CC BY
4
УДК 616.98:579.881 ГРНТИ 76.33.43
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ШТАММОВ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ В ОЧАГАХ СИБИРСКОГО КЛЕЩЕВОГО ТИФА
12 12 1 12 12 С.В. Штрек ' , С.Н. Шпынов ' , И.Е. Самойленко , Н.В. Рудаков ' , А.В. Санников ' ,
О.А. Боброва
1ФБУН «Омский НИИприродно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора Россия, 644080, г. Омск, проспект Мира, 7
2ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 644099, г. Омск, ул. Ленина, 12
С 1954 г. в Омском НИИ природно-очаговых инфекций ведётся работа по изучению штаммов риккетсий, выделенных от пациентов и из иксодовых клещей в очагах сибирского клещевого тифа. Это позволило создать уникальную коллекцию штаммов риккетсий. Комплексное изучение фенотипических и генотипических характеристик с применением филогенетического анализа позволило установить, что штаммы Rickettsia sibirica subsp. sibirica, выделенные с 1950-х гг. в очагах сибирского клещевого тифа в Республиках Алтай, Бурятия, Алтайском и Красноярском краях, и штамм «Нижняя Талда 150/22», выделенный в 2022 г. на территории Республики Алтай, гомологичны на основании данных анализа генов gltA и ompA. Отработана схема для реактивации штаммов патогенных видов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки хранившихся после лиофильной сушки в ампулах более 30 лет, что было продемонстрировано восстановлением штамма «Баево 105/87» R. sibirica subsp. sibirica при заражении морских свинок с дальнейшим пассированием на развивающихся куриных эмбрионах. Для изучения штаммов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки необходимо применение комплексного подхода с изучением фенотипических, молекулярно-биологических и филогенетических методов для совершенствования эпидемиологического надзора за природными очагами сибирского клещевого тифа. Особое значение необходимо уделять выделению и изучению штаммов риккетсий на лабораторных моделях.
Ключевые слова: риккетсии, клещевые риккетсиозы, штамм, сибирский клещевой тиф, Rickettsia sibirica, филогенетический анализ, комплексный подход.
MODERN APPROACHES TO THE STUDY OF RICKETTSIA STRAINS OF THE TICK-BORNE SPOTTED FEVER GROUP IN THE FOCI OF SIBERIAN TICK-BORNE TYPHUS
S.V. Shtrek1'2, S.N. Shpynovu, I.E. Samoylenko1, N.V. Rudakov1,2, A.V. Sannikov1,2, O.A. Bobrova1 1FBSI "Omsk Research Institute of Natural Focal Infections" Rospotrebnadzor Russia, 644080, Omsk, pr. Mira, 7
2FSBEI HE "Omsk State Medical University" of the Ministry of Health of Russia Omsk, Russia
Since 1954, the Omsk Research Institute of Natural Focal Infections of Rospotrebnadzor has been working to study rickettsia strains isolated from patients and from ixodic ticks in the foci of Siberian tick-borne typhus, which made it possible to create a unique collection of rickettsia strains. The main stages of work on the identification and study of the properties of rickettsia strains in the collection can be divided into two periods characterized by the study of pheno-typic and molecular biological methods. A comprehensive study of phenotypic and genotypic characteristics using phy-logenetic analysis made it possible to establish that Rickettsia sibirica subsp. sibirica strains isolated since the 1950s in the foci of Siberian tick-borne typhus in the Republics of Altai, Buryatia, Altai and Krasnoyarsk Territories and the strain "Nizhnyaya Talda-150/22" isolated in 2022 on the territory of the Republic of Altai are homologous based on gltA and OmpA gene analysis data. A scheme has been worked out for reactivation of strains of pathogenic rickettsia species of the tick-borne spotted fever group stored after freeze-drying in ampoules for more than 30 years, which was demonstrated by the restoration of the strain "Bayevo 105/87" R. sibirica subsp. sibirica during infection of guinea pigs with further
© Штрек С.В., Шпынов С.Н., Самойленко И.Е., Рудаков Н.В., Санников А.В., Боброва О.А., 2024
passaging on developing chicken embryos. To study rickettsia strains of the tick-borne spotted fever group, it is necessary to apply an integrated approach with the study of phenotypic, molecular biological and phylogenetic methods to improve epidemiological surveillance of natural foci of Siberian tick-borne typhus. Particular importance should be given to the isolation and study of rickettsia strains in laboratory models.
Keywords: rickettsia, tick-borne rickettsiosis, a strain, Siberian tick-borne typhus, Rickettsia sibirica, phylogenet-ic analysis, a comprehensive approach.
Введение
Риккетсии — группа грамотрицатель-ных внутриклеточных микроорганизмов, которые могут передаваться человеку членистоногими, вызывая группу заболеваний — риккетсиозы [1]. Сибирский клещевой тиф (СКТ), клещевой риккетсиоз, регистрирующийся в азиатской части России, вызывается Rickettsia sibirica subsp. sibirica и передаётся человеку в результате присасывания естественно заражённых иксодовых клещей двух родов Dermacentor (D. nuttalli, D. silvarum, D. marginatus и D. reticulatus) и Haemaphysalis (H. concinna) [2]. Внутри вида R. sibirica дифференцируют R. sibirica subsp. sibirica и R. sibirica subsp. mongolitimonae [3]. Доказанные случаи СКТ в России связаны только с R. sibirica subsp. sibirica. В некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока клещевой риккетсиоз, вызываемый R. heilongjiangensis (переносчик — H. concinna), имеет распространение в нозоареале СКТ.
С 1954 г. в ФБУН «Омский НИИ при-родно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора собрана уникальная коллекция штаммов рик-кетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) и «предковой группы», выделенных от больных и из иксодовых клещей [4]. Основные этапы работы по идентификации и изучению свойств штаммов риккетсий в коллекции можно разделить на два периода, характеризующихся применяемыми методами:
1. Фенотипический (М.С. Шайман, Н.В. Вощакина, В.К. Ястребов, Н.В. Рудаков, Т.А. Решетникова) с идентификацией штаммов риккетсий группы КПЛ только на основании изучения фенотипических признаков (морфология, антигенные свойства, вирулентность для морских свинок, культивирование на развивающихся куриных эмбрионах, серокон-версия и др.), с 1954 по 1992 гг.;
2. Молекулярно-биологический, включающий: а) рестрикционный анализ штаммов с изученными фенотипическими характеристиками (Н.В. Рудаков, Т.А. Решетникова, И.Е. Самойленко) c идентификацией штаммов риккетсий группы КПЛ до вида, с 1993 по 2005 гг.; б) секвенирование по Сенгеру штаммов с изученными фенотипическими характе-
ристиками (С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, С.В. Штрек, А.В. Санников) c генотипирова-нием штаммов риккетсий до подвида (по генам gltA и ompA); в) полногеномное секвенирование штаммов с изученными фенотипи-ческими характеристиками, с 2023 г.
Применение молекулярно-биологичес-ких методов позволило установить, что при изучении только фенотипических свойств часть штаммов ^. heilongjiangensis, R. slovaca) были определены как R. sibirica [5; 6]. Секвенирование по Сенгеру позволило выделить внутри вида R. sibirica штамм R. sibirica BJ-90, имеющий незначительную генетическую вариабельность, в отличие от применения метода ре-стрикционного анализа [7].
Изучение штаммов риккетсий должно быть основано на комплексном подходе, включающем изучение фенотипических и генотипи-ческих признаков. Однако с 2002 г. применение комплекса молекулярно-биологических и филогенетических методов было рекомендовано в качестве руководящего подхода в классификации, таксономии и идентификации прокариот [8, 9].
Таким образом, начиная с 1954 г. сотрудниками ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора проводится работа по выделению риккетсий группы КПЛ в очагах сибирского клещевого тифа (СКТ) на территориях Алтайского и Красноярского краёв, Республик Алтай, Бурятия и других эндемичных территориях. С 1993 г. осуществляется генотипирование штаммов/гено-моизолятов риккетсий. Было установлено, что в природных очагах СКТ в Республике Алтай кроме R. sibirica subsp. sibirica в иксодовых клещах циркулирует R. raoultii [10], в Алтайском крае и Республике Алтай клещевые рик-кетсиозы могут вызываться двумя видами риккетсий: R. sibirica subsp. sibirica и R. heilongjiangensis [11; 12]. Кроме того, ДНК R. raoultii и «Candidatus R. tarasevichiae» были выявлены в иксодовых клещах на территории этого региона, что требует дальнейшего изучения этиологической структуры КР [11].
Исследования, проведённые сотрудниками референс-центра по мониторингу за рик-кетсиозами, установили, что при молекулярно-
биологическом мониторинге риккетсий на эндемичных территориях выявление R. raoultii «маскирует» присутствие этиологического агента СКТ — R. sibirica. Этот феномен позволяет объяснить высокий уровень заболеваемости СКТ на изучаемых территориях при редкой выявляемости ДНК R. sibirica при мо-лекулярно-биологическом скрининге в иксодовых клещах [13].
В данной работе осуществлено изучение генотипических и фенотипических признаков штамма «Нижняя Талда 150/22» R. sibirica subsp. sibirica, выделенного в очагах СКТ на территории Онгудайского района Республики Алтай в 2022 г. Отработана возможность восстановления штаммов риккетсий КПЛ после многолетнего хранения и количественной оценки их накопления. На заключительном этапе проведён филогенетический анализ штаммов риккетсий с целью анализа генетической гетерогенности штаммов/геномоизо-лятов, выделявшихся в очагах СКТ с 1954 г. по настоящее время.
Методы исследования
Выделение и восстановление штаммов риккетсий. В мае 2022 г. близ территории села Нижняя Талда Онгудайского района Республики Алтай были собраны на флаг клещи Dermacentor nuttalli. Выделение штаммов риккетсий группы КПЛ и культивирование на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) проводили по методике Здродовского (1972). Для отработки методики восстановления культуры риккетсий использовали штамм R. sibirica subsp. sibirica «Баево 105/87», изолированный Н.В. Рудаковым в 1987 г. из клещей D. marginatus, собранных близ территории села Баево Баевского района Алтайского края. Для выделения штаммов и воспроизведения экспериментальной инфекции заражали самцов морских свинок. Препараты мазков-отпечатков органов морских свинок и желточных мешков РКЭ окрашивали по методу Здро-довского.
Молекулярно-биологические методы. Для обнаружения ДНК риккетсий использовали набор реагентов для выявления ДНК Rickettsia spp. «РеалБест ДНК Rickettsia species» (ВекторБест, Кольцово) методом по-лимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для получения ам-пликонов использовали двухраундовую ПЦР с праймерами к генам цитратсинтазы (gltA) и ompA [14]. Продукты ПЦР очищали с помо-
щью магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США). Реакция по Сенгеру была проведена с использованием набора для циклического секвенирования BrilliantDye Terminator версии 1.1 (NimaGen B.V., Нидерланды). Продукты реакции циклического секвенирования очищали так же, с помощью магнитных частиц Agencourt AMPure XP, и анализировали на приборе SeqStudio (Thermo Scientific, США).
Филогенетический анализ проведён по генам цитратсинтазы (gltA) и ompA, кодирующего белок наружной мембраны штаммов риккетсий, изолированных в очагах СКТ. Филогенетическое древо было построено методом Maximum Likelihood с помощью программы MEGA11 (модель General Time Reversible) со значением bootstrap - 100.
Нуклеотидные последовательности гена цитратсинтазы (gltA) были импортированы из международной базы данных GenBank. Номера доступа к нуклеотидным последовательностям в GenBank: R. sibirica (U59734.1), R. sibirica subsp. mongolotimonae (DQ097081.1), R. parkeri (U59732.1), R. honei (AF018074.1), R. rickettsii (U59729.1), R. conorii (U59730.1), R. peacockii (DQ100162.1), R. africae (MG515012.1), R. slovaca (U59725.1), R. heilongjiangensis (AY280709.1), R. japonica (U59724.1), R. massiliae (U59719.1), R. rhipicephali (U59721.1), Candidatus R. andeanae (GU169051.1), R. raoultii DnS14 (DQ365804.1), R. raoultii DnS28 (EU036985.1), R. raoultii RpA4 (DQ365803.1), Candidatus R. principis (AY578115.1), R. montana (U74756.1), R. asiatica (AF394901.1), R. helvetica (KP866150.1), Candidatus R. rara (DQ365805.1A R. monacensis (KU961539.1), R. tamurae (AF394896.1), R. hoogstraalii (FJ767737.1), R. akari (U59717.1), R. australis (U59718.1), R. prowazekii (U59715.1), R. typhi (U59714.1), Candidatus R. mendelii (0P503883.1), R. bellii (CP000849.1), R. canadensis (U59713.1), Candidatus R. tarasevichiae (DQ168981.1), Candidatus R. kingi (HF935074.1), Candidatus R. angustus (HF935075.1), R. monteiroi (FG269035.1), R. felis (JQ674484.1) и Anaplasma phagocytophilum (0M648121.1).
Нуклеотидные последовательности гена ompA были импортированы из GenBank. Номера доступа к нуклеотидным последовательностям в международной базе данных GenBank: R. aeschlimanni (U83446.1), R. africae (U83436.2), R. canadensis (CP000409.1), R. conorii (U83448.1), R. japonica (U83442.1),
R. massiliae (U83445.1), R. sibirica subsp. mongolotimonae (U83439.1), R. montana (U83447.1), R. parkeri (U83449.1), R. raoultii RpA4 (AH015609.2), R. raoultii DnS28 (AH015610.2), R. rhipicephali (U83450.1), R. rickettsii (U83451.1), R. slovaca (U83454.1), R. heilongjiangensis (AF179363.1).
Результаты и обсуждение
Штамм R. sibirica «Нижняя Талда 150/22» был выделен при внутрибрюшинном заражении двух морских свинок-самцов суспензией клещей D. nuttalli. На пятые сутки после заражения на высоте температуры (40,4 °С) и при наличии клинических признаков (скротальный феномен) морская свинка была умерщвлена гуманным методом (в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях ETS N 123, 1986), органы (паховые лимфоузлы, тестисы, селезёнка, головной мозг) были изъяты для дальнейшей работы.
При вскрытии наблюдали типичную па-тологоанатомическую картину для СКТ. При микроскопии препаратов мазков-отпечатков с окраской по методу Здродовского во всех органах наблюдались более 10 микробных тел в поле зрения и отдельные скопления риккет-сий, в головном мозге выявлены единичные риккетсии в поле зрения. В ПЦР-РВ ДНК рик-кетсий обнаружена во всех органах (кроме головного мозга), пороговый цикл — 30 (Ct-30). После перевода изолята риккетсий с морской свинки на РКЭ при микроскопии препарата мазка сосудов желточного мешка (первый пассаж), были выявлены типичные по размерам, морфологии, расположению (ядро клетки и цитоплазма) и тинкториальным свойствам клетки
риккетсий. Бактериальные клетки грамотрица-тельны и характеризовались плеоморфной формой.
В ПЦР-РВ при первичном заражении в пробах желточных мешков РКЭ ДНК риккетсий не обнаружена. Но уже в первом пассаже наблюдалось большое накопление риккетсий — Ct-13. Секвенирование по Сенгеру позволило установить, что выделенный штамм «Нижняя Талда 150/22» принадлежит к генокомплексу R. sibirica, а именно R. sibirica subsp. sibirica.
В рамках реализации программы «Санитарный щит» проводилась экспериментальная работа по восстановлению лиофилизированных штаммов риккетсий, хранящихся в коллекции ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, которые были изолированы во второй половине XX в. Культивирование штамма R. sibirica subsp. sibirica «Баево 105/87» на РКЭ выполняли по стандартной методике [15]. После первичного заражения при окрашивании препаратов-мазков по методу Здродовского наблюдались единичные риккетсии в отдельных полях зрения. В первом, втором и третьем пассаже при микроскопии в препаратах-мазках количество риккетсий составляло от 10 до 25 клеток в каждом поле зрения. При исследовании по генам gltA и ompA в ПЦР были получены положительные результаты. С четвёртого пассажа для индикации использовали набор реагентов для выявления ДНК Rickettsia spp. «РеалБест ДНК Rickettsia species». Количество клеток в каждом поле зрения от единичных риккетсий до 50, пороговый цикл в ПЦР-РВ находился в диапазоне Ct 12-20 (рис. 1). После пятого пассажа во всех пробах количество риккетсий при микроскопии превышало 50 клеток в каждом поле зрения, по данным ПЦР-РВ, Ct меньше 18.
// / /
п! / I
riopofl
4-й пассаж
9-й пассаж
Рис. 1. Графики накопления продуктов амплификации в ПЦР-РВ при исследовании ДНК штамма К. sibirica subsp. sibirica «Баево 105/87» в желточных мешках на 4-м и 9-м пассажах
В процессе культивирования важную роль играет количественный контроль накопления риккетсий в биологических материалах (подсчёт риккетсий в образце). Однако световая микроскопия препаратов мазков риккетсий не позволяет дифференцировать вид риккетсий [16; 17]. Нами на примере штамма R. sibirica subsp. sibirica «Баево 105/87» изучена возможность количественного определения риккетсий в образцах от больных СКТ методом ПЦР-РВ [18].
На следующем этапе для воспроизведения экспериментальной инфекции внутри-брюшинно заражали двух самцов морских свинок. На третий день после заражения отмечался подъём температуры до 40 ОС, на 5-6-й день температура возвращалась к исходному уровню. Скротальный феномен слабо выражен, снижение веса в первые пять суток после заражения составило от 14 до 17 граммов.
Патологоанатомическая картина: наблюдалось значительное увеличение и гипе-
ремия паховых лимфатических узлов, увеличение печени и селезёнки, незначительное увеличение размеров тестикул и их гиперемия. Также отмечалась значительная гиперемия головного мозга, инъекция сосудов мозга и твёрдых мозговых оболочек. При микроскопии во всех органах выявлены единичные рик-кетсии в большинстве полей зрения, в мазках из головного мозга наблюдалось 10-15 микробных тел в поле зрения. В ПЦР-РВ ДНК риккетсий обнаружены во всех органах после 30-го цикла.
Таким образом, восстановленный штамм не утратил своих вирулентных свойств в результате хранения более 30 лет. Полученные результаты позволили рекомендовать схему для восстановления штаммов R. sibirica subsp. sibirica (рис. 2). Необходимо продолжить работу по восстановлению штаммов рик-кетсий группы КПЛ других видов из коллекции ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора.
Рис. 2. Схема восстановления (реактивации) штамма R. sibirica subsp. sibirica «Баево 105/87»
На завершающем этапе данной работы для изучения генетической гетерогенности штаммов риккетсий группы КПЛ проведено ретроспективное генотипирование штам-мов/геномоизолятов риккетсий в очагах СКТ и использованы данные, полученные ранее [5].
При проведении филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gltA все штаммы R. sibirica subsp. sibirica имели 100 %-ную гомологию с референтной нуклеотидной последовательностью R. sibirica subsp. sibirica (Ш9734.1). Аналогичная картина наблюдалась и у штаммов R. raoultii, нуклеотидные последовательности которых имели 100 %-ную гомологию с референтной последовательностью R. raoultii DnS28 ^^36985.1). Для построения филогенетического дерева использовали 38 нуклео-тидных последовательностей гена gltA видов
(из них 7 — Candidatus spp.) риккетсий пред-ковой группы, группы сыпного тифа, группы КПЛ и A. phagocytophilum.
Полученное филогенетическое дерево по расположению ветвей соответствует полученному ранее Roux et al. (рис. 3) [19]. При этом построенная нами дендрограмма позволила уточнить филогенетическую позицию представителей рода Rickettsia.
При выравнивании нуклеотидных последовательностей по гену ompA штаммы R. sibirica имеют 100 %-ную гомологию между собой. Штаммы R. raoultii также имеют 100 %-ную гомологию по изучаемому фрагменту. Штаммы R. sibirica subsp. sibirica имеют близкое расположение к R. sibirica subsp. mongolotimonae, а штаммы R. raoultii образовали общую ветвь с геновариантом DnS28 R. raoultii (рис. 4).
и
iE 60 Í 11
41
76
43
53
S6
37
L
1Í
Rickettsia sibirica subsp. mcngolotimonae (DQ097081.1} Rickettsia sibirica (U59734.1) * Rickettsia parken [U59732.1 } Rickettsia africae (MG 5150121) Rickettsia hone i (AF018074.1) Rickettsia concrii (U59730.1) Rickettsia peacockli (DQ100162.1) Rickettsia rickettsii (U59 729.1} Rickettsia slovaca (U59725.1) Rickettsia heilongjlangensis [AY2 8070 9.1} Ri cketts ia j apo nie a (U59 724.1} Rickettsia massiiiae (US 9719.1} Rickettsia rhipicephali (U59721.1} Candidatus Rickettsia andeanae (GU169051.1) Rickettsia raoultii RpA4[DQ3 658 03.1 } Rickettsia raoultii DnS28 (EU036985.1)* * Rickettsia raoultii DnS14[DQ3658 04.1} Candidatus Rickettsia princlpis (AY578115.1) Ri ckettsia m ontaina jU74756.1}..............
ГРУППА КЛЕЕЦЕВОИ ШПНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ
4S
17
67
_г Rickettsia asiatica (AF394901.1 )
i®^ Rickettsia helvetica (KP866150.1}
-Candidatus Rickettsia rara (DQ3658051}
г Rickettsia monacensis (KLI961539.1)
INCERTAE SEDIS
im L Ri cketts iat amura e(AF3 9489 6.1}
SS
Rickettsia hoogstraaiii (FJ7 67737.1} Rickettsia akari (U59717.1)
, i®. ..BL№¡íUiUStrslS MJ 3 1.
ПЕРЕХОДНАЯ ГРУППА
4t
Rickettsia prowazekii (U59715.1}
.V.. J3.cM.sj§ JiSÜ 1СУ J LI)..
ГРУППА СЫПНОГО ТПФА
Г
35
71
£4 41
а
93
"ñ'clíeKsla"añáSeñ sis" TT f Rickettsia monteiroi (FJ269035.1) Rickettsia t arasevi chi ae (DQ168981.1} Candidatus Rickettsia kingl (HF935074.1) Rickettsia angustus (HF935075.1} Rickettsia bell Ii (CP000849} Candidatus Rickettsia mendelii (QP503883.1)
ПЕРЕДКОВАЯ ГРУППА
■ Rickettsia fells (JQ674484.1)
■ Anaplasma phagocytophilum (OM648121.1)
*Штаммы R. sibirica subsp. sibirica с территории Алтайского края из клещей D. nuttalli (Баево 105/87, Баталово 95/66, Хлопуново 92/66, Каракос 54/66, Туэкта 47/65), D. marginatus (Краснощёково 41/89), D. reticulatus (Верх-Катунское 148/66), I. persulcatus (Шашикман 55/65), из крови больного (Казанцева 84/67), с территории Красноярского края из клещей D. nuttalli (Каратуз 59/92) и территории Республики Алтай из клещей D. nuttalli («Нижняя Талда 150/22») имели 100 %-ную гомологию с R. sibirica (U59734.1).
**Штаммы R. raoultii из клещей D. silvarum c территории Республики Бурятия (Шайман 2000) и Республики Алтай (Кош-Агач 11/10) имели 100 %-ную гомологию с R. raoultii DnS28 (EU036985.1).
Рис. 3. Филогенетическое дерево на основе сравнительного анализа частичной последовательности гена gltA (1000 п. н.) штаммов риккетсий и гомологичных ему последовательностей видов риккетсий предковой группы, группы сыпного тифа и группы клещевой пятнистой лихорадки и A. Phagocytophilum (дендрограмма Maximum Likelihood, программа MEGA11, модель General Time Reversible
с 100 bootstrap подкреплением)
¡2 г- Rickettsia mongolotimonae (U83439.1)
L Rickettsia sibirica (штаммы)* ioj— Rickettsia parteri (U83449.1) Rickettsia africae (U83436.2)
-Rickettsia conorii (U83448.1)
-Rickettsia siovaca (U83454.1)
-Rickettsia rickettsii (U83451.1)
-Rickettsia montana (U83447.1)
id I Rickettsia raoultii (штаммы)"
L
Rickettsia raoultii DnS28 (AH015610.2) Rickettsia aeschlimanni (U83446.1) Rickettsia rhipicephaii (U83450.1 )
51 LT m'
too L Rickettsia massiliae (U83445.1)
£
Rickettsia heilcngjiangensis (AF179363.1) Rickettsia japonica (U83442.1) Rickettsia canadensis (CP000409.1)
*Штаммы R. sibirica с территории Алтайского края из клещей D. nuttalli (Баево 105/87, Баталово 95/66, Хлопуново 92/66, Каракос 54/66, Туэкта 47/65), D. marginatus (Краснощёково 41/89), D. reticulatus (Верх-Катунское 148/66), I. persulcatus (Шашикман 55/65), из крови больного (Казанцева 84/67), с территории Красноярского края из клещей D. nuttalli (Каратуз 59/92) и территории Республики Алтай из клещей D. nuttalli (Нижняя Талда 150/22).
**Штаммы R. raoultii c территории Республики Бурятия из клещей D. silvarum (Шайман-2000) и Республики Алтай (Кош-Агач 11/10).
Рис. 4. Филогенетическое дерево на основе сравнительного анализа частичной последовательности гена ompA длиной 889 н.о. на основе 16 штаммов риккетсий и гомологичных ему последовательностей риккетсий группы КПЛ и R. canadensis из предковой группы в качестве outgroup (дендрограмма Maximum Likelihood, программа MEGA 11, модель General Time Reversible с 100 bootstrap подкреплением)
Таким образом, изученные штаммы риккетсий группы КПЛ, выделенные в очагах СКТ по своим фенотипическим и генотипиче-ским характеристикам, соответствуют типовым штаммам Я. sibirica subsp. sibirica и Я. гаоы1Ш.
Выводы
На основании полученных данных можно предположить, что штаммы Я. sibirica subsp. sibirica, выделенные в очагах СКТ в Республиках Алтай, Бурятия, Алтайском и Красноярском краях, и штамм «Нижняя Талда 150/22», выделенный в 2022 г. на территории Онгудайского района Республики Алтай, гомологичны на основании данных анализа изучаемых генов. Однако только применение полногеномного секвенирования позволит дать объективную оценку гетерогенности популяции риккетсий в очагах клещевых риккетсиозов.
Апробированная схема для реактивации штамма «Баево 105/87» Я. sibirica subsp.
Sibirica — возбудителя СКТ, хранившегося в коллекции после лиофильной сушки в ампулах более 30 лет, продемонстрировала возможность восстановления штаммов патогенных видов риккетсий. Необходимо проверить данный подход на штаммах других видов рик-кетсий из группы КПЛ.
Для объективного изучения штаммов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки необходимо внедрение комплексного подхода с изучением фенотипических, моле-кулярно-биологических и филогенетических методов для совершенствования эпидемиологического надзора за природными очагами сибирского клещевого тифа. При этом необходимо уделить внимание выделению штаммов риккетсий на лабораторных моделях. Важная роль принадлежит молекулярно-генетичес-кому мониторингу риккетсий в иксодовых клещах и изучению значимости различных видов риккетсий в структуре региональной инфекционной патологии.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Рудаков Н.В., Оберт А.С. Клещевой риккет-сиоз. Омск, 2001. 120 с.
2. Рудаков Н.В. Риккетсии и риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки в Сибири / Н.В. Рудаков [и др.]. Омск, 2012. 288 с.
3. Proposal to create subspecies of Rickettsia sibirica and an emended description of Rickettsia sibirica / P.-E. Fournier [et al.] // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. Vol. 1078. P. 597-606.
4. Решетникова Т.А. [и др.]. История создания и этапы развития рабочей коллекции штаммов риккетсий Омского НИИ природно-очаговых инфекций // Национальные приоритеты России. 2011. № 2. С. 139-141.
5. Detection of Members of the Genera Rickettsia, Anaplasma and Rhrlichia in Ticks Collected in the Asiatic Part of Russia / S. Shpynov [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. Vol. 1087. P. 378-383.
6. Рудаков Н.В. Риккетсии и риккетсиозы : руководство для врачей / ФБУН «Омский НИИ природ-но-очаговых инфекций» Роспотребнадзора. Омск, 2016. 424 с.
7. Genotypic and biological characteristics of nonidentified strain of spotted fever group rickettsiae isolated in Crimea / N.M. Balayeva [et al.] // Acta Viro-logica. 1993. 37(6). P. 475-83.
8. Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species definition in bacteriology / E. Stackebrandt, W. Frederiksen, G.M. Garrity // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2002. № 52. P. 1043-47.
9. Rossello-Mora R. Updating prokaryotic taxonomy // Journal of Bacteriology. 2005. № 187. P. 6255-57.
10. Rydkina E. [et al.]. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union // Emerging Infectious Diseases. 1999. Vol. 5, № 6. P. 811-14.
11. Шпынов С.Н. [и др.]. Клещевой риккетсиоз в Алтайском крае: эпидемиологические аспекты, моле-кулярно-биологическая верификация // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2008. Т. 82, № 7. С. 43-6.
12. Щучинова Л.Д., Злобин В.И. Клещевые трансмиссивные инфекции Республики Алтай / Управление Роспотребнадзора по Республике Алтай, Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Алтай, Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации. Барнаул, 2019. 194 с.
13. Штрек С.В. [и др.]. Генотипирование риккетсий, циркулирующих на территориях Республики Алтай и Хабаровского края // Инфекция и иммунитет. 2023. Т. 13, № 1. С. 100-6.
14. Detection of causative agents of tick-borne rickettsioses in Western Siberia, Russia: identification of Rickettsia raoultii and Rickettsia sibirica DNA in clinical samples / Y. Igolkina [et all.] // Clinical Microbiology and Infection. 2018. Vol. 24, № 2. P. 199. e9-199.e12.
15. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах : 3-е изд-е, перераб. и доп. Москва : Медицина, 1972. 496 с.
16. Еремеева М.Е. Современные подходы к лабораторной диагностике риккетсиозов / М.Е. Ереме-
REFERENCES
1. Rudakov N.V., Obert A.S. Kleschevoy rikketsioz. Omsk, 2001. 120 s.
2. Rudakov N.V. Rikketsii i rikketsiozy gruppy kleschevoy pyatnistoy likhoradki v Sibiri / N.V. Rudakov [i dr.]. Omsk, 2012. 288 s.
3. Proposal to create subspecies of Rickettsia sibirica and an emended description of Rickettsia sibirica / P.-E. Fournier [et al.] // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. Vol. 1078. P. 597-606.
4. Reshetnikova T.A. [i dr.]. Istoriya sozdaniya i etapy razvitiya rabochey kollektsii shtammov rikketsiy Omskogo NII prirodno-ochagovykh infektsiy // Natsion-al'nye prioritety Rossii. 2011. № 2. S. 139-141.
5. Detection of Members of the Genera Rickett-sia, Anaplasma and Rhrlichia in Ticks Collected in the Asiatic Part of Russia / S. Shpynov [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. Vol. 1087. P. 378-383.
6. Rudakov N.V. Rikketsii i rikketsiozy : rukovodstvo dlya vrachey / FBUN «Omskiy NII prirod-no-ochagovykh infektsiy» Rospotrebnadzora. Omsk, 2016. 424 s.
7. Genotypic and biological characteristics of nonidentified strain of spotted fever group rickettsiae isolated in Crimea / N.M. Balayeva [et al.] // Acta Virologi-ca. 1993. 37(6). P. 475-83.
8. Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species definition in bacteriology / E. Stackebrandt, W. Frederiksen, G.M. Garrity // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2002. № 52. P. 1043-47.
9. Rossello-Mora R. Updating prokaryotic taxonomy // Journal of Bacteriology. 2005. № 187. P. 6255-57.
10. Rydkina E. [et al.]. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union // Emerging Infectious Diseases. 1999. Vol. 5, № 6. P. 811-14.
11. Shpynov S.N. [i dr.]. Kleschevoy rikketsioz v Altayskom krae: epidemiologicheskie aspekty, mole-kulyarno-biologicheskaya verifikatsiya // Sibirskiy meditsinskiy zhurnal (Irkutsk). 2008. T. 82, № 7. S. 43-6.
12. Schuchinova L.D., Zlobin V.I. Kleschevye transmissivnye infektsii Respubliki Altay / Upravlenie Rospotrebnadzora po Respublike Altay, Tsentr gigieny i epidemiologii v Respublike Altay, Irkutskiy gosudar-stvennyy meditsinskiy universitet Ministerstva zdra-vookhraneniya Rossiyskoy Federatsii. Barnaul, 2019. 194 s.
13. Shtrek S.V. [i dr.]. Genotipirovanie rikketsiy, tsirkuliruyuschikh na territoriyakh Respubliki Altay i Khabarovskogo kraya / // Infektsiya i immunitet. 2023. T. 13, № 1. S. 100-6.
14. Detection of causative agents of tick-borne rickettsioses in Western Siberia, Russia: identification of Rickettsia raoultii and Rickettsia sibirica DNA in clinical samples / Y. Igolkina [et all.] // Clinical Microbiology and Infection. 2018. Vol. 24, № 2. P. 199. e9-199.e12.
15. Zdrodovskiy P.F., Golinevich E.M. Uchenie o rikketsiyakh i rikketsiozakh : 3-e izd-e, pererab. i dop. Moskva : Meditsina, 1972. 496 s.
16. Eremeeva M.E. Sovremennye podkhody k laboratornoy diagnostike rikketsiozov / M.E. Eremeeva,
ева, С.Н. Шпынов, Н.К. Токаревич // Инфекция и иммунитет. 2014. Т. 4, № 2. С. 113-34.
17. Brouqui P. [et al.]. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe // Clinical Microbiology and Infection. 2004. № 10 (12). P. 1108-32.
18. Штрек С.В. [и др.]. Валидация ПЦР в режиме реального времени для оценки количества риккетсий в исследуемом биологическом материале // Клиническая лабораторная диагностика. 2022. № 67 (11). С. 668-71.
19. Roux V. [et all.]. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae // Int J Syst Bacteriol. 1997, Apr; 47 (2) : 252-61. DOI: 10.1099/00207713-47-2-252.
S.N. Shpynov, N.K. Tokarevich // Infektsiya i immunitet. 2014. T. 4, № 2. S. 113-34.
17. Brouqui P. [et al.]. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe // Clinical Microbiology and Infection. 2004. № 10 (12). P. 1108-32.
18. Shtrek S.V. [i dr.]. Validatsiya PTsR v rezhime real'nogo vremeni dlya otsenki kolichestva rikketsiy v issleduemom biologicheskom materiale // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2022. № 67 (11). S. 668-71.
19. Roux V. [et all.]. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae // Int J Syst Bacteriol. 1997, Apr; 47 (2) : 252-61. DOI: 10.1099/00207713-47-2-252.
Сергей Владимирович Штрек — кандидат медицинских наук, доцент, заведующий лабораторией, ведущий научный сотрудник лаборатории зооноз-ных инфекций отдела ПОБЗ; shtrek_sv@oniipi.org; Станислав Николаевич Шпынов — доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций отдела ПОБЗ; Ирина Евгеньевна Самойленко — кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций отдела ПОБЗ; Николай Викторович Рудаков — доктор медицинских наук, профессор, директор Омского НИИ природно-очаговых инфекций; завкафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного медицинского университета; Алексей Владимирович Санников — младший научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций отдела ПОБЗ; Оксана Алексеевна Боброва — младший научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций отдела ПОБЗ.
ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора.
Sergey Vladimirovich Shtrek — Cand. Sc. {Medicine}, Associate Professor, Head of the Laboratory, Leading Researcher at the Laboratory of Zoonotic Infections of the Department of Public Health Protection; shtrek_sv@oniipi.org; Stanislav Nikolaevich Shpynov — Doctor of Medical Sciences, Chief Researcher of the Laboratory of Zoonotic Infections of the Department of Public Safety and Health; Irina Ev-genievna Samoilenko — Cand. Sc. {Medicine}, Leading Researcher at the Laboratory of Zoonotic Infections of the Department of Public Safety and Health; Nikolay Viktorovich Rudakov — Doctor of Medical Sciences, Professor, Director of the Omsk Research Institute of Natural Focal Infections; Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology of Omsk State Medical University; Aleksey Vladimirovich Sannikov — Junior Researcher at the Laboratory of Zo-onotic Infections, Department of Public Safety and Health; Oksana Alekseevna Bobrova — Junior Researcher at the Laboratory of Zoonotic Infections of the Department of Public Health.
Federal Budgetary Institution "Omsk Research Institute of Natural Focal Infections" of Rospotrebnad-zor.
Статья поступила в редакцию 02.02.2024 г.
Цитаты
Будущее принадлежит медицине предохранительной. Эта наука, идя рука об руку с лечебной, принесёт несомненную пользу человечеству.
Николай Иванович Пирогов, российский хирург, анатом, естествоиспытатель и педагог, профессор
