Современные методы определения апоптоза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2005 - Т. XII, № 3-4 - С. 33

Статья

УДК 611-018.1

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОЗА А.Б. ЛЕВИЦКАЯ, Д.Б. НИКИТЮК*

Апоптоз - один из вариантов программируемой клеточной гибели, основное предназначение которого, как физиологического процесса - поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах и тканях организма и удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл. В отличие от гибели клеток, вызываемой патологией, процессы апоптоза происходят в ядре и цитоплазме при сохранении целостности клеточной оболочки [1]. Основными критериями, характерными для апоптоза, являются: функционально - необратимое прекращение жизнедеятельности клетки; морфологически - потеря микроворсинок и межклеточных контактов, конденсация хроматина, уменьшение объема клетки, ее фрагментация и образование апоптозных телец [2]; биохимически - гидролиз белков цитоплазмы и межнуклеосом-ный распад ДНК [1]; генетически - структурно-функциональная перестройка генетического аппарата клетки [3]. В мире приняты следующие основные методы определения апоптоза.

I. Морфологические: световая микроскопия гистологиче-

ских препаратов и полутонких срезов; электронная, фазовоконтрастная, поляризационная, флюорисцентная, электронно-

трансмиссионная микроскопия; сканирующая, световая и электронно-микроскопическая радиоавтография, с использованием радиоактивной метки; TUNEL- и ISEL-методы, используемые для оценки апоптоза в тканевых срезах с помощью встроенных в концевые фрагменты ДНК меченых нуклеотидов.

II. Биохимические: электорофорез в агарозном геле с компьютерной денситометрией электрофореграмм для количественного определения степени фрагментации ДНК; метод ДНК-комет, или метод электрофореза единичных клеток со сканированием комет; определение активности каспаз.

III. Иммунологические: использование поли- и монональ-ных антител для выявления рецепторов на поверхности клеток, продуктов онкогенов и антионкогенов, цитотоксинов, ростовых факторов и других структур, антител против каспаз, а также против белков, регулирующих процесс апоптоза.

IY. Иммуноцитохимические: детекция апоптоза по идентификации экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне мембраны клетки с помощью ФИТЦ-меченного аннексина и последующей люминесцентной микроскопией.

Y. Иммуногистохимические: использование специфических маркеров клеточного цикла Кь67 PCNA с обработкой срезов в СВЧ-печи. Оценку результатов проводят стрептовидин-биотинпероксидазным методом.

YI. Проточная цитофлюориметрия позволяет выявить число апоптотических клеток в популяциях лимфоцитов, тимоцитов, макрофагах, клеток культуры. Апоптотические ядра обнаруживаются как широкий пик гиподиплоидной ДНК, который легко отличим от узкого диплоидного пика ДНК нормальных клеток.

YII. Вестерн-блот анализ применяется для идентификации электрофоретически разделенных полипептидных цепей. В качестве зондов используются меченые антитела.

YIII. Биотехнологические: трансфекция клонируемого гена в соматические клетки животных и человека; создание трансгенных мышей для выяснения роли введенного гена в клеточном развитии и гибели клеток.

Изучен уровень апоптоза гепатоцитов при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом. Для создания модели токсического гепатита крысам-самцам Вистар опытной группы в течение 9 дней вводили внутримышечно 50% раствор четыреххлористого углерода в оливковом масле в дозе 0,3 мл на 100 г. массы тела. Контрольные и опытные животные содержались на общевиварном рационе и получали воду ad libitum. Показано статистически малозначимое увеличение активности каспазы -3 - на 9,3% в печени крыс опытной группы по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы. Межнуклеосомной фрагментации ДНК гепатоцитов у животных как опытной, так и контрольной группы при этом не наблюдалось.

Поражение печени при действии 4-хлористого углерода сопровождается активацией каспазы-3 и не приводит к межнуклео-сомной фрагментации ДНК. По-видимому, при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом, вклад процессов каспаза-зависимого апоптоза незначителен и гибель гепатоцитов развивается по другим механизмам [4].

С помощью проточной цитофлюориметрии изучено влияние пребиотиков инулина и олигофруктозы на спонтанный апоп-тоз в клетках иммунной системы. Крысы самцы Вистар двух опытных групп в течение 28 дней содержались на изокалорийном полусинтетическом казеиновом рационе, в котором кукурузный крахмал заменяли на инулин или олигофруктозу (10 % по массе).

Контрольные животные получали стандартный полусинте-тический казеиновый рацион. Исследовались суспензии клеток тимуса, селезенки, брызжеечных лимфатических узлов и перитонеальных макрофагов. Установлено, что обогащение рационов крыс инулином и олигофруктозой не оказывало влияния на процессы апоптоза в клетках иммунной системы [5, 6].

Ныне наметилась тенденция к использованию количественных методов оценки апоптоза, таких как проточная цитофлюориметрия, определение активности каспаз, ТУННЕЛЬ-метод, электронная микроскопия и др. Учитывая неоднозначность признаков апоптоза, необходимо комплексное использование разных методов для определения и оценки апоптотической гибели.

Литература

1. Kerr J.F.R. et al. // Brit. J. Cancer.- 1972.- Vol. 26.- P. 239257.

2. Wyllie AH. et al. // Int. Rev.Cytol.- 1980.- Vol. 68.- P. 251306.

3. Лушников Е. Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).- М, Медицина, 2001.- 192 с.

4. Левицкая А.Б., Москалева Е.Ю. // Мат-лы VIII Всерос. конгр. «Оптимальное питание - здоровье нации».- М., 2005.-С. 75.

5. Трушина Э.Н. и др. // Мат-лы 3-й Межд. науч.-иссл. конф. «Питание здорового и больного человека».- СПб.- 2005.- С.197.

6. Трушина Э.Н. и др. // Вопр. пит.- 2005.- №3.- С. 35^0.

УДК 539.16.047:574

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОГЛОЩЕННОЙ ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ ПРИ УВЧ-ТЕРАПИИ

С.Ю. ПЕРОВ*

Воздействие в лечебных целях на организм человека электрическим или магнитным полем ультравысокой частоты (УВЧ) является одним из наиболее распространенных методов в физиотерапии [1]. На практике зарекомендовал себя способ УВЧ-терапии с применением конденсаторного варианта, когда объект помещается с воздушным зазором между пластинами вторичного (терапевтического) контура генератора. Количество поглощенной энергии и терапевтический эффект находится в зависимости от напряженности электрического поля (ЭП) между конденсаторными пластинами, их величины, формы и расположения относительно тела пациента. В связи с этим важной задачей является корректное определение (дозиметрия) энергии ЭП УВЧ, поглощенной в тканях и органах пациента в процессе воздействия.

Наиболее распространенным методом является дозиметрия по индивидуальным ощущениям пациентом чувства тепла в области воздействия ЭП УВЧ. Однако если даже и оставить в стороне неизбежный субъективизм этого метода дозиметрии, общность в критериях оценки поглощенной энергии ЭП УВЧ отсутствует. В отечественной физиотерапии различают три дозы: I - без ощущения тепла, II - с ощущением слабого тепла и III - с ощущением отчетливого тепла, тогда как в зарубежной практике используется принцип 4-х доз: I - отсутствие ощущения тепла, II

* ГУ НИИ питания РАМН

* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, e-mail: per-off@front.ru