CC BY
111
2015/4
РССС'Я’ЯСК'Я'Я !ИтаЗ*ЯтаяетМЧ5Иига ЖУИИЯ
зззггалм jmsBMai -Г рдзмзтаютт
БИОХИМИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ДИАГНОСТИКА
Поступила в редакцию16.10.2015 Принята в печать 24.11.2015
УДК 619.616.993.192.6 DOI: 10.12737/16663
Самуйленко А.Я.1, Гулюкин М.И.2, Василевич Ф.И.3, Ковальчук С.Н.4, Глазко Т.Т.4-, Бабий А.В.4, Архипов А.В.4, Косовский ГЮ.4. ДНК-диагностика анаплазмоза крупного рогатого скота. // Российский паразитологический журнал. - М., 2015. - Вып. 4. - С. 72-78.
ДНК-ДИАГНОСТИКА АНАПЛАЗМОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Самуйленко А.я.1, Гулюкин М.И.2, Василевич Ф.И.3, Ковальчук С.Н.4, Глазко Т.Т.4,5, Бабий А.В.4, Архипов А.В.4, Косовский Г.ю.4
'Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ФГБНУ ВНИТИБП), 141142, Московская область, Щелковский р-н, пос. Биокомбината
"Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р Коваленко (ФГБНУ ВИЭВ), 109428, Москва, Рязанский проспект, к. 1, д. 24
3Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23
4Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий (ФГБНУ ЦЭЭРБ), 127422, Москва, ул. Костякова, д. 12, стр. 4, e-mail: info-ceerb@mail.ru
реферат
Цель исследования - разработка метода ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.
Материалы и методы. Пробы крови отбирали из хвостовой вены с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M. Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам Anaplasma marginale. Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера ClustalW2. Видоспецифичность праймеров проверяли с использованием алгоритма BLASTN. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в течение 40 минут при напряженности поля 5 В/см. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены, лигированы и клонированы в клетках E. coli. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5a, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 °С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера и генетического анализатора Applied Biosystems 3130.
Результаты и обсуждение. Описаны разработка и апробация праймеров к гену msp4 Anaplasma marginale для ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота методом ПЦР Чувствительность ПЦР с использованием этих праймеров позволяет выявить 100 и больше копий гена. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода.
Ключевые слова: Anaplasma marginale, крупный рогатый скот, диагностика, ПЦР
Введение
Анаплазмоз крупного рогатого скота (КРС) - трансмиссивное инфекционное заболевание, вызываемое риккетсиями рода Anaplasma (отряд Riсkettsiales, семейство Anaplasmatacеa). Анаплазмоз КРС широко распространен во всем мире и приводит к значи-
Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина 117218, Россия, г Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28, e-mail: Journal@vniigis.ru © «Российский паразитологический журнал»
72
233SSK53 JBB3MS1 ВТ РДЗЙ£ЗТВ1ВЕ1!Г
тельным экономическим потерям вследствие уменьшения мясо-молочной продуктивности скота, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных. Основным возбудителем анаплазмоза у КРС являются риккетсии Anaplasma. А. marginale - облигатный внутриклеточный паразит, поражающий эритроциты. Источником возбудителя являются инфицированные и больные животные, переносчиками - около 20 видов клещей, а также кровососущие насекомые. Возможна механическая передача возбудителей от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении обезроживания, кастрации, вакцинации, при взятии крови и других зоотехнических мероприятий [1, 5, 10].
Анаплазмоз КРС, вызванный A. marginale, зарегистрирован во многих тропических и субтропических странах. Он распространен фактически по всей территории США и Канады, в некоторых странах Европы. Анаплазмоз КРС является эндемичным для Мексики, Центральной и Южной Америки, Карибских островов, Африки и Азии. В Европе А. marginale встречается главным образом в Средиземноморских странах [7]. Это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья [2].
Согласно ветеринарной отчетности в РФ неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского ФО [4].
На сегодняшний день для диагностики анаплазмоза применяют микроскопические и серологические методы исследования, однако их чувствительность и специфичность недостаточно высоки. Результаты микроскопических исследований мазков крови ненадежны на ранних стадиях инфицирования и в случаях заболеваний, сопровождающихся тяжелой формой анемии [12]. Серологические методы, основанные на использовании антител к антигенам возбудителя анаплазмоза, имеют недостаточно высокую чувствительность [13] и не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм [14, 16]. Наиболее оперативную и точную диагностическую информацию позволяет получить выявление ДНК возбудителей анаплазмоза в крови КРС с помощью полимеразной цепной реакции. Преимуществом ПЦР-диагностики является высокая чувствительность и специфичность - она позволяет обнаружить возбудителя на самых ранних стадиях заболевания, в том числе и во время латентной стадии, и надежно дифференцировать анаплазмоз от ряда сходных по клиническим проявлениям заболеваний.
Целью настоящих исследований была разработка способа выявления ДНК A. marginale в периферической крови крупного рогатого скота методом ПЦР
Выделение ДНК. Пробы крови отбирали из хвостовой вены стерильными катетерами с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя.
Конструирование праймеров для ПЦР. Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам A. marginale доступные в базе данных GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера dustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Видоспецифичность праймеров была проверена с использованием алгоритма BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi). Визуализацию результатов проводили с помощью программы GeneDoc.
проведение пцр. Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси для ПЦР, содержащей 1*буфер для амплификации, 1 а. е. HS Таq ДНК-полимеразы (Евроген, Россия), 200 мкМ нуклеозидтрифосфатов, 0,2 мкМ праймера MSP4-F: 5'- AAGGGGGAGTAATGGGAGGTA -3', 0,2 мкМ праймера MSP4-R: 5'-GGCACACTCACATCAATC -3', 3 мкл ДНК. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация в течение 3 мин при 95 °С; 45 циклов (15 с при 95 °С, 15 с при 58 °С, 15 с при 72 °С); финальная элонгация при 72 °С в течение 3 мин. ПЦР проводили в термоциклерах LightCycler 96 System (Roche, Швейцария) и Nyx Technik Amplitronyx 6 (США).
электрофорез. Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в 1xTAE буфере, содержащем раствор бромистого эти-дия в концентрации 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводили в течение 40 мин при напряжен-
All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin 117218, Russia, Moscow, Bolshaya Cheremushkinskaya str., 28 © Russian Journal of Parasitology
Материалы и методы
73
ТОВВМЯетаяЯ татаЗ*ЯтаяетМЧ5та«1$ ЖУИИЯ 2015/4
зззггалм jmsBMai -Г рдзмзтаютт
ности поля 5 В/см. Визуализацию результатов проводили с помощью трансиллюминатора ECX-F20.M (Vilber Lourmat, Франция).
Получение контрольной плазмиды pGEM-msp4. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit (Life technologies, USA), лигированы в вектор pGEM-T (Promega, США) и клонированы в клетках E. coli DH5a. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5a, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 °С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора GeneJET Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, США), оценку концентрации плазмидной ДНК - с помощью набора PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием флуориметра QuantiFluor-ST (Promega, США).
Секвенирование. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера с использованием набора ABI Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям изготовителя и генетического анализатора Applied Biosystems 3130 (Life Technologies, США).
Результаты и обсуждение
Своевременная диагностика играет решающую роль в предотвращении распространения инфекционных заболеваний. ПЦР является широко используемым методом диагностики инфекционных заболеваний благодаря его высокой чувствительности, специфичности, воспроизводимости и относительной быстроте проведения анализа. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (OIE, the World Organisation for Animal Health), изложенным в «Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных 2015 г.» (http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/), ПЦР-диагностику A. marginale следует применять перед каждым перемещением животного на новое место и для подтверждения диагноза. На сегодняшний день описаны разные методы ПЦР для детекции A. marginale [6, 8, 9, 11, 15], однако ни один из них не прошел полную валидацию.
В данном исследовании были разработаны праймеры для амплификации фрагмента гена msp4 методом ПЦР с целью выявления А. marginale в крови КРС. Msp4 является иммунодоминантным белком наружной мембраны [7]. С целью подбора праймеров для msp4-ПЦР были проанализированы имеющиеся в международной базе данных Генбанк последовательности гена msp4 А. marginale. Сравнительный анализ последовательностей msp4 показал высокую степень их идентичности - 98-100 %. Прямой и обратный праймеры были подобраны на участки гена msp4, имеющие идентичность 100 % у всех известных изолятов А. marginale.
Видоспецифичность праймеров MSP4-F и MSP4-R была проверена in silico путем сравнения их последовательностей с геномными библиотеками с использованием программы BLASTN. В результате 100 % покрытия и идентичности последовательностей праймеров было получено со всеми последовательностями гена msp4 A. marginale, имеющимися в базе данных Генбанк. Полная комплементарность праймеров к участкам генома каких-либо нецелевых организмов не выявлена.
Подобранные праймеры MSP4-F и MSP4-R были использованы для проведения ПЦР, в которой в качестве матрицы использовалась ДНК коровы, инфицированной A. marginale по результатам проведенного нами ранее пиросеквенирования фрагментов генома голштини-зированного скота [3]. В результате ПЦР был получен фрагмент ДНК длиной 157 п. н. Для подтверждения амплификации фрагмента целевого гена полученный фрагмент ДНК был лигирован в вектор pGEM-T (Promega, США) и клонирован в клетках E. coli DH5a. Выделенные плазмиды были секвенированы по методу Сэнгера. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLAST показал, что они имеют 99-100 % идентичности с фрагментом гена msp4 разных изолятов A. marginale.
“S________________________________ _________________________________________________________
Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина 117218, Россия, г Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28, e-mail: Journal@vniigis.ru © «Российский паразитологический журнал»
74
233SSK53 JBB3MS1 ВТ РДЗЙ£ЗТВ1ВЕ1!Г
2от5/о
Для испытания аналитической специфичности праймеров использовали образцы ДНК КР°,соде рмащие ДНК бактерий-симбионтов hj^it пваогенов - Sanguibacter keddieii, Propionibactoriumocnes, Pseudom5nas ток/д/пкиа, CtenotropTemonKS nnanophilie, ооткже образио|ДНсонт ц.заражовных риккетсиими Ж. оп'в. Асссоз рсвплстатрвМТ(П автысок электп офорзиаот%-нопагарознам (елепоказал отсутствие характерного для A. marginale фрагмента ДНК длиной 157 п. н., что свидетельствует об аналитической специфичности ПЦР с прайме°ами Мое4-^см^в^Р4-^.
Для оясеааотния аоаотснсдс^^сВйсс^птсмаы^стр^ r^L^P -ылапб1покзсой серия дцсоти-кратныкрасвединий влсзкопы! pG6 М-тор4,сддержащей фрагмени гена ssp4 кмивзй 1сс п. н., ы пносч^ва1^^|^г^гоа13^П^ерсдсн КО.^пт0 кдпиН ваза тгрК. М вез ульитте чувствинддь-ность ПЦР позволила выявить 100 копий гена msp4 и выше (рис. 1).
Для опредоаенис совсосоевю спин кooя-5итвc1вимo снт о^со.^^н.^^з5., сод е5жсд^4т 102-107 калий гататзр4, иылипвоанрлдоивосorыишaствпкhтcpбoстяx. Пси испытакои воспрокпсооквснки вм^г^освикт-ся вриводипвяь с^отнь^14вотезиаг^1^с^об^ив осзныв овис на разeсlcбмпeификaтuвae■ котоультатс воозстнсвнкпмоствк гloзaoикоaзсть мкнсдоао-ставила 100 %.
Рис. К. Меввльтигамп2ифиотс-и взбб копий(1-3),100 копий (4-6), 1К коп ий(7^с)п ояо^иггтн-^^) плазмиды pGEM-msp4 (M - маркер молекулярного веса MWM-100RL)
Раз^боосииый навк моcoдитlзвлaскя в. ткгокн.е былопроКнтовас нсс^Кнкз1^в^о ДНн, выдектысойнс ценипойфоис кк ром nтcйaдcвaзик пк овакисс корех сoв^ндnoстяx.B ка -чествс тпseиeкнaгa постро^в^^нвго ноппсосн, позвoмядрвso окенитвl<стneкскнстn посто-новки реакции и отсутствие ингибиторов, использовали плазмиду pGEM-msp4. В качестве отрицатысоногс rosoвoотcnпoмтзквaли c0pкnац.пeтoдepжaщaй ДI-ll<,ncоyлитсты зссос-довавиоnorarнны ва рскртке и.
Рис. 2. Результат амплификации ДНК, выделенной из цельной крови инфицированных (1-3) и неинфицированных (4)животных, спомощью праймеров MSP4-FH МSP4°^:
«К+» - положительный контроль; «К-» - отпицатллыный коотпооь, IS о мпркер молек—»рh-й spcaci
Заслюч ение
Таким образом, нами разработан и апробирован метод ДНК-диагностики анаплазмоза
__________________________________________________________________________________
All-Russian Scientific Research Instituteof Fuxdamental nadSpplied Oarasitx I opy of AAma^^ aa) PXn(s ппАеИаСег K.l. SkoaPin 117218, Russia, Moscow, Bolshaya Cheremushkinskaya str., 28 © Russian Journal of Parasitology
75
2015/4
РССС'Я’ЯСК'Я'Я !ИтаЗ*ЯтаяетМЧ5Иига ЖУИИЯ
зззггалм jmsBMai -Г рдзмзтаютт
крупного рогатого скота. Чувствительность метода позволяет выявить 100 копий гена msp4 A. marginale и выше. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода.
Литература
1. Василевич Ф.И., Белименко В.В., Гулюкин М.И., Георгиу Х. Практическое руководство по борьбе с кровепаразитарными болезнями домашних животных. - Москва: ЗооВетКнига, 2015. - 86 с.
2. Георгиу Х., Белименко В.В. Современные лабораторные методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец // РВЖ. СХЖ. - 2014. - № 3. - С. 31-32.
3. Глазко В.И., Косовский Г.Ю., Ковальчук С.Н. и др. Инвертированный повтор микросателлита (AGC)6G фланкирует районы ДНК с участками гомологии к ретротранспозонам в геноме крупного рогатого скота // Инновационные технологии в медицине. - 2014. - № 2, Т 3. - С. 63-79.
4. Гулюкин М.И., Заблоцкий В.Т., Белименко В.В. Мониторинг эпизоотической ситуации по про-тозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) // РВЖ. СХЖ. - 2013. - № 2. - С. 36-40.
5. Гулюкин М.И., Заблоцкий В.Т., Белименко В.В. и др. Кровепаразитарные болезни домашних животных (Атлас). - Москва: ЗооВетКнига, 2013. - 86 с.
6. Carelli G., Decaro N., Lorusso A. et al. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR // Vet. Microbiol. - 2007. - Vol. 124. - P. 107-114.
7. de la Fuente J., Lew A., Lutz H. et al.Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development // Anim. Health Res. Rev. - 2005. - Vol. 6. - P. 75-89.
8. de la Fuente J., Van Den Bussche R. A., Kocan K. M. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae) // Vet Parasitol. - 2001. - Vol. 97. - P. 65-76.
9. Fyumagwa R. D., Simmler P., Meli M. L. et al. Prevalence of Anaplasma marginale in different tick species from Ngorongoro Crater, Tanzania // Vet Parasitol. - 2009. - Vol. 161, № 1-2. - P. 154-157.
10. Kocan K.M., de la Fuente J., Blouin E. F. et al. The natural history of Anaplasma marginale // Vet. Parasitol. - 2010. - Vol. 167. - P. 95-107.
11. Potgieter F.T., Stoltsz W. H. Anaplasmosis // Infectious Diseases of Livestock With Special Reference to Southern Africa. - 1994. - P. 408-430.
12. Reinbold J.B., Coetzee J.F., Sirigireddy K.R., Ganta R.R. Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in Bovine Peripheral Blood Samples by Duplex Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay // Journal of clinical microbiology. - 2010. - Vol. 48, № 7. - P. 2424-2432.
13. Strik N.I., Alleman A.R., Barbet A.F. et al. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale // Clin. Vaccine Immunol. - 2007. -Vol. 14. - P. 262-268.
14. Torina A., Agnone A., Blanda V. et al. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale // Ticks Tick Borne Dis. - 2012. - Vol. 3, № 5-6. - P. 283-287.
15. 16.Visser E.S., McGuire T.C., Palmer G.H. et al. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19-kilodalton protein conserved in all recognized Anaplasma species // Infect Immun. - 1992. - Vol. 60, №
12. - P. 5139-5144.
References
1. Vasilevich F.I., Belimenko V.V., Gulyukin M.I., Georgiu Kh. Prakticheskoe rukovodstvo po bor’be s kroveparazitarnymi boleznyami domashnikh zhivotnykh [A practical guide on struggle against blood parasitic diseases of domestic animals]. Moscow, ZooVetKniga, 2015. 86 p.
2. Georgiu Kh., Belimenko V.V. Modern laboratory methods of diagnostics of cattle anaplasmosis. RVZh. SkhZh. [Russian Veterinary Journal], 2014, no. 3, pp. 31-32. (in Russian)
3. Glazko V.I., Kosovsky G. Yu., Kovalchuk S. N. et al. Inverted repeat of microsatellite (AGC) 6G flanks the regions of DNA homologous to retrotransposons in the cattle genome. Innovatsionnye tekhnologii v meditsine [Innovative technologies in medicine], 2014, vol. 2, I. 3, pp. 63-79 (in Russian).
4. Gulyukin M.I., Zablotskiy V.T., Belimenko V.V. Monitoring of epizootic situation on protozoan blood parasitic diseases of domestic animals in Russian Federation (2007-2012). RVZh. SkhZh. [Russian Veterinary Journal], 2013, no. 2. - pp. 36-40. (in Russian)
5. Gulyukin M.I., Zablotskiy V.T., Belimenko V.V. et al. Kroveparazitarnye bolezni domashnikh zhivotnykh (Atlas) [Blood parasitic diseases of domestic animals (Atlas)]. Moscow, ZooVetKniga, 2013. 86 p.
6. Carelli G., Decaro N., Lorusso A. et al. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR. Vet. Microbiol., 2007, vol. 124, pp. 107-114.
~S__________________________________ _____________________________________________________________
Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина 117218, Россия, г Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28, e-mail: Journal@vniigis.ru © «Российский паразитологический журнал»
76
233SSK53 JBB3MS1 ВТ РДЗЙ£ЗТВ1ВЕ1!Г
7. de la Fuente J., Lew A., Lutz H. et al. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development. Anim. Health Res. Rev., 2005, vol. 6, pp. 75-89.
8. de la Fuente J., Van Den Bussche R. A., Kocan K. M. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae). Vet. Parasitol., 2001, Vol. 97, P. 65-76.
9. Fyumagwa R. D., Simmler P., Meli M. L. et al. Prevalence of Anaplasma marginale in different tick species from Ngorongoro Crater, Tanzania Vet. Parasitol., 2009, vol. 161, I. no.1-2, pp. 154-157.
10. Kocan K.M., de la Fuente J., Blouin E. F. et al. The natural history of Anaplasma marginale. Vet. Parasitol, 2010, vol. 167, pp. 95-107.
11. Picoloto G., Lima R. F., Olegario L. A. et al. Real-time polymerase chain reaction to diagnose Anaplasma marginale in cattle and deer (Ozotoceros bezoarticus leucogaster) of the Brazilian Pantanal. Rev. Bras. Parasitol. Vet, 2010, vol. 19, pp. 186-188.
12. Potgieter F.T., Stoltsz W. H. Anaplasmosis. Infectious Diseases of Livestock with Special Reference to Southern Africa, 1994, pp. 408-430.
13. Reinbold J.B., Coetzee J.F., Sirigireddy K.R., Ganta R.R. Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in Bovine Peripheral Blood Samples by Duplex Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay. Journal of clinical microbiology, 2010, vol. 48, I. 7, pp. 2424-2432.
14. Strik N.I., Alleman A.R., Barbet A.F. et al. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale. Clin. Vaccine Immunol, 2007, vol. 14, pp. 262-268.
15. Torina A., Agnone A., Blanda V. et al. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale. Ticks Tick Borne Dis. 2012, vol. 3, I. 5-6, pp. 283-287.
16. Visser E.S., McGuire T.C., Palmer G.H. et al. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19-kilodalton protein conserved in all recognized Anaplasma species. Infect Immun., 1992, vol. 60., I. 12, pp. 5139-5144.
Russian Journal of Parasitology
UDC 619.616.993.192.6 DOI: 10.12737/16663 Article history:
Received 16.10.2015 Accepted 24.11.2015
Samuylenko A.Ya1, Gulyukin M.I.2, Vasilevich F.I.3, Koval’chuk S.N.4, Glazko T T4,5, BabiyA.V4 Arhipov A.V.4, Kosovski G.Yu.4 DNA diagnostics of anaplasmosis in cattle, Russian Journal of Parasitology, 2015, V. 4, P 72-78.
Samuylenko A.Ya1 , Gulyukin M.I.2, Vasilevich F.I.3, Koval'chuk S.N.4, Glazko T.T. 4,5 Babiy A.V.4 Arhipov A.V.4, Kosovski G.Yu.4
1 All-Russia Research and Technology Institute of Biological Industry, 141142 Moscow region, Shchelkovsky district, village of Biocombinat
2 All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Kovalenko Ya. R., 109428, Moscow, 24-1 Ryasansky Ave.
3Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin, 109472, Moscow, 23 Academician Skryabin St.
4FSBI Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnology, 127422, Moscow, 12 - 4, Kostyakov St., e-mail: info-ceerb@mail.ru
All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin 117218, Russia, Moscow, Bolshaya Cheremushkinskaya str., 28 © Russian Journal of Parasitology
DNA DIAGNOSTICS OF ANAPLASMOSIS IN CATTLE
77
2015/4
РССС'Я’ЯСК'Я'Я !ИтаЗ*ЯтаяетМЧ5Иига ЖУИИЯ
зззггалм jmsBMai -Г рдзмзтаютт
Abstract
Objective of research: The purpose of our research was to develop a DNA diagnostic method for anaplasmosis in cattle.
Materials and methods: Blood samples were obtained from the tail vein with the use of ethylenediaminetetraacetic acid as an anticoagulant. The extraction of DNA was performed with the kit Sorb-M. To analyze the gene msp4 the following sequences belonging to different isolates Anaplasma marginale were used. To select primers the conserved elements of sequences were detected with the server dustalW2. The specificity of primers was checked by a BLASTN search. The results of polymerase chain reaction (PCR) were estimated using 2% agarose gel electrophoresis. Electrophoresis was performed within 40 minutes at the field intensity 5 V/cm. Fragments of gene msp4 obtained as a results of polymerase chain reaction (PCR) were purified, ligated and cloned in E. coli cells. Transformation was performed using the heat shock method. Search for E. coli colonies containing pGEM-msp4 plasmid was conducted by the PCR method using standard M13 primers with the following analysis of PCR results by electrophoresis.
Target colonies of E. coli were cultured overnight at 37 °С in 2 ml LB medium containing ampicillin in a 100 mcg /ml concentration. Sequencing of received plasmids pGEM-msp4 was carried out by Sanger method and the genetic analyzer Applied Biosystems 3130.
Results and discussion: Development and approbation of primers on the basis of the MSP4 gene of Anaplasma marginale to perform DNA diagnostics of anaplasmosis in cattle by PCR method were described. Due to PCR sensitivity along with the use of primers, it is possible to identify 100 and more gene copies. The conducted experiments confirm the 100% repeatability and reproducibility of the present method.
Keywords: Anaplasma marginale, cattle, diagnostics, PCR.
© 2015 The Authors. Published by All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin. This is an open access article under the Agreement of 02.07.2014 (Russian Science Citation Index (RSCI) http://elibrary.ru/projects/citation/cit_index.asp) and the Agreement of 12.06.2014 (CABI.org / Human Sciences section: http://www.cabi.org/Uploads/CABI/publishing/fulltext-products/cabi-fulltext-material-from-journals-by-subject-area.pdf)
