CC BY
463
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК 619: 616.993.192.5.995.1: 576.893.192.6
Современные лабораторные методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец
Х. Георгиу, доктор биологических наук (chgeorgiou@rambler.ru), В.В. Белименко, кандидат биологических наук (vlad_belimenko@mail.ru)
ГНУ Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) (Москва).
В настоящее время для диагностики анаплазмоза применяют различные методы: микроскопические, серологические и молекулярно-биологические. Решающим в диагнозе является положительный результат микроскопических исследований мазков крови, окрашенных по Романовскому. Наиболее чувствительные методы серологической диагностики — ИФА и РНГА. Для успешной диагностики следует комбинировать различные методы.
Ключевые слова: анаплазмоз, Anaplasma marginale, Anaplasma ovis, крупный рогатый скот, лабораторная диагностика, паразитемия
Сокращения: ДНК—дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА (ELISA) — иммуноферментный анализ (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), МТ—масса тела, ПЦР— полимеразно-цепная реакция, РДП—реакция диффузной преципитации, РДСК — реакция длительного связывания комплемента, РНГА — реакция непрямой гемагглю-тинации, РФ — Российская Федерация, РФА — реакция флуоресцирующих антител, СНГ — Содружество Независимых Государств, ФО — федеральный округ
Анаплазмоз (Anaplasmosis)—трансмиссивное сезонное заболевание крупного рогатого скота и овец, протекающее с признаками анемии, лихорадки и истощения, вызываемая паразитами из рода Anaplasma (Rickettsia). Болеют также дикие жвачные: зебу, буйволы, олени, лоси, косули, антилопы.
Этиология, эпизоотология
У крупного рогатого скота возбудители анаплазмоза — Anaplasma marginale Theiler, 1910 и A. centrale Theiler, 1912, у овец — A. ovis Lestoquard, 1924. Переносчики ана-плазм — кровососущие членистоногие. Перенос анаплазм от больных животных к здоровым возможен также при нарушении ветеринарно-санитарных норм во время проведения ветеринарно-зоотехнических мероприятий (взятие крови одной иглой, биркование и др.). В организме переболевшего крупного рогатого скота анаплазмы сохраняются в течение 13...15 лет, у овец — до 5 лет [8, 10, 15].
Анаплазмозы крупного рогатого скота и овец широко распространены во всем мире: во многих станах Европы и Азии, во всех государствах Африки, Америки и Австралии. В странах СНГ это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья. Особенно значительный экономический ущерб заболевание наносит в тропических и субтропических регионах, где гибель больных животных может достигать 96.100 % [2, 8, 15, 24].
В РФ, согласно ветеринарной отчетности, неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского ФО [9, 10].
Диагностика
При постановке диагноза на анаплазмоз рогатого скота следует учитывать эпизоотическое состояние, сезон, кли-
нические признаки, патоморфологические изменения и результаты микроскопического исследования крови. Решающим в диагнозе является положительный результат микроскопических исследований мазков крови. В настоящее время в лабораторной диагностике анаплазмоза широко используют серологические методы. При проведении научных исследований применяют молекулярно-биологические методы, а также метод биопробы на восприимчивых животных или спленэктомию подозреваемого в анаплазмоносительстве животного [8, 15].
Микроскопический метод. Анаплазмы — это круглые, размером 0,2...1,2 мкм включения в эритроцитах (рис.). Иногда их обнаруживают в лейкоцитах и тромбоцитах. При исследовании мазков крови, окрашенных по Романовскому, обнаруживают круглые включения почти темного цвета. Анаплазмы располагаются в эритроцитах преимущественно на периферии, иногда ближе к центру. В одном эритроците может быть от одного до четырех возбудителей. Паразитемия составляет 3.40 %, в отдельных случаях может достигать 80 % [11, 21].
При электронной микроскопии было установлено, что у анаплазм отсутствуют цитоплазма и ядро. Также были выявлены так называемые инициальные тельца, или микроколонии. Это округлые или овальные образования, покрытые тонкой мембраной. Кроме того, сама микроколония окружена двуслойной плазменной мембраной, содержимое которой имеет вид гранулированной, лентовидной или кольцевидно-трубчатой структуры [21].
Серологические методы. Диагностика анаплазмоза (особенно в начале болезни и при анаплазмоносительстве) зачастую бывает затруднена. Своеобразная мелкая форма возбудителя в виде точки и возможное наличие в эритроцитах здоровых животных различных включений (тельца Жолли и др.) могут приводить к постановке ложных диагнозов.
Именно эти трудности в идентификации анаплазм вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики. Для диагностики анаплазмоза и анаплазмоносительства в лаборатории протозоологии ВИЭВ разработаны и используются серологические методы. Также было выявлено, что А. marginale и А. ovis имеют общие антигены, что позволило изготавливать антиген из возбудителя анаплазмоза овец для серологической диагностики заболевания у животных обоих видов [5, 7, 8].
Георгиу Х, Белименко В.В.
Рис.
Anaplasma marginale в эритроцитах коровы.
Окраска
по Романовскому об. 10, ок. 90
РДСК. Данный метод широко применяют в лабораторной диагностике анаплазмоза. Его недостаток — не всегда удается выявить комплементсвязывающие антитела у анаплазмоносителей, в результате чего анаплазмоз из неблагополучных районов может распространиться в благополучные. Антиген для реакции получают из крови сплен-эктомированных животных, зараженных анаплазмозом. Установлено, что чем выше паразитемия у подопытного животного, тем выше титр получаемого антигена [3.8. 14].
РНГА. Это простой и довольно чувствительный по сравнению с РДСК метод. В России его впервые применил Х. Георгиу при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец, используя антигены, употребляемые в реакции связывания комплимента. Также он провел сравнительную оценку РНГА с другими серологическими реакциями [2, 6, 8].
ИФА. Это высокочувствительный и высокоспецифичный метод (в зарубежной литературе эта реакция получила название ELISA [12, 19]), имеющий ряд преимуществ по сравнению с другими серологическими тестами. В настоящее время в серодиагностике кровепаразитарных заболеваний наибольшее практическое применение получил твердофазный ИФА. Метод основан на использовании иммобилизированных антител (антигенов), что обеспечивает быстрое и эффективное разделение свободного и связавшегося с антителами ферментного конъюгата. В России ИФА тест-систему для диагностики анаплазмоза рогатого скота разработал Х. Георгиу [6, 8, 12].
РДПв агаровом геле. В лабораторной диагностике метод не применяют. Однако его успешно использовали в экспериментальных целях для диагностики анаплазмоза у больного крупного рогатого скота и кроликов, иммунизированных анаплазменным антигеном (А. marginale и А. ovis) [3, 5].
Иммунофлуоресцентные методы. Непрямой метод иммунофлуоресценции (РФА) используют для обнаружения и идентификации возбудителей в крови и во внутренних органах животных и ретроспективной диагностики кровепаразитарных болезней у переболевших ж:ивотных.
Прямой метод иммунофлуоресценции применяют с целью идентификации возбудителей в крови и в мазках-отпечатках из внутренних органов больных ж:ивотных [21].
Молекулярно-биологические методы. При экспериментальных исследованиях достаточно широко применяют
ПЦР с целью идентификации возбудителя A. marginale и A. ovis в крови больных и переболевших животных, а также для индикации возбудителей в иксодовых клещах и насекомых. Кроме того, метод используют для изучения нуклеотидного состава ДНК и молекулярно-биологических свойств и особенностей различных штаммов и изолятов возбудителей [1, 13, 15, 17, 18, 23].
В настоящее время для диагностики анаплазмоза применяют различные методы: микроскопические, серологические и молекулярно-биологические. Решающим в диагнозе является положительный результат микроскопических исследований мазков крови, окрашенных по Романовскому. Наиболее чувствительные методы серологической диагностики — ИФА и РНГА. Для успешной диагностики следует комбинировать различные методы.
Библиография
1. Артюшин, С.К. Нуклеотидный состав и гомологии нуклеотидных последовательностей А. marginale / С.К. Артюшин, А.Д. Забережный, Х. Георгиу, С.Д. Родин, П.Э. Кердзая // Тезисы докладов Всесоюзного семинара-совещания «Опыт выращивания, нагула, откорма и профилактики болезней крупного рогатого скота республик Средней Азии, Закавказья и Казахстана». — Самарканд, 1983. — С. 74-76.
2. Ахмадов, Н.А. Серологические исследования анаплазмоза крупного рогатого скота в Таджикистане / Н.А. Ахмадов, Х. Георгиу, В.В. Белименко, Х.О. Давладов // Доклады ТАСХН. — 2012. — №2. — С. 52-54.
3. Георгиу, Х. Серологическая диагностика анаплазмоза у овец / Х. Георгиу // Сборник научных трудов МВА. — 1980. — Т.116. — С. 72-76.
4. Георгиу, Х. Комплементсвязывающие антитела и паразитемия у овец при анаплазмозе / Х. Георгиу // Труды ВИЭВ. — 1982. — Т. 56. — С. 95-98.
5. Георгиу, Х. Серологическая диагностика анаплазмоза рогатого скота / Х. Георгиу, Н.А. Казаков, С.Д. Родин // Труды ВИЭВ. — 1983. — Т. 57. — С. 35-42
6. Георгиу, Х. Диагностическая ценность ИФА и РНГА при анаплазмозе / Х. Георгиу // Тезисы докладов и сообщений IV Съезда ВОПР, 1987. — С. 125-126.
7. Георгиу, Х. Серологические реакции для диагностики анаплазмоза / Х. Георгиу, Н.И. Степанова // Ветеринария. — 1987. — №5. — С. 43-45.
8. Георгиу Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей / Х. Георгиу: автореф. дис. ... док. биол. наук: — М., 1997. — 56 с.
9. Гулюкин, М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) / М.И. Гулюкин, В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко // РВЖ.СХЖ. — 2013. — №2. — С. 36-40.
10. Заблоцкий, В.Т. Профилактика кровепаразитарных болезней домашних животных / В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко // Веткорм. — 2013. — № 4. — С. 38-40.
11. Корниенко-Конева, З.П. Анаплазмоз крупного рогатого скота / З.П. Корниенко-Конева // Труды ВИЭВ. — 1957. — Т. 21 — С.112-121.
12. Степанова, Н.И. Иммуноферментный анализ (ELISA) при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец / Н.И. Степанова, Х. Георгиу // Тезисы докладов Всесоюзного семинара-совещания «Опыт выращивания, нагула, откорма и профилактики болезней крупного рогатого скота республик Средней Азии, Закавказья и Казахстана». — Самарканд, 1983. — С. 71-73.
13. Aubry P. Sensitivity and Specificity of a Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Relative to Quantitative Reverse Transcriptase PCR for Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum / P. Aubry, J. Pare // J Clin Microbiol. — 2012 August. — V. 50. — N. 8. — P. 28-38.
14. Bradway, D.S. Sensivity and specifity of the complement fixation test for detecnion of cattle persistently infected with Anaplasma marginale / D.S. Bradway, S. Torioni de Echaide, D.P. Knowles, S.G. Hennager, T.F. McElwain // J. Veter. Diagnostic Investig. — 2001 — V. 13. — N. 1. — P. 79-81.
15. Fernandez, P.J. Atlas of transboundary animal diseases / P.J. Fernandez, W.R. White. — OIE, 2010.
16. de la Fuente, J. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae) / J. de la Fuente, R.A. Van den Bussche, K.M. Kocan // Vet. Parasitol. — 2001. — V. 97. — P. 65-76.
17. de la Fuente, J. Genetic characterization of Anaplasma ovis strains from bighorn sheep in Montana / J. de la Fuente, M.W. Atkinson, J.T. Hogg, D.S. Miller, V. Naranjo, C. Almazan, N. Anderson, K.M. Kocan // J Wildl Ds.—2006 Apr.—V. 42.—N. 2.—P. 381-385.
18. Goff, W.L. Comparison of a DNA probe, complement-fixation and indirect immunofluorescence tests for diagnosing Anaplasma marginale in suspected carrier cattle / W.L. Goff, D. Stiller, R.A. Roeder // Vet. Microbiol.—1990.—V. 24.—P. 381-390.
19. Montenegro-James, S. Use of the dot enzyme-linked immunosorbent assay with isolated Anaplasma marginale initial bodies for serodiagnosis of anaplasmosis in cattle / S. Montenegro-James, A.T. Guillen, S.-J. Ma // Am. J. Vet. Res. — 1990. — V. 51. — N. 10. — р. 1518-1521.
20. Reinbold, J.B. Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in bovine peripheral blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay / J.B. Reinbold, J.F. Coetzee, K.R. Sirigireddy, R.R. Ganta // J. Clin. Microbiol. — 2010. — N. 48. — P. 2424-2432.
21. Ristic, M. Morphological and serological characteristic of Anaplasma marginale as observed by electron microscopy and fluorescent labeled antibody techniques /M. Ristic, W.R. Pritchard // Proc. XVIth Intern. Vet. Congr.—1959.—V. 11.—P. 555-556.
22. Scott, W.L. Electron microscopy of Anaplasma marginale in bovine erythrocyte / W.L. Scott, J.C. Geer, L.E. Foote // Am. J. Vet. Res. — 1961. — v. XXII. — N. 90. — P. 877-881.
23. Torina, A. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale / A. Torina, A. Agnone, V. Blanda, A. Alongi, R. DAgostino, S. Caracappa, A.M. Marino, V. Di Marco, J. de la Fuente // Ticks Tick Borne Dis. — 2012. — V. 3. — N. 5-6. — P. 283-287.
24. de Wall, D.T. Anaplasmosis control and diagnosis in South Africa / D.T.Wall de // Ann N Y Acad Sci. — 2000. — N. 916. — P. 474-483.
SUMMARY
Ch. Georgiou, V.V. Belimenko
All-Russian research Institute of experimental veterinary medicine by name Ya.R. Kovalenko (VIEV) (Moscow).
Modern Laboratory Detection Methods of Anaplasmosis of Cattle and Sheeps. The diagnosis of anaplasmosis of cattle and sheeps is an important tool to control and prevent the dissemination of the disease. Identification of the parasite in mammalian can be used for direct diagnosis purposes. During the acute stage of the disease the number of parasites inside the erythrocytes increases in such a way that they can be detected microscopically. However, in chronically infected animals where a subclinical form of the disease occurs, this method is useless and other, more sophisticated methods (e.g. CFT IHAT, ELISA and Molecular Methods) should be employed.
