CC BY
38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ п аразитология ♦
УДК 619: 616.993.192.6: 616.078
Анаплазменные положительные и отрицательные сыворотки
Х. Георгиу, доктор биологических наук (Chgeorgiou@rambler.ru).
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» Федерального агентства по научным организациям Российской Федерации (ФГБНУ ВИЭВ) (Москва).
Приведены результаты получения анаплазменныхположительных и отрицательных сывороток крови для серологических реакций (РДСК, РНГА и ИФА). Кровь от паразитоносителей и иммунизированных анаплазменными антигенами кроликов можно использовать для приготовления положительной сыворотки для диагностических исследований. При этом титр антител должен быть не ниже 1:20 в РДСК, 1:200 в РНГА и в ИФА. Для приготовления отрицательных сывороток можно использовать только кровь от здоровых животных, отрицательно реагирующих в серологических реакциях с анаплазменным антигеном.
Ключевые слова: анаплазмоз, ИФА, крупный рогатый скот, овцы, протозойные болезни, РДСК, РНГА Сокращения: ИФА (ELISA) — иммуноферментный анализ (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), КРС — крупный рогатый скот, МЕМ — международная единица мутности, МТ — масса тела, РДСК — реакция длительного связывания комплемента, РНГА — реакция непрямой гемагглютинации, ФО — федеральный округ
Введение
Анаплазмоз (Anaplasmosis) — трансмиссивное сезонное заболевание КРС и овец, протекающее с симптомами анемии, лихорадки и истощения, вызываемая паразитами из рода Anaplasma (Rickettsia). Болеют также дикие жвачные: зебу, буйволы, олени, лоси, косули, антилопы.
Анаплазмозы КРС и овец широко распространены во всем мире. В странах СНГ это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья. Особенно значительный экономический ущерб заболевание наносит в тропических и субтропических регионах, где гибель больных животных может достигать 96...100 % [1, 2]. В РФ, согласно ветеринарной отчетности, неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского ФО [9, 10].
У КРС возбудители анаплазмоза—Anaplasma marginale Theiler, 1910 и A. centrale Theiler, 1912, у овец — A. ovis Lestoquard, 1924. Переносчики анаплазм — кровососущие членистоногие. Анаплазмоз передается от больных животных к здоровым, кроме того, перенос возбудителя возможен при нарушении ветеринарно-санитарных норм во время проведения ветеринарно-зоотехнических мероприятий (взятие крови одной иглой, биркование и др.). В организме переболевшего КРС анаплазмы сохраняются в течение 13.15 лет, у овец — до 5 лет [1, 10].
При постановке диагноза на анаплазмоз рогатого скота следует учитывать эпизоотическое состояние, сезон года, клинические признаки, патоморфологические изменения и результаты микроскопического исследования крови. Решающим в диагнозе является положительный результат микроскопических исследований мазков крови. В настоящее время в лабораторной диагностике анаплазмоза широко используют серологические методы. При проведении научных исследований также применяют мо-лекулярно-биологические методы, а также метод биопро-
бы на восприимчивых животных или спленэктомию подозреваемого в анаплазмоносительстве животного [1, 12].
Из вышеописанного видно, что проблема диагностики анаплазмоза рогатого скота сохраняет свою актуальность.
Цель исследований
Выявить возможность получения сывороток от рогатого скота: положительных — от животных-паразитоно-сителей и от иммунизированных анаплазменными антигенами кроликов; отрицательных — от животных, отрицательно реагирующих на анаплазмоз.
Материалы и методы
В качестве анаплазменного антигена использовали ранее приготовленный (Х. Георгиу 1997) [1].
Отрицательную сыворотку получили от КРС и овец (n=30), отрицательно реагирующих на анаплазменный антиген в РДСК,РНГА и ИФА.
Положительную сыворотку получили от КРС и овец (n=30), положительно реагировавших в РДСК на анаплазменный антиген, и от кроликов, иммунизированных анаплазменным антигенами.
Использовали беспородных кроликов в возрасте 6.7 месяцев, МТ 2,5.3,0 кг.
В первом опыте животных разделили на две группы. В первой группе (n=3) кроликам ввели внутримышечно анаплазменный антиген в рабочем разведении (содержащий 10 МЕМ). Кролики второй группы (n=2) служили контролем.
Второй опыт ставили, чтобы уточнить результаты, полученные в первом опыте. Кроликов (n=6) разделили на две равные группы. Первой группе ввели антиген в рабочем разведении. Вторая группа служила контролем.
Чтобы определить общность антител в сыворотках крови кроликов, которым ввели приготовленные нами анаплазменные антигены A. marginale и A. ovis, ставили третий опыт. Животных разделили на три группы. Кроликам 1-й группы (n=3) ввели внутримышечно антиген A. marginale в рабочем разведении, кроликам 2-й группы (n=3) — антиген A. ovis в рабочем разведении. Кролики 3-й группы (n=2) служили контролем.
РДСК ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента», утвержденного ГУВ Госагропрома
Анаплазменные положительные и отрицательные сыворотки
1. Результаты титрования позитивных и негативных сывороток крови КРС (1) и овец (2) с анаплазменным антигеном
Титры положительных сывороток РДСК РНГА ИФА
Титры отрицательных сывороток РДСК РНГА ИФА
1 1:20 :200 1:400 - - -
2 1:40 :800 1:800 - - -
2. Титры антител у кроликов, иммунизированных анаплазменным антигеном (первый опыт), и контрольных
Первая группа кроликов Вторая группа кроликов (контроль)
Кролик РДСК РНГА ИФА К ролик РДСК РНГА ИФА
1-й 1:20 1:400 1:400 1-й - - -
2-й 1:80 1:1600 1:1600 Г
3-й 1:40 1:800 1:800 L 2-й
3. Титр антител у кроликов, иммунизированных анаплазменным антигеном (второй опыт), и контрольных
Первая группа кроликов Вторая группа кроликов (контроль)
Кролик РДСК РНГА ИФА К ролик РДСК РНГА ИФА
1-й 1:40 1:800 1:800 1-й - - -
2-й 1:40 1:800 1:800 2-й - - -
3-й 1:160 1: 3200 1:3200 3-й - - -
СССР 6 мая 1988 года [1, 3, 4, 5, 7]; РНГА ставили согласно «Методическим наставлениям по диагностике ба-безиоза рогатого скота с применением экзоантигенов в РНГА» (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.06.2010 г. [1, 2]; ИФА ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики нутталлиоза лошадей в ИФА», одобренному Главным управлением ветеринарии 01.12.1989 г. [1, 9].
Сублимационное высушивание приготовленных серий позитивных и негативных сывороток проводили в ВГНГИ без защитной среды.
Лиофилизированные позитивные и негативные сыворотки хранили в бытовом холодильнике (при 4 оС).
Результаты
Для получения положительной сыворотки крови от КРС и овец, положительно реагирующих на анаплазмоз, использовали кровь от 30 животных-паразитоносителей из разных районов Российской Федерации. Позитивные серии сывороток были активными и не антикомплементарными, негативные — отрицательными и не антикомплементарными в РДСК, РНГА и ИФА (табл. 1).
Поставленные опыты показали, что кровь от КРС и овец паразитоносителей для приготовления позитивной сыворотки можно брать, когда антитела в РДСК находятся в титрах 1:20 и выше, в РНГА от 1:200, в ИФА — 1:200;. для приготовления негативной — когда сыворотки крови КРС и овец отрицательно реагируют в РДСК, РНГА и ИФА.
Чтобы установить общность антител в сыворотках крови, полученных от КРС и овец, положительно реагирующих с анаплазменным антигеном, была поставлена перекрестная реакция. Сыворотки КРС и овец исследовали с антигенами A. marginale и A. ovis в РДСК, РНГА и ИФА и получили результаты, идентичные описанным выше.
Титры антител у кроликов первого и второго опытов приведены в таблицах 2, 3; результаты третьего опыта показаны в таблице 4.
Таким образом, результаты эксперимента показали возможность получения анапплазменных сывороток от иммунизированных кроликов, а также идентичные результаты при испытании указанных сывороток с приготовленными нами антигенами A. marginale и A. ovis. Сыворотки крови кроликов контрольной группы давали отрицательный результат. Следовательно, в качестве отрицательных и положительных сывороток в серологических реакциях (РДСК, РНГА и ИФА) могут быть использованы не только сыворотки крови рогатого скота, но и кроликов.
Полученные нами положительные сыворотки от КРС и овец паразитоносителей, смешали и приготовили пул
4. Титры антител у сывороток крови кроликов, иммунизированных анаплазменными антигенами (A. marginale и A. ovis)
А. marginale A. ovis
РДСК РНГА, ИФА РДСК РНГА, ИФА
1:40...1:160 1:400...1:3200 1:40.1:160 1:400.1:3200
1:40...1:160 1:400.1:3200 1:40.1:160 1:400.1:3200
5. Титры нативных сывороток рогатого скота и кроликов в Р, (позитивных и негативных) крови 1СК, РНГА и ИФА
Животное РДСК РНГА ИФА,
Рогатый скот-паразитоносители 1:40 1:800 1:800
Иммунизированные кролики 1:80 1:1600 1:1600
Контрольный рогатый скот - - -
Контрольные кролики - - -
положительной сыворотки. Второй пул положительной сыворотки получили, смешивая в одну серию три серии положительной сыворотки крови от иммунизированных анаплазменными антигенами кроликов. Одну серию негативной сыворотки крови КРС и овец и одну серию негативной сыворотки крови кроликов использовали в качестве контроля. Позитивные и негативные серии сывороток крови титровали в РДСК, РНГА и ИФА (табл. 5).
В дальнейшем позитивные и негативные сыворотки крови КРС и кроликов, с целью длительного хранения, высушивали в объеме 2,0 мл, но без защитной среды. После лиофилизации сыворотку разводили в 2 мл физиологического раствора и вновь титровали в сравнении с нативными. При этом были получены результаты, аналогичные результатам с нативными сыворотками.
Таким образом, высушенные сыворотки крови от КРС и овец паразитоносителей, и от иммунизированных анаплазменными антигенами кроликов полностью сохранили свою активность и не были антикомплементарными.
Заключение
Поставленные нами опыты показали, что кровь для приготовления позитивной сыворотки от паразитоносите-лей и иммунизированных кроликов можно брать, когда титры антител в РДСК составляют 1:20 и выше, в РНГА и ИФА — не ниже 1:200. Для приготовления негативной сыворотки пригодна сыворотка крови КРС, овец и кроликов, дающая отрицательные результаты в серологических реакциях с анаплазменным антигеном.
Библиография
1. Георгиу, Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталиоза лошадей/ Х. Георгиу: автореф. дис. . докт. биол. наук: защищ 26.06.1997, утвержд. 29.09.1997 / Х. Георгиу — М.: ВИЭВ, 1997. — 56 с.
2. Георгиу, Х. Диагностическая ценность ИФА и РНГА при анаплазмозе / Х. Георгиу // Тезисы докладов и сообщений IV Съезда ВОПР, 1987. — С. 125-126.
3. Георгиу, Х. Серологическая диагностика анаплазмоза у овец / Х. Георгиу // Сборник научных трудов МВА. — 1980. — Т. 116. —
С. 72-76.
4. Георгиу, Х. Комплементсвязывающие антитела и паразитемия у овец при анаплазмозе / Х. Георгиу // Труды ВИЭВ. — 1982. —
Т. 56. — С. 95-98.
5. Георгиу, Х. Серологическая диагностика анаплазмоза рогатого скота / Х. Георгиу, НА. Казаков, С.Д. Родин // Труды ВИЭВ. — 1983. — Т. 57. — С. 35-42.
6. Георгиу Х. Серологические реакции для диагностики анаплазмоза / Х. Георгиу, НИ. Степанова // Ветеринария. — 1987. — №5. — С. 43-45.
7. Гулюкин, М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) / М.И. Гулюкин, ВТ. Заблоцкий, ВВ. Белименко // РВЖ.СХЖ. — 2013. — №2. — С. 36-40.
8. Заблоцкий, ВТ. Профилактика кровепаразитарных болезней домашних животных / ВТ. Заблоцкий, ВВ. Белименко // Вет-корм. — 2013. — № 4. — С. 38-40.
9. Степанова, НИ. Иммуноферментный анализ (ELISA) при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец / НИ. Степанова, Х. Георгиу // Тезисы докладов Всесоюзного семинара-совещания «Опыт выращивания, нагула, откорма и профилактики болезней крупного рогатого скота республик Средней Азии, Закавказья и Казахстана». — Самарканд, 1983. — С. 71-73.
10. Bradway, D.S. Sensivity and specifity of the complement fixation test for detecnlon of cattle persistently Infected with Anaplasma marglnale / D.S. Bradway, S. Torioni de Echaide, DP. Knowles, et al. // J. Veter. Diagnostic Investig. — 2001 — Vol. 13. — № 1. — P. 79-81.
11. Fernandez, P.J. Atlas of transboundary animal diseases / P.J. Fernandez, W.R. White. — OIE, 2010 — 75 с.
12. Montenegro-James S., Guillen AT., Ma S.-J. Use of the dot enzyme-linked immunosorbent assay with isolated Anaplasma marginale initial bodies for serodiagnosis of anaplasmosis in cattle // Am. J. Vet. Res. — 1990. — Vol. 51. — No. 10. — р. 1518-1521.
SUMMARY Ch. Georgiou
YR. Kovalenko's All-Russian Research Institute for Experimental Veterinary Medicine of Federal agency for scientific institutes of Russian Federation (VIEV) (Moscow).
Anaplasmosis Positive and Negative Sera for Serological Tests. Results of producing of positive and negative Anaplasmosis sera for IHAT, ICFT, ELISA have been described in the article. Blood from Anaplasmosis carries cattle and sheep can be used for producing of positive serum when lebel of antibodies against Anaplasmosis is more than 1:20 in ICFT, 1:200 in IHAT and 1:200 in ELISA and from the immunized rabbits only. For producing negative serum blood from health cows and sheep can be used only. Keywords: anaplasmosis, cattle, ELISA, ICFT, IHAT, protozoan diseases, sheep.
Серии
