Современные подходы к разработке отечественных питательных сред Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Эпидемиология, экология, специфическая диагностика, профилактика

ffl

УДК 57.083.134:616.98

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

А. П. Шепелин, М. В. Храмов, О. В. Полосенко, И. И. Марчихина, Л. П. Шолохова Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Россия, 141279, Московская обл., п. Оболенск,

Разработана, зарегистрирована в установленном порядке, разрешена к применению отечественная сухая питательная среда для обнаружения колиформных бактерий и Escherichiacoli (Хромагар). Промышленный выпуск и внедрение в практику здравоохранения разработанного препарата существенно сократит время исследования, повысит результативность клинико-лабораторных и санитарно-бактериологических исследований, что особенно важно в условиях чрезвычайных ситуаций и сложной эпидобстановки.

Ключевые слова: сухие питательные среды, хромогенный агар, колиформные бактерии.

MODERN APPROACHES TO THE DEVELOPMENT OF NUTRIENT MEDIA IN RUSSIAN

FEDERATION

A. P. Shepelin, M. V. Khramov, O. V. Polosenko, I.I. Marchikhina, L. P. Sholokhova

Federal Budgetary Institution of Science State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Rospotrebnadzor of the Russian Federation, 141279, Moscow Region, Obolensk, Russian Federation.

A dehydrated nutrient medium for detection of coliform bacteria and Escherichia coli (Chromagar) has been developed, registered and allowed for use in Russia. Industrial production and introduction in practice of health care of the developed medium significantly reduces research time, increases efficiency of clinical-laboratory and sanitary-bacteriological tests that is especially important in case of emergency and in the period of high epidemiological risk.

Keywords: dehydrated nutrient media, hromogenous agar, coliform bacteria.

Современный подход к созданию и внедрению в медицинскую практику препаратов нового поколения, новейших лабораторных методов анализа, обладающих высокой технологичностью, информативностью, производительностью, низкой стоимостью позволяет диагностировать инфекционные заболевания с эффективностью, приближающейся к 100 %.

Хромогенные и флюорогенные питательные среды внедрены в практику микробиологии для одновременного определения широкого спектра микроорганизмов на одной чашке Петри с первичным посевом, за счёт роста микроорганизмов разных видов в виде колоний определённых цветов, либо способности колоний к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Хромогенные питательные среды могут быть использованы для групповой, родовой, видовой и внутривидовой идентификации бактерий. Наличие специфической ферментной активности микроорганизма

определяется по изменению цвета субстрата, при расщеплении которого данным ферментом, образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. Поскольку смесь субстратов вводится в состав сред (в том числе селективных) для первичного посева, то выделение чистой культуры и её идентификации может быть осуществлены уже в течение первых суток исследования. Данные среды используют для быстрого и простого обнаружения в аналите целого ряда микроорганизмов, имеющих важное значение для клинической и санитарной микробиологии: Escherichia coli и другиеколиформные бактерии, энтероге-моррагические эшерихии (E. coli0157:H7), энтерококки, клостридии и др.

Актуальной является проблема диагностики оппортунистических инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами (УПМ). Это широкий спектр патогенов включающий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,

ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)

РгсЛе^ткаЫ^и др. Значение УПМ особенно велико при вспышках внутрибольничных инфекций в отделениях различного профиля: хирургических, интенсивной терапии, онкологических, урологических и др. [4].

Ведущими зарубежными фирмами выпускаются хромогенные питательные среды для микробиологических исследований, в том числе для одновременного определения колифор-мных бактерий и E. coli: CHROMagartmECC «CHROMAGAR» Франция, селективная среда хромогенная для E. coli «PRONADISA» Испания, HiCromeColiformAgar w/SLS «HIMEDIA» Индия [7], ChromocultColiformAgar «MERCK» Германия [2] и др.

Селективно-дифференциальные среды для эшерихий основаны на детекции специфического фермента B-D-глюкуронидазы E. coli по хромоген-ной реакции с субстратами эфиров B-D-глюкуроно-вой кислоты. Идентификация по тесту B-D-глюкуро-нидазы недостаточно специфична: положительные реакции у некоторых штаммов шигелл, сальмонелл, иерсиний и отсутствие у 3-5 % штаммов эшерихий, в том числе у E. coli0157:H7 приводят к ложным результатам [5].

Комбинация смесей хромогенных субстратов позволяет одновременно определить колиформ-ные бактерии и E. coli. Фермент 8-галактозидаза, характерный для колиформных бактерий, расщепляет хромогенный субстрат Salmon-Gal или Rose-Gal, что ведёт к окрашиванию колоний колиформных бактерий в розовый (красный) цвет. Фермент 8-глюкуронидаза, характерный для E. coli, расщепляет хромогенный субстрат (X-GLUC). E. coli (кроме E. coli0157:H7) имеют оба фермента, поэтому их колонии окрашиваются в тёмно-синий (фиолетовый) цвет и чётко отличаются от колоний колиформных бактерий. Рост грамположительных бактерий подавляется додецилсульфатом натрия. Для подтверждения принадлежности к E. coli возможна постановка теста на индол. Применение таких сред упрощает идентификацию возбудителя и сокращает время исследования.

Цель - разработка отечественной хромоген-ной питательной среды (Хромагар) для обнаружения колиформных бактерий и E. coli, основанной на комбинированном действии двух хромогенных субстратов (B-D-глюкуронидазы для E. coli и 8-D-галактозидазы для колиформных бактерий); изучение диагностической ценности хромогенной питательной среды (специфическая активность: чувствительность, скорость роста, стабильность основных биологических свойств микроорганизмов, дифференцирующие и ингибирующие свойства), в сравнительных испытаниях с коммерческим препаратом HiCromeColiformAgar

w/SLS (производства HiMedia), выпускаемым в соответствии с нормативной документацией и в период его срока годности.

Методы. При разработке питательной среды для обнаружения колиформных бактерий и E. coli. в качестве белкового компонента использован панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), который в совокупности с натрием пировинограднокислым удовлетворяет питательные потребности бактерий в аминном азоте и пептидах, а так же обеспечивает рост повреждённых бактерий. Селективный агент - натрий додецилсульфат.

Изопропил-8^1-тиогалактопиранозид (IPTG) является индуктором ферментативных реакций, натрий фосфорнокислый двузамещён-ный и калий фосфорнокислый однозамещённый обеспечивают поддержание рН в процессе роста микроорганизмов.

Качество питательной среды оценивали по физико-химическим и биологическим показателям в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» [1].

Для контроля качества питательных сред использованы тест-штаммы, полученные из отдела коллекционных культур ФБУН ГНЦ ПМБ: Escherichia coli Ewing 227 (О124:К72), Escherichia coli 4 (О157:Н7), Citrobacter freundii 101/57, Klebsiella pneumoniae 418, Escherichia coli 3912/41 (О55:К59), Escherichia coli АТСС 25922, Shigella flexneri 1 a8516, Salmonella typhimurium 79, Enterobacter aerogenes 10006, Proteus vulgaris HX 19222, Bacillus cereus 8035, Enterococcus faecalis 775.

Готовили стандартные взвеси культур каждого тест-штамма, соответствующие 10 единицам по стандартному образцу мутности, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых разведений.

Результаты. Проведён анализ компонентного состава и биологических свойств хромогенных сред ведущих зарубежных фирм. Присутствие в Хромогенномагаре ТВХ фирмы Hem[6], только одного хромогенного субстрата X-B-D-глюкуроно-вой кислоты позволяет выявлять только глюку-ронидазопозитивные штаммы и затрудняет дифференциацию от других энтеробактерий. Также было отмечено, что наличие сорбита в питательной среде фирмы Merck, не влияет на дифференцирующие свойства.

При разработке отечественной хромоген-ной питательной среды (Хромагара) изучены различные белковые гидролизаты производства ГНЦ ПМБ: ПГРМ, панкреатический гидролизат

Эпидемиология, экология, специфическая диагностика, профилактика

казеина (ПГК), панкреатический гидролизат желатина (ПГЖ), а также мясные пептоны. Из всех гидролизатов наиболее эффективными оказались ПГРМ и мясные пептоны.

Хромогенная смесь: Salmon-GAL в количестве 0,1 г/л и X-GLUC в количестве 0,075 г/л, позволяет провести чёткую дифференциацию энтеро-бактерий бактерий от E. coli.

Дополнительное введение в состав питательной среды 1-изопропил^^1-тиогалактопирано-зида (IPTG), являющегося индуктором ß-галакто-зидазы, усиливает интенсивность окрашивания колоний энтеробактерий по сравнению с контрольной средой HiCromeColiformAgar w/SLS [3].

обсуждение. В мае 2013 года в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Санкт-Петербург» Хромагар успешно прошёл испытания при посеве клинического материала с целью обнаружения и идентификации ПБА, вызвавших рост заболеваний острыми кишечными инфекциями. Культура в дальнейшем проверена на видо-

вое соответствие с помощью масс-спектрометра DaltonikMAIDI-Biotyper, а также идентификационных тест-систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.

В ноябре 2013 г на базе лаборатории МБУЗ «Пятигорская городская инфекционная больница» проведены испытания Хромагара с использованием аналита от больных, с подозрением на патогенные энтеробактерии.

Испытания показали, что Хромагар обеспечивает эффективное накопление, рост и межродовую дифференциацию энтеробактерий, ин-гибируя рост сопутствующих микрофлоры, что соответствует требованиям, предъявляемым к хромогенным средам, выпускаемым ведущими зарубежными фирмами и рекомендован к использованию в практике санитарно-бактериоло-гических исследований воды, пищевых продуктов и других объектов для обнаружения и выделения колиформных бактерий и E. coli.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Методы контроля бактериологических питательных сред: методические указания МУК 4.2.2316-08. - М: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 68 с.

2. Определение колиформных бактерий и E. coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия). Методические рекомендации. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - С. 8-12.

3. Полосенко О. В., Шепелин А. П.. Марчихина И. И., Шолохова Л. П. Новые питательные среды для диагностики кишечных инфекций // Проблемы антибио-тикорезистентности возбудителей внутрибольничных

инфекций: сб. науч.-практ. работ / под ред. Г. Г. Харсе-евой. - Ростов н/Д: Изд-во РостГМУ, 2013. - 72 с.

4. Руководство по медицинской микробиологии. Кн. III, т. 1. Оппортунистические инфекции: возбудители и этиологическая диагностика / под ред. А. С. Лабин-ской, Н. Н. Костюковой. - М: БИНОМ, 2013. - С. 17.

5. Сиволодский Е. П. Систематика и идентификация энтеробактерий / НИИЭМ им. Пастера. - СПб, 1998. - С. 8.

6. Среды бактериологические (каталог 2009-2010 гг.) www.hemltd.ru HEM. - Тверь: Триада. - С. 96.

7. Экспресс-диагностика. Дифференциация микроорганизмов в первичном посеве серия HiCrome // HIMEDIA Laboratories Pvt. Limited. - 2012. - С. 5.

Шепелин Анатолий Прокопьевич - д-р биол. наук, заместитель директора по научно-производственной работе ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»,

Храмов Михаил Владимирович - канд. мед. наук, заместитель директора по качеству и развитию ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»,

Полосенко ольга Вадимовна - канд. биол. наук, с.н.с. лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»,

Марчихина ирина ивановна - заведующая лабораторией микробиологических и физико-химических методов анализа ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»,

Шолохова Любовь Петровна - заведующая сектором микробиологических методов анализа ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 16 сентября 2014 г.