинформационных методов. В настоящее время разработан целый ряд подобных методов, которые технически воплощены в такие мощные пакеты программ, как Mega, McBayes, BioEdit, combineTree, TREEFINDER, Split-sTree, и другие. Современный уровень понимания биологии вирусов позволяет оценить возможные последствия эволюционных изменений генома. Для этого может быть использован целый ряд математических моделей и баз данных для анализа структуры белков, например, PyMol, SwissProt, RefSeq, GenBank, Flavitrack [9, 10] и другие. Для прогноза степени опасности выявленных вирусов для человека необходим также ряд тестов в биологических моделях — культурах клеток человека, лабораторных животных.
Далее, создание современной информационной среды для обмена результатами исследований и аналитическими материалами эпидемиологиче-
ской, экологической и микробиологической направленности требует тщательной ландшафтной, климатической и географической привязки. Поэтому требуется использование инструментов и методов, обеспечивающих, во-первых, надежную привязку эколого-эпидемиологических и биологических данных к ландшафтно-географическим картам, во-вторых, интерактивную цифровую оболочку продукта с возможностью ввода и анализа информации онлайн в режиме реального времени. Данный блок может быть выполнен на основе бесплатных и условно-бесплатных программных продуктов, таких, как GoogleEarth, GRASS, QuantumGIS и др. При внедрении в практику это обеспечит максимальную доступность разработок проекта для потребителей. Разработанную и апробированную систему эколого-эпидемиологическо-го мониторинга можно будет распространить на инфекции, имеющие, например, бактериальную природу, а также на территории других субъектов и сопредельных стран.
резюме
Современная система эколого-эпидемиоло-гического мониторинга вирусных патогенов в окружающей среде должна предоставлять возможность детектировать, идентифицировать и характеризовать несколько вирусов. Кроме того, она должна иметь возможность выявления неизвестных вирусов, прогноза пространственно-временных миграций вирусных патогенов, а также возможность оценить степень потенциальной опасности обнаруженных вирусов для человека. На современном этапе достижение этих показателей возможно только при грамотном сочетании новейших биологических, генетических, эпидемиологических и геоинформационных технологий. Создание подобной системы целесообразно на базе сети взаимосвязанных и дополняющих друг друга биологических, медицинских и ветеринарных учреждений как научно-исследовательского, так и практического профиля.
литература
1. Веб-сайт Министерства здравоохранения РФ. — Режим доступа: http://www.flu.rosminzdrav. ru. (15 окт. 2011).
2. Вестник инфектологии и паразитологии. — Режим доступа: http://www.infectology.ru/news/ index.aspx?y=2003&m = 9&d = 1.
сведения об авторах
3. Вспышка энтеровирусной инфекции в Иркутской области в 2003 г. / Е.Д. Савилов [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - № 2. - С. 90-92.
4. Characterization of virus isolates by particle-associated nucleic acid PCR / A. Stang [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, N 2. - P. 716-720.
5. Discovery of a novel single-stranded DNA virus from a sea turtle fibropapilloma by using viral metagenomics / Т. Fei Fan Ng [et al.] // J. Virol. -2009. - Vol. 83, N 6. - P. 2500-2509.
6. Epizone. - Режим доступа: http://www. epizone-eu.net/epizone.aspx (15 окт. 2011).
7. Genus-specific detection of alphaviruses by a semi-nested reverse transcription-polymerase chain reaction / M. Pfeffer [et al.] // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1997. - Vol. 57, N 6. - P. 709-718.
8. Laboratory procedures to generate viral metagenomes / R.V. Thurber [et al.] // Nature protocols. - 2009. - Vol. 4, N 4. - P. 470-483.
9. Misra M., Schein C.H. Flavitrack: An annotated database of flavivirus sequences // Bioinformatics Advance, Bioinformatics. - Doi:10.1093/bioinformat-ics/btm383.
10. NCBI Reference Sequences: current status, policy and new initiatives / K.D. Pruitt [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol. 37. - P. 32-36.
11. NREVSS. - Режим доступа: http://www2. ncid.cdc.gov ( 20 окт. 2011).
12. Pennsylvania's West Nile Virus Control Program. - Режим доступа: http://www.westnile.state. pa.us/index.html (20 окт. 2011).
13. Saif L.J. Animal coronaviruses: what can they teach us about the severe acute respiratory syndrome? // Rev. Sci. Tech. - 2004. - Vol. 23. -P. 643-660.
14. Sensitive and broadly reactive reverse tran-scription-PCR assays to detect novel paramyxoviruses / S. Tong [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2008. -Vol. 46, N 8. - P. 2652-2658.
15. Surveillance trends of the 2009 influenza A(H1N1) pandemic in Europe / A. Amato-Gauci [et al.] // Eur. Surveill. - 2011. -Vol. 16, N 26. -P. 199-203.
16. Tick-borne encephalitis with hemorrhagic syndrome, Novosibirsk region, Russia, 1999 / V.A. Ter-novoi [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 9, N 6. - P. 743-746.
17. Universal primers that amplify RNA from all three flavivirus subgroups / S.L. Maher-Sturgess [et al.] // Virol. J. - 2008. - Vol. 24, N 5. - P. 16.
Хаснатинов Максим Анатольевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: 8 (3952) 33-39-71; e-mail: khasnatinov@yandex.ru)
Данчинова Галина Анатольевна - доктор биологических наук, руководитель лаборатории трансмиссивных инфекций Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: 8 (3952) 33-39-71; e-mail: dan-chin@yandex.ru)
