CC BY
44
Статья
УДК 611-018.1
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОЗА А.Б. ЛЕВИЦКАЯ, Д.Б. НИКИТЮК*
Апоптоз - один из вариантов программируемой клеточной гибели, основное предназначение которого, как физиологического процесса - поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах и тканях организма и удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл. В отличие от гибели клеток, вызываемой патологией, процессы апоптоза происходят в ядре и цитоплазме при сохранении целостности клеточной оболочки [1]. Основными критериями, характерными для апоптоза, являются: функционально - необратимое прекращение жизнедеятельности клетки; морфологически - потеря микроворсинок и межклеточных контактов, конденсация хроматина, уменьшение объема клетки, ее фрагментация и образование апоптозных телец [2]; биохимически - гидролиз белков цитоплазмы и межнуклеосом-ный распад ДНК [1]; генетически - структурно-функциональная перестройка генетического аппарата клетки [3]. В мире приняты следующие основные методы определения апоптоза.
I. Морфологические: световая микроскопия гистологиче-
ских препаратов и полутонких срезов; электронная, фазовоконтрастная, поляризационная, флюорисцентная, электронно-
трансмиссионная микроскопия; сканирующая, световая и электронно-микроскопическая радиоавтография, с использованием радиоактивной метки; TUNEL- и ISEL-методы, используемые для оценки апоптоза в тканевых срезах с помощью встроенных в концевые фрагменты ДНК меченых нуклеотидов.
II. Биохимические: электорофорез в агарозном геле с компьютерной денситометрией электрофореграмм для количественного определения степени фрагментации ДНК; метод ДНК-комет, или метод электрофореза единичных клеток со сканированием комет; определение активности каспаз.
III. Иммунологические: использование поли- и монональ-ных антител для выявления рецепторов на поверхности клеток, продуктов онкогенов и антионкогенов, цитотоксинов, ростовых факторов и других структур, антител против каспаз, а также против белков, регулирующих процесс апоптоза.
IY. Иммуноцитохимические: детекция апоптоза по идентификации экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне мембраны клетки с помощью ФИТЦ-меченного аннексина и последующей люминесцентной микроскопией.
Y. Иммуногистохимические: использование специфических маркеров клеточного цикла Кь67 PCNA с обработкой срезов в СВЧ-печи. Оценку результатов проводят стрептовидин-биотинпероксидазным методом.
YI. Проточная цитофлюориметрия позволяет выявить число апоптотических клеток в популяциях лимфоцитов, тимоцитов, макрофагах, клеток культуры. Апоптотические ядра обнаруживаются как широкий пик гиподиплоидной ДНК, который легко отличим от узкого диплоидного пика ДНК нормальных клеток.
YII. Вестерн-блот анализ применяется для идентификации электрофоретически разделенных полипептидных цепей. В качестве зондов используются меченые антитела.
YIII. Биотехнологические: трансфекция клонируемого гена в соматические клетки животных и человека; создание трансгенных мышей для выяснения роли введенного гена в клеточном развитии и гибели клеток.
Изучен уровень апоптоза гепатоцитов при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом. Для создания модели токсического гепатита крысам-самцам Вистар опытной группы в течение 9 дней вводили внутримышечно 50% раствор четыреххлористого углерода в оливковом масле в дозе 0,3 мл на 100 г. массы тела. Контрольные и опытные животные содержались на общевиварном рационе и получали воду ad libitum. Показано статистически малозначимое увеличение активности каспазы -3 - на 9,3% в печени крыс опытной группы по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы. Межнуклеосомной фрагментации ДНК гепатоцитов у животных как опытной, так и контрольной группы при этом не наблюдалось.
Поражение печени при действии 4-хлористого углерода сопровождается активацией каспазы-3 и не приводит к межнуклео-сомной фрагментации ДНК. По-видимому, при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом, вклад процессов каспаза-зависимого апоптоза незначителен и гибель гепатоцитов развивается по другим механизмам [4].
С помощью проточной цитофлюориметрии изучено влияние пребиотиков инулина и олигофруктозы на спонтанный апоп-тоз в клетках иммунной системы. Крысы самцы Вистар двух опытных групп в течение 28 дней содержались на изокалорийном полусинтетическом казеиновом рационе, в котором кукурузный крахмал заменяли на инулин или олигофруктозу (10 % по массе).
Контрольные животные получали стандартный полусинте-тический казеиновый рацион. Исследовались суспензии клеток тимуса, селезенки, брызжеечных лимфатических узлов и перитонеальных макрофагов. Установлено, что обогащение рационов крыс инулином и олигофруктозой не оказывало влияния на процессы апоптоза в клетках иммунной системы [5, 6].
Ныне наметилась тенденция к использованию количественных методов оценки апоптоза, таких как проточная цитоф-люориметрия, определение активности каспаз, ТУННЕЛЬ-метод, электронная микроскопия и др. Учитывая неоднозначность признаков апоптоза, необходимо комплексное использование разных методов для определения и оценки апоптотической гибели.
Литература
1. Kerr J.F.R. et al. // Brit. J. Cancer.- 1972.- Vol. 26.- P. 239257.
2. Wyllie AH. et al. // Int. Rev.Cytol.- 1980.- Vol. 68.- P. 251306.
3. Лушников Е. Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).- М, Медицина, 2001.- 192 c.
4. Левицкая А.Б., Москалева Е.Ю. // Мат-лы VIII Всерос. конгр. «Оптимальное питание - здоровье нации».- М., 2005.-С. 75.
5. Трушина Э.Н. и др. // Мат-лы 3-й Межд. науч.-иссл. конф. «Питание здорового и больного человека».- СПб.- 2005.- С.197.
6. Трушина Э.Н. и др. // Вопр. пит.- 2005.- №3.- С. 35^0.
УДК 539.16.047:574
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОГЛОЩЕННОЙ ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ ПРИ УВЧ-ТЕРАПИИ
С.Ю. ПЕРОВ*
Воздействие в лечебных целях на организм человека электрическим или магнитным полем ультравысокой частоты (УВЧ) является одним из наиболее распространенных методов в физиотерапии [1]. На практике зарекомендовал себя способ УВЧ-терапии с применением конденсаторного варианта, когда объект помещается с воздушным зазором между пластинами вторичного (терапевтического) контура генератора. Количество поглощенной энергии и терапевтический эффект находится в зависимости от напряженности электрического поля (ЭП) между конденсаторными пластинами, их величины, формы и расположения относительно тела пациента. В связи с этим важной задачей является корректное определение (дозиметрия) энергии ЭП УВЧ, поглощенной в тканях и органах пациента в процессе воздействия.
Наиболее распространенным методом является дозиметрия по индивидуальным ощущениям пациентом чувства тепла в области воздействия ЭП УВЧ. Однако если даже и оставить в стороне неизбежный субъективизм этого метода дозиметрии, общность в критериях оценки поглощенной энергии ЭП УВЧ отсутствует. В отечественной физиотерапии различают три дозы: I - без ощущения тепла, II - с ощущением слабого тепла и III - с ощущением отчетливого тепла, тогда как в зарубежной практике используется принцип 4-х доз: I - отсутствие ощущения тепла, II
* ГУ НИИ питания РАМН
* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, e-mail: per-off@front.ru
Статья
- ощущение слабого тепла, III - ощущение приятного тепла и IV
- ощущение сильного, но переносимого тепла. Такая неоднозначность создает трудности как при сравнении доз для лечебных методик с использованием различных аппаратов для УВЧ-терапии, так и в процессе их воспроизведения у пациента.
Возникает необходимость объективного измерения поглощенной в тканях и органах пациента энергии ЭП УВЧ, которое позволит непосредственно определить величину дозы для конкретного варианта лечения, а также и в процессе проведения терапевтической процедуры. Наличие такого метода позволит перейти от субъективной оценки, основанной на ощущении пациентом тепла, к объективному количественному определению, что повысит эффективность УВЧ-терапии, снизит вероятность повреждения тканей из-за перегрева и сведет к минимуму побочные или «нефизиотерапевтические» эффекты лечения.
Цель работы - разработка метода определения поглощенной энергии ЭП при УВЧ-терапии.
Результаты исследования. Объективная дозиметрия при УВЧ-терапии представлена инструментальными (приборными) и теоретическими (численными) методами. Широкое распространение получили расчетные методы вычислена структуры распределения локальных значений поглощенной энергии ЭП в исследуемом объекте, оставляя в стороне вопрос об общей поглощенной дозе и динамики ее изменения в процессе воздействия [3]. Инструментальные методы при УВЧ-терапии были незаслуженно забыты и применялись преимущественно в экспериментальных исследованиях, а не в клинической практике.
Предлагаемый метод основан на измерениях добротности контура УВЧ-генератора, между пластинами которого с воздушным зазором помещен объект. Исходные параметры параллельного терапевтического контура - индуктивность катушки Ь и емкость С - подобраны так, что на заданной частоте, например, 27,12 МГц обеспечивается резонанс. Изменение емкости конденсатора С приводит к расстройке контура, причем если величина емкости линейно изменяется от минимального до максимального значения, то также изменяется и величина напряжения на нем. При постоянстве частоты УВЧ-генератора и напряжения на контуре, величина максимального амплитудного значения напряжения на контуре пропорциональна его добротности, которая определяется активными потерями в расположенном между пластинами объекте, т.е. величиной поглощенной энергии ЭП.
Устройство для определения поглощенной энергии ЭП УВЧ, схема которого приведена на рис. 1, состоит из измерительной и регистрирующей части. Измерительная часть включает УВЧ генератор, терапевтический контур с конденсаторными пластинами и двигатель. Регистрирующая часть включает предварительный усилитель, фазовый детектор и цифровой датчик угла поворота ротора двигателя и, подключенного к компьютеру, двухканального цифрового осциллографа.
1
В измерительной части терапевтический контур (1), образованный катушкой с индуктивностью Ь и переменным конденсатором с емкостью С, подключен к УВЧ-генератору (2), а непосредственно к самому контуру при помощи фидеров - конденсаторные пластины (3) с расположенным между ними объектом (4). Переменный конденсатор С имеет равномерную (прямоемкостную) шкалу емкости, ротор конденсатора связан с электродвигателем (5), который приводит его в равномерное вращение с постоянной скоростью. В процессе регистрации напряжение с терапевтического контура через предварительный усилитель (6)с высоким входным сопротивлением через фазовый детектор (7)
поступает на один из входов двухканального цифрового осциллографа (8), подключенного к компьютеру (9). На другой вход цифрового осциллографа (8) поступает сигнал с цифрового датчика угла поворота (10), соединенного с ротором электродвигателя (5). При вращении ротора прямоемкостного переменного конденсатора С двигателем, напряжение на контуре изменяется, периодически проходя через максимум, амплитудное значение которого непрерывно измеряется и его максимальное значение в момент резонанса пропорционально добротности контура. Интервал времени, регистрируемый датчиком угла поворота, между положением полностью выведенного ротора конденсатора С и положением максимума резонансной кривой контура пропорционален емкости объекта.
Временные характеристики процесса измерений представлены на рис. 2, где а - характер изменения напряжения на контуре (резонансная кривая контура) при вращении ротора прямоемкостного переменного конденсатора С двигателем, б - резонансная кривая контура с помещенным между конденсаторными пластинами объекте, в - импульс, длительность которого пропорциональна величине емкости объекта, и г - импульсы, передний фронт которых соответствует положению полностью выведенного и введенного ротора конденсатора С.
Эквивалентная электрическая схема тканей тела человека в первом приближении может быть представлена в виде параллельно соединенных электрической проводимости и емкости. При помещении помещения между пластинами конденсатора объекта происходит расстройка контура, изменится его добротность, что приведет к уменьшению напряжения на контуре, которое пропорционально величине активных потерь за счет проводимости. В результате снижения добротности контура уменьшается амплитуда резонансной кривой и увеличивается ее ширина (рис. 2, б). Калибровка устройства производится путем помещения между конденсаторными пластинами терапевтического контура тканеэквивалентных моделей (фантомов) с электрическими параметрами равными соответствующим тканям (мышечной, жировой и т.д.). Затем строится характеристическая кривая, которая является основой для дальнейших вычислений конкретных дозиметрических параметров [4]. С учетом результатов измерений по известным формулам рассчитывается величина активной проводимости, которая эквивалентна потерям энергии ЭП УВЧ в расположенном между пластинами исследуемом объекте для данной частоты. При апробации метода на частоте УВЧ-генератора 27,12 МГц и конденсаторных пластинах диаметром 150 мм поперечно расположенных на уровне середины голени добровольцев-испытуемых были получены следующие величины доз поглощенной энергии ЭП: I - без ощущения тепла (0,24-0,53 Дж/кг), II - с ощущением слабого тепла (0,53-0,72 Дж/кг), и III - с ощущением отчетливого тепла (0,72-0,91 Дж/кг).
Предлагаемый метод может быть использован в аппаратах для УВЧ-терапии, в которых предусмотрена автоматическая (следящего типа) подстройка терапевтического контура в резонанс, как зарубежного, так и отечественного производства, например, УВЧ 50-02, УВЧ 70-01А [1]. Аппаратно-программная реализация метода определения поглощенной энергии ЭП может быть выполнена в виде приставки к любому аппарату для УВЧ-терапии с системой автоматической подстройки контура в резонанс без существенных изменений в его конструкции.
Литература
1. Олейник О.Г. и др. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.- 2003.- № 2.- С. 62-68.
тексте
Статья
2. Скурихина Л.А. // Курортология и физиотерапия: Руководство.- 1985.- Т. 1.- М.- С. 437-452.
3. Samaras T. et al. // Phys. Med. Biol.- 2000.- Vol. 45, № 8.-P. 2233-2246.
4. Кудряшов Ю.Б., Перов С.Ю. // Электромагнитные поля и здоровье человека. Фундаментальные и прикладные исследования.- М., 2002.- С. 138-139.
METHOD OF DEFINITION OF ABSORBED ENERGY OF AN ELECTRICAL FIELD IN UHF THERAPY
S. YU. PEROV
Summary
The method of definition of an absorbed energy of an ultrahigh-frequency electrical field at carrying out of the therapyis described. It is based on modification of a quality factor of therapeutic contour. The device can be carried out as a an adapter to any means for UHF therapy with a system of automatic fine-tuning of the therapeutic contour in a resonance without essential modifications in its design.
Key words: ultrahigh-frequency, therapeutic contour
УДК 577.188.38
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ БОС-ТРЕНИНГА ПО ИЗМЕНЕНИЯМ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В БИОСРЕДАХ
Л.И. КАМЕНЕВ, Н.Ю.КИРКИНА, Е.Н. НАУМОВА, И.В. ПАНОВА, Ю.А. СМИРНОВ, В.М. ШАТАЛИН*
Цель работы - изучение влияния дыхательного тренинга под контролем текущей ЧСС по методу БОС на изменения концентрации микроэлементов (Кмэ) в моче у лиц с бронхообструк-тивным синдромом, в т.ч. профессиональной этиологии; разработка способа оценки эффективности применения БОС-тренинга в реабилитационных программах больных ХОБЛ с использованием биологических маркеров - концентраций микроэлементов (Кмэ) в биосредах (сыворотке крови, моче) [1, 4].
Объект исследования. В МУЗ МСЧ №5 г. Тулы обследовано 30 чел. основной группы (А) - мужчин (ср. возраст - 54,3 года), прошедших десять 20-минутных сеансов БОС-тренинга, с диагнозами хронический пылевой бронхит (ХПБ) профессиональной этиологии и хронический обструктивный бронхит (ХОБ) непрофессиональной этиологии; по 15 чел. в группе. Контроль (В) составили лица с теми же диагнозами, получавшие обшепри-нятый лечебный комплекс (ОЛК); 24 и 20 чел. соответственно.
Методика проведения исследований. Для сеансов дыхательного тренинга под контролем текущей ЧСС с биологической обратной связю (БОС) использовался программно-аппаратный комплекс - тренажер БОС «Дыхание» -коррекционнооздоровительная система, работающая по принципу (БОС).
Концентрация МЭ в моче и сыворотке крови, спирометрические показатели (ОФВ1) определялись в группах А и В три раза: в начале, в середине и по завершении курса
- обострения (1 стадия), затухающего обострения (2) и ремиссии (3 стадия).
Оценка эффективности БОС-тренинга велась по изменениям Кмэ в биосредах. Влияние БОС-тренинга на бронхиальную проходимость оценивалось по ОФВ1 и методом бронхофонографии с использованием КДК «Паттерн». Кмэ в моче определялись методом атомно-абсорбционной (пламенной) спектроскопии на установке «Сатурн-3П-1», функция внешнего дыхания (ФВД) -на аппарате КСП-1 (Россия). В основе работы КДК лежит анализ временных и частотных характеристик спектра дыхательных шумов, возникающих при изменении диаметра воздухоносных путей. В качестве интегрального количественного параметра для оценки динамики заболевания был использован параметр КДК «Паттерн» - работа дыхания. Изображение графика выводили на дисплей. Статобработка велась методом дисперсионного анализа и пакета прикладных программ SPSS for Windows v 6.10 [2].
Количественный анализ содержания МЭ в моче и крови при ХПБ и ХОБ. Анализ полученных данных показал, что на всех стадиях заболевания имелся диапазон колебаний Кмэ в крови и моче. Это может говорить о гетерогенности групп ХПБ и ХОБ. Выявлена достоверная корреляционная зависимость Кмэ от способа лечения (p<0,05): в крови - у больных ХПБ с Cr и Fe в обеих группах, а также Mn и Ni в группе В, у больных ХОБ с Cu, Zn, Cr в обеих группах и Mn в группе А. В моче - при ХПБ достоверная корреляционная зависимость выявлена лишь в группе А с Fe, Mn и Ni, при ХОБ - в группе В с Ni.
Математическая обработка установила, что дыхательный тренинг БОС на 1-й стадии болезни не влияет на изменение концентрации МЭ (а=0,6-0,7), на 2-й и 3-й стадии влияет очень сильно (а = 0,001). Однако разброс значений МЭ в крови и моче на конечных стадиях заболевания в зависимости от способа проводимого лечения сопоставим с Кмэ контроля (табл.1,2).
Степень изменения Кмэ в биосредах коррелировала с выраженностью изменения ОФВ1 (p<0,1), что позволяет прогнозировать течение заболевания по изменениям Кмэ [3]. Выявлена корреляционная зависимость между ФВД и дыхательной аритмией сердца (разностью max и min пульса больного на вдохе и выдохе), отражающая уровень бронхообструкции.
В результате бронхографического исследований на КДК «Паттерн» было установлено, что ХПБ и ХОБ сопровождались преимущественно обструктивными изменениями (85% и 89% соответственно). Обструкция проявляется возникновением специфического акустического феномена - появлением достоверных диагностических признаков на частотах свыше 5000 Гц.
Выводы: 1. Выявлена корреляционная зависимость Кмэ от способа лечения: в крови - у больных ХПБ с Cr и Fe; c ХОБ с Mn, Cu, Zn, Cr; в моче - при ХПБ с Fe, Mn, Cu, Ni; при ХОБ - с Ni, при АБА - с Fe, Mn, с Ni, Zn; при НБА - с Mn, Ni и Zn.
2. Рост амплитуды кривых в обструктивном диагностическом поле паттерна дыхания при проведении фонобронхографии
Корреляционная зависимость Кмэ в у больных с ХОБ
Таблица І
Feg Mng Cug Nig Zng Crg Feu Mnu Cuu Niu Znu Cru
Ккор G,G1 G,36 G,73 G,23 G,8 G,28 G,G5 -G,24 G,15 G,G9 G,159 G,G6
Гр.В 3,82 G,G137 G,3167 G,G837 -2,2б G,G17 1,497 G,G747 -G,497 G,G359 2,2бб G,G46
Гр.А G G,GG99 G,G541 G,GG28 G,89l G,GG64 G,G7 -G,GG4 G,432 G,GG17 G,G5 G,GG5
Корреляционная зависимость Кмэ в у больных с ХПБ
Таблица 2
Feg Mng Cug Nig Zng Crg Feu Mnu Cuu Niu Znu Cru
Ккор G,38 -G,21 -G,G1 G,GG7 -G,G4 -G,42 G,28 -G,5 -G,31 -G,24 G,G61 G,14
Гр.В 1,231 G,4G7 G,61 8 G, 1598 3,741 G,G648 G,792 G,G35 G,124 G,G79 G,39l G,G21
Гр.A G,136 -G,G22 -G,GG1 G,GGG25 -G,G198 -G,GG44 G,G38 -G,GG19 -G,GG4 -G,GG23 G,GG28 G,GG87
Примечание: МЭg - концентрация МЭ в крови, МЭu - концентрация МЭ в моче
сеансов БОС-тренинга, что соответствовало стадиям заболевания
МУЗ МСЧ №5, ГУП НИИ НМТ объединенный с НИЦ медицинского факультета ТулГУ, г. Тула, Россия
на КДК «Паттерн» является достоверным признаком эффективности дыхательного БОС-тренинга под контролем ЧСС.
3. Определение содержания МЭ при заболеваниях органов дыхания рекомендуется для врачебной практике, для чего необходимо создание лабораторий. Выявленные корреляционные
