CC BY
61
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК Б1Б.9-07-052-022.Б
СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ХАРАКТЕРИСТИКЕ ИЗОЛЯТОВ ВИЧ-1 ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ УЧРЕЖДЕНИЙ ПЕНИТЕНЦИАРНОЙ СИСТЕМЫ
Н.Н. Зайцева, О.Ю. Пекшева, О.В. Парфенова, Т.Ю. Бутина, И.В. Кузнецова,
ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной»,
Зайцева Наталья Николаевна - e-mail: [email protected]
С помошью современных молекулярно-генетических методов исследования охарактеризованы штаммы ВИЧ-1 от 143 пациентов, не получавших антиретровирусную терапию (АРВТ) и находившихся на момент проведения исследования в учреждениях пенитенциарной системы. Было установлено, что показатели клеточного иммунитета и уровня РНК ВИЧ у нелеченых пациентов зависят от сроков давности инфицирования и являются результатом естественного течения ВИЧ-инфекции. Мутаций, определяющих первичную лекарственную устойчивость ВИЧ к АРВ-препаратам, не обнаружено. Наличие значительного спектра «малых» мутаций и мутаций полиморфизма, в частности в гене протеазы, может явиться причиной снижения генетического барьера развития резистентности ВИЧ, что необходимо учитывать при назначении и мониторинге лечения в дальнейшем. Выявление устойчивых к АРВ-препаратам штаммов вируса у нелеченых пациентов указывает на целесообразность проведения теста на резистентность ВИЧ не только в случае неэффективности терапии, но и перед ее назначением. Генетические варианты ВИЧ-1 субтипа А в исследуемой группе являются доминирующими. Современные молекулярно-генетические методы исследования вносят определенный вклад в систему эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией по особенностям территориальных эпидемий ВИЧ-инфекции в России (в том числе для изолированных коллективов).
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, резистентность, антиретровирусная терапия, вирусная
нагрузка, иммунорегуляторный индекс, субтипы ВИЧ-1.
Using modern molecular-genetic methods were characterized strains of HIV-1 from 143 patients not receiving art, and were at the time of the study in the penitentiary system. It was found that the indicators of cellular immunity and HIV RNA levels in untreated patients depend upon expiration of infection and are the result of the natural course of HIV infection. Mutations that define primary drug resistance of HIV to antiret-roviral drugs, not detected.The presence of a significant range of «small» mutations and mutations of polymorphism, in particular in the protease gene may be a cause of low genetic barrier for the development of HIV resistance that must be considered when prescribing and monitoring treatment in the future.Identifying resistant to ARVs strains of the virus in untreated patients, indicates the appropriateness of the test for resistance not only in the case of treatment failure, but before her appointment. Genetic variants of HIV-1 subtype a in the study group are dominant. Modern molecular-genetic methods of research make a definite contribution to the system of epidemiological surveillance of HIV-infection on the territorial peculiarities of the HIV epidemic in Russia (including isolated groups).
Key words: HIV infection, resistance, antiretroviral therapy, viral load, immunoregulatory index,
subtypes of HIV-1.
Введение
ВИЧ-инфекция на современном этапе продолжает оставаться актуальнейшей инфекционной патологией. В последние годы на части территорий РФ, в том числе и в Приволжском федеральном округе (ПФО), сохраняется тенденция к росту показателя частоты выявления ВИЧ-инфекции среди потребителей инъекционных наркотиков [1]. Значительное число ВИЧ-позитивных граждан, вследствие маргинального образа жизни, включающего употребление и сбыт психоактивных веществ, находятся в местах лишения свободы, что определяет остроту проблемы социально-значимых инфекционных заболеваний, в том числе и ВИЧ-инфекции, в учреждениях пенитенциарной системы [2]. Ежегодно в Приволжском федеральном округе, по данным статистической отчетной формы № 4 «Сведения о результатах исследования крови на антитела к ВИЧ», число лиц с положительным результатом тестирования на ВИЧ-инфекцию по коду «112» (заключенные), составляет около 2000-2500 человек. Современный под-
ход к проведению эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, в том числе и в изолированных коллективах, может быть усовершенствован с помощью молекулярно-генетических методов исследования [3, 4].
Цель исследования: дать молекулярно-генетическую характеристику штаммов ВИЧ-1, выделенных от лиц, находящихся в учреждениях пенитенциарной системы, с помощью современных методов исследования.
Материал и методы
Приволжским окружным центром по профилактике и борьбе со СПИД в 2011-2013 гг. в рамках межведомственного взаимодействия с Главным управлением Федеральной службы исполнения наказаний (ГУФСИН) РФ по Нижегородской области было осуществлено лабораторное сопровождение стандартов оказания медицинской помощи ВИЧ-позитивным заключенным.
Были исследованы образцы биоматериала от 143 ВИЧ-инфицированных из восьми регионов России и стран СНГ: Нижегородская, Московская, Ивановская, Брянская,
▲1
SSM
Волгоградская области, Республика Татарстан, Республика Молдова, Азербайджанская республика. Все пациенты в период с 2002 по 2013 г. были поставлены на диспансерный учет в территориальных центрах по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями сдиагнозом «ВИЧ-инфекция», ранее не получали антире-тровирусную терапию (АРВТ) и находились на момент проведения исследования (2013 год) в учреждениях Главного управления федеральной службы исполнения наказания (ГУФСИН) РФ по Нижегородской области.
Определение показателей клеточного иммунитета выполняли на проточном цитофлуориметре BectonDickinson FACS Canto II с использованием набора MultitestCD3/CD8/CD45/CD4wTrucountCe.
Для определения РНК ВИЧ использовали тест-систему ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва, «АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT») с детекцией в режиме «реального времени».
Автоматическое секвенирование осуществлялось на генетическом анализаторе ABI Prism 3100 AppliedBiosystems (США). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей и определение мутаций резистентности ВИЧ-1 проводили с использованием программного обеспечения ViroseqHIV-1 GenotypingSystemSoftware v.2.8 (Celera, США) согласно инструкции производителя и базы данных Стэнфордского университета. Филогенетический анализ осуществляли с помощью программы MEGAversion 5. В качестве группы сравнения использовали нуклеотидные последовательности из собственной базы и международной базы данных GenBank.
Для определения субтипов ВИЧ-1 применяли программное обеспечение COMETHIV-1/2andHCV и REGAHIV-1 SybtypingToolv.2.0.
Статистический анализ полученных результатов проводили на базе интегрированного пакета прикладной программы MicrosoftOfficeExel 2010. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, считая достоверным уровень p^0,05.
Результаты и их обсуждение
Все обследованные пациенты были мужского пола; основными факторами передачи ВИЧ в 99,3% случаев было инъекционное употребление психоактивных веществ, в 0,7% - гетеросексуальные контакты.
Возраст обследуемых колебался в пределах от 20 до 60 лет, основная масса инфицированных находилась в возрастной категории 30-39 лет (72,1%), 20-29-летние составляли 18,0%, лица в возрасте 40-49 и 50-60 лет составили соответственно 6,9% и 3,0%.
До заключения в места лишения свободы (МЛС) в Нижегородской области проживало более 80% обследованных, остальные - в других областях и республиках России и странах СНГ.
В 3-й субклинической стадии находились 58,2% ВИЧ-инфицированных, 41,8% имели 4-ю стадию болезни, из них 90,6% - стадию 4Б, стадии 4А и 4В составили соответственно 6,3% и 3,1%.
Поскольку, по ряду причин, установить давность инфицирования ВИЧ практически невозможно, нами были выделены три группы, исходя из даты первого положительного результата на антитела к вирусу иммунодефицита человека методом иммунного блоттинга (ИБ). Так, у
26,5% обследованных данный период составил менее одного года (первая группа), у 63,9% - от двух до десяти лет (вторая группа) и у 9,6% обследованных - свыше десяти лет (третья группа).
Анализ полученных результатов показал, что у всех лиц, инфицированных не более одного года назад, количество CD4-лимфоцитов было выше уровня 500 кл/мкл. У лиц из второй и третьей групп отмечено постепенное снижение количества CD4-лимфоцитов, что является результатом естественного течения ВИЧ-инфекции (рис. 1).
<1года 2 -10 лет >10 лет
РИС. 1.
Соотношение количества CD4-лимфоцитов у лиц, находящихся в МЛС, в зависимости от давности инфицирования ВИЧ (%).
В третьей группе пациентов доля лиц с пороговым значе-ниемуровня CD4-лимфоцитов менее 350 кл/мкл составила большинство (71,4%), превысив уровень свыше 500 кл/ мкл в 2,5 раза (р<0,05). Данный факт предполагает необходимость более пристального внимания в плане охвата диспансерным наблюдением и соблюдения стандартов оказания медицинской помощи ВИЧ-инфицированным.
В целом в общей когорте ВИЧ-позитивных количество CD4-лимфоцитов более 500 кл/мкл определялось у 54,2% обследованных, а у 28,9% заключенных число CD4-клеток было ниже уровня 350 кл/мкл, предполагающего назначение АРВТ.
Динамика снижения числа CD4-лимфоцитов в процессе развития ВИЧ-инфекции обусловливает изменение имму-норегуляторного индекса (ИРИ) CD4/CD8 (рис. 2). Сй4+/С08+
0,7
0,2 0,1 О
< 1 года 2 -10 лет > 10 лет
РИС. 2.
Изменение коэффициента CD4/CD8 в зависимости от давности инфицирования ВИЧ.
Выявлено, что средний показатель коэффициента CD4/ CD8 у лиц, инфицированных менее года назад, составил 0,63, у лиц с давностью заражения от 2 до 10 лет - 0,49,
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
у заразившихся более 10 лет - 0,38. А в общей когорте инфицированных более половины (55,2%) ВИЧ-позитивных имели значение ИРИ менее 0,5; у 34,9% -коэффициент находился в пределах 0,5-1,0 и только у 9,8% инфицированных - свыше 1,0. Такое состояние иммунной системы пациентов, вероятно, объясняется изменением специфической регуляции иммунного ответа при ВИЧ-инфекции, предполагающим не только снижение числа CD4-лимфоцитов, но и гиперактивацию цитотокси-ческих клеток СД8 [5, 6, 7].
Следует отметить, что динамика изменения количества CD4-клеток и иммунорегуляторного индекса не отличалась от таковой среди ВИЧ-инфицированных, не содержащихся в МЛС [8, 9, 10].
Анализ количественного определения РНК ВИЧ показал, что в целом у 59,5% заключенных вирусная нагрузка ВИЧ составила от 10 000 до 100 000 коп/мл, у 25,8% - находилась ниже уровня в 10000 коп/мл, у 14,7% - выше 100 000 коп/мл. Причем вполне ожидаемо, что у пациентов, заразившихся менее года назад, не было выявлено случаев, когда концентрация РНК ВИЧ превышала 100 000 коп/мл, а в группе лиц со сроком заражения свыше десяти лет треть ВИЧ-позитивных (33,3%), напротив, имела таковую.
Исследования по определению мутаций первичной резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам (АРВ-препаратам) были проведены для нуклеотидных последовательностей всех 143 штаммов. Однако, значительная часть заключенных (92,3%) в анализируемой нами группе не соответствовала критериям по отбору пациентов для мониторинга за передающейся устойчивостью вируса [11]. Вместе с тем штаммы ВИЧ, выделенные от этих пациентов, содержали мутации, определяющие резистентность к группе ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ): G190S, ведущая к развитию высокого уровня устойчивости к невирапину и эфавирен-зу, и К101Е, снижающая чувствительность к невирапину. Кроме того, обнаружен значительный спектр «малых» мутаций и мутаций полиморфизма в гене протеазы ВИЧ, по сравнению с геном обратной транскриптазы (р<0,05). Все они не затрагивали активную область фермента и ассоциировались с низким уровнем резистентности вируса к АРВ-препаратам. Мутации, незначительно снижающие чувствительность к группе препаратов нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ (НИОТ), были представлены заменами в следующих позициях: A62V, V118I и Т69^ к группе ННИОТ - V90I, К1010, ^061, ^791. По нашим данным, наиболее часто встречались A62V (26,5%) и V90I (14,5%) (р<0,05), при этом сочетание обеих мутаций наблюдалось в 15,6% случаев и у тех пациентов, продолжительность инфицирования которых в среднем составляла около шести лет. В связи с этим можно предположить, что данные мутации могут косвенно указывать на длительность заболевания.
В целом мутации определялись в 43,4% случаев и были направлены на препараты группы НИОТ в 31,3% случаев, ННИОТ - в 24,1%, ингибиторов протеазы (ИП) - в 15,7%.
Одиннадцать человек (7,7%) из изучаемой когорты соответствовали критериям для изучения первичной лекарственной устойчивости вируса иммунодефицита человека. Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей
показал отсутствие мутаций, определяющих резистентные свойства ВИЧ к АРВ-препаратам, у этих пациентов.
Множественные мутации, ассоциированные с резистентностью ВИЧ к двум и более классам АРВ-препаратов, выявлены у пациентов из Нижегородской и Брянской областей, Республики Татарстан (16,8% случаев).
Генотипирование штаммов ВИЧ-1 в исследованных образцах от заключенных позволило выявить практически однородную популяцию: 98,6% образцов были представлены субтипом А. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей данных образцов не выявил специфичности и выраженной кластеризации, например, по общности к одной исправительной колонии.
Нехарактерные для изучаемых регионов генетические варианты вируса субтипов G и В были выявлены по одному случаю в образцах из Нижегородской и Брянской областей. Они формируют отдельные ветви филогенетического дерева (рис. 3), с максимальной степенью сродства для субтипа G - со штаммом из Сенегала, а для субтипа В - со штаммом из Белоруссии (данные GenBank).
I---1
0.006
РИС. 3.
Субтипы ВИЧ-1 среди ВИЧ-инфицированных заключенных (по результатам филогенетического анализа).
Al
SSM
Выводы
1. Показатели клеточного иммунитета и уровня РНК ВИЧ у нелеченых пациентов зависят от сроков давности инфицирования и являются результатом естественного течения ВИЧ-инфекции.
2. Мутаций, определяющих первичную лекарственную устойчивость ВИЧ к АРВ-препаратам, у ВИЧ-позитивных заключенных не выявлено.
3. Наличие значительного спектра «малых» мутаций и мутаций полиморфизма, в частности в гене протеазы ВИЧ, может явиться причиной снижения генетического барьера развития резистентности ВИЧ, что необходимо учитывать при назначении и мониторинге лечения в дальнейшем.
3. Выявление устойчивых к АРВ-препаратам штаммов ВИЧ у нелеченых пациентов указывает на целесообразность проведения теста на резистентность вируса не только в случае неэффективности терапии, но и перед ее назначением.
4. Генетические варианты ВИЧ-1 субтипа А в исследуемой группе заключенных являются доминирующими.
5. Современные молекулярно-генетические методы исследования вносят определенный вклад в систему эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией по особенностям территориальных эпидемий ВИЧ-инфекции в России (в том числе для изолированных коллективов).
ЛИТЕРАТУРА
1. Покровский В.В., Ладная Н.Н., Соколова Е.В. и др. ВИЧ-инфекция. Информ. бюл. 2014. № 39.
Pokrovskij V.V., Ladnaya N.N., Sokolova E.V. idr. VICH-infekciya. Inform. byul. 2014. № 39.
2. Боровицкий В.С. ВИЧ и коинфекции в пенитенциарной системе. ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2013. № 1 (5). С. 110-115.
Borovickij V.S. VICH ikoinfekcii v penitenciarnoj sisteme. VICH-infekciya i immunosupressii. 2013. № 1 (5). S. 110-115.
3.Бобкова М.Р. Молекулярно-генетические методы в изучении эпидемиологии инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем: автореф. дис. ... док. биол. наук. Москва, 2002. 42 с.
Bobkova M.R. Molekulyarno-geneticheskie metody v izuchenii epidemiologii infekcij, vozbuditeli kotoryh peredayutsya parenteralnym putem: avtoref. dis. ... dok. biol. nauk. Moskva, 2002.42s.
4. Зверев С.Я. Научное обоснование механизма развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на основе молекулярно-генетических исследований: fвтореф. дис. ... док. мед. наук. Пермь, 2010. 46 с.
Zverev S.Ya. Nauchnoe obosnovanie mexanizma razvitiya epidemicheskogo processa VICH-infekcii na osnove molekulyarno-geneticheskix issledovanij: avtoref. dis.... dok. med. nauk. Perm, 2010.46s.
Б. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г. ВИЧ-инфекция. Клиника, диагностика, лечение. М.: Медицина, 2000. 496 с.
Pokrovskij V.V., Ermak T.N., Belyaeva V.V., Yurin O.G. VICH-infekciya. Klinika, diagnostika, lechenie. M.: Medicina, 2000.496 s.
6. Бобкова М.Р. Иммунитет и ВИЧ-инфекция. М.: Олимпия, 2006. 240 с.
Bobkova M.R. Immunitet i VICH-infekciya. M.: Olimpiya, 2006. 240 s.
7. Бобкова М.Р. Лекарственная устойчивость ВИЧ. М.: Человек, 2014. 288 с.
Bobkova M.R. lekarstvennaya ustojchivost VICH. M.: Chelovek, 2014. 288 s.
8. Серебровская Л.В., Селимова Л.М., Кравченко А.В. и др. Показатели иммунной системы при первом обращении в 1987-2006 гг. ВИЧ-позитивных пациентов, прошедших обследование в Федеральном научно-методическом центре по профилактике и борьбе со СПИДом. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008. № 1. С. 28-32.
Serebrovskaya L.V., Selimova L.M., KravchenkoA.V. idr. Pokazateliimmunnoj sistemy pri pervom obrashhenii v 1987-2006 gg. VICH-pozitivnyx pacientov, proshedshix obsledovanie v Federalnom nauchno-metodicheskom centre po profilaktike i borbe so spidom. Epidemiologiya i infekcionnye bolezni. 2008. № 1. S. 28-32.
9. Селимова Л.М., Казеннова Е.В., Серебровская Л.В. и др. Основные показатели иммунной системы пациентов различных групп риска, инфицированных ВИЧ-1 подтипами А и В. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. № 6. С. 44-49.
Selimova L.M., Kazennova E.V., Serebrovskaya L.V. idr. Osnovnyepokazateli immunnoj sistemy pacientov razlichnyx grupp riska, inficirovannyx VICH-1 podtipami A i B. Epidemiologiya i infekcionnye bolezni. 2006. № 6. S. 44-49.
10. Каминский Г.Д., Серков И.Л., Жукова Е.В. и др. Гетерогенность когорты лиц, живущих с ВИЧ/СПИДом, с большим сроком инфицирования по показателям вирусологического и иммунологического мониторинга ВИЧ-инфекции. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010. № 3. С. 38-42.
Kaminskij G.D., Serkov I.L., Zhukova E.V. i dr. Geterogennost kogorty lic, zhivushhix s VICH/spidom, s bolshim srokom inficirovaniya po pokazatelyam virusologicheskogo i immunologicheskogo monitoringa VICH-infekcii. Epidemiologiya i infekcionnye bolezni. 2010. № 3. S. 38-42.
11. Надзор за распространением штаммов ВИЧ, резистентных к антиретро-вирусным препаратам: Методические рекомендации МР 3.1.1.0075/1-13. М.: Роспотребнадзор, 2013.
Nadzor za rasprostraneniem shtammov VICH, rezistentnyx k antiretrovirusnym preparatam: Metodicheskie rekomendacii MR 3.1.1.0075/113. M.: Rospotrebnadzor, 2013. ^
