Современное состояние и перспективы получения каллусных клеток женьшеня Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

AGRICULTURAL SCIENCES

MODERN STATE AND PERSPECTIVES OF RECEIVING CALLUS CELLS OF GINSENG

Romanov A.

graduate student, National University of Food Technologies, Kiev

Romanova Z.

PhD, assistant professor, National University of Food Technologies, Kiev

Romanov N.

PhD, National University of Food Technologies, Kiev

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК

ЖЕНЬШЕНЯ

Романов А.

магистрант, национальный университет пищевых технологий, г Киев

Романова З.

Кандидат технических наук, доцент, доцент кафедры, национальный университет пищевых технологий, г Киев

Романов Н.

Кандидат технических наук, старший преподаватель, национальный университет пищевых технологий, г Киев

Abstract

The natural reserves of medicinal plants are reduced due to irregular and unregulated harvesting. Some medicinal plants on the territory of Ukraine do not grow at all or grow in limited quantities, determines the need for raw materials. The solution of the problem of providing the pharmaceutical industry with plant raw materials is the use of a culture of isolated organs, tissues and cells of higher plants.

Аннотация

Природные запасы лекарственных растений сокращаются вследствие неправильной и нерегламенти-рованной заготовки. Некоторые лекарственные растения на территории Украины вообще не растут или растут в ограниченном количестве, определяет потребность в импорте сырья. Решением проблемы обеспечения фармацевтической промышленности растительным сырьем является применение культуры изолированных органов, тканей и клеток высших растений.

Keywords: ginseng ordinary, isolated tissue, triterpene saponins, polysaccharides, sesquiterpenes, farnesol, glycosides.

Ключевые слова: женьшень обыкновенный, изолированной ткани, тритерпеновые сапонины, полисахариды, сесквитерпены, фарнезол, гликозиды.

Введение

Целью работы является совершенствование технологии выращивания биомассы женьшеня (Panax ginseng), а также разработка состава и технологии капсул на основе биомассы селективной линии женьшеня

Новизна: предложено упрощенную комплексную технологию выращивания биомассы женьшеня, шо позволяет повысить эффективность процесса культивирования на 40%.

Женьшень обыкновенный (лат. Рапах), (китайское - корень жизни, буквально - человек-корень: «жень» - «человек», «шень» - «тело») - одно из древнейших лекарственных растений, которая известна более 4000 лет. Это многолетнее травянистое растение с ежегодно отмирающей надземными побегами и многолетними зимующими подземными органами.

Несмотря на то, что в фармакологии традиционно уделяется повышенное внимание корневой системе женьшеня, его наземная часть: листья, стебли, цветы обладают не меньшими целебными

свойствами, в частности, суммарное содержание в них гликозидов ничуть не меньше аналогичного в корнях [1]. В ходе современных биохимических исследований установлено, что листья женьшеня обладает примерно схожим с корнями растения составом. Суммарная гликозидная фракция женьшеня составляет 21-23% от массы абсолютно сухого сырья, что в 3-6 раз превышает подобную в корнях [1, 2].

Широкий спектр лекарственных свойств женьшеня обусловлен разнообразием и сложностью химических веществ, накапливающихся в его клетках. В его корне содержится до 100 биологически активных веществ, которые, попадая в организм, влияют на все его системы. Многие из этих веществ изучены достаточно хорошо, однако есть и такие, для которых пока известна только их принадлежность к определенному классу соединений [2,3].

В частности женьшень содержит вещества, обладающие высокой физиологической активностью - ряд тритерпеновых сапонинов (основным из которых является гинзенин), пенаксову кислоту, 10-

30% крахмала, витамины (С, группы В, пантотено-вая, никотиновая, фолиевая кислоты), аскорбиновая кислота, холин , фитостерин, пектиновые и смолистые вещества, слизи, аминокислоты, сахар. Из макроэлементов представлены калий, кальций, фосфор, магний; из микроэлементов - железо, медь, кобальт, марганец, молибден, цинк, хром, титан [4].

Всестороннее воздействие на организм обусловливается наличием в корне следующих физиологически активных веществ: панаксин - вещество, тонизирует сердце и сосуды; панаксова кислота -активно действует на обмен веществ, усиливая окислительные процессы, ведет к более быстрому распаду жиров панаквилон - стимулирует эндокринную систему и способствует созданию необходимого уровня гормонов в организме эфирное масло панаксен - обладает обезболивающим и успокаивающим на нервные центры эффектом гли-козид гинзенин - регулирует процессы обмена углеводов, вызывая снижение сахара в крови и увеличивая синтез гликогена, и поэтому эффективно при диабете [4].

Объекты и методика Исследования проводились в 2015-2016 гг. в условиях учебной лаборатории . В качестве объектов исследования были выбраны и наземная часть и корни Panax ginseng. Главными действующими веществами женьшеня, как уже упоминалось, считаются тритерпеновые гликозиды - сапонины (гинзенозиды), которые в прошлом чаще называли панаксозиды [5].

В значительном количестве в корнях женьшеня представлены биологически активные полиацетилена - фалькаринол, фалькаринтриол, панакси-дол, гептадека-1-эн- 4,6-дин-3,9-диол. Содержание панаксинола, панаксидола и панакситриола в порошке женьшеня равно 250, 297 и 320 мкг / г соответственно [6].

В корне женьшеня содержатся тритерпеновые сапонины, имеют следующие основные свойства:

- Rb1 - стимулирует образование нервных волокон и поддерживает их функции, предотвращает половой дисфункции, успокаивает центральную нервную систему, улучшает сон, снижает жар, ускоряет синтез белков сыворотки, стимулирует синтез и расщепление холестерина, содержит расщепления нейтрального жира, антигемолиз;

- Rb2 - успокаивает центральную нервную систему, ускоряет синтез RNA, антигемолиз, предотвращает диабет;

- Rd - повышает иммунитет, содержит распространение раковых клеток;

- Rh2 - стимулирует превращение раковых клеток в нормальные

Сапонины усиливают деятельность слизистых желез дыхательных путей, облегчает отхождение мокроты при простудных и других заболеваниях; обладают Противоаритмические, успокаивающим, обезболивающим, противовоспалительным, противогрибковым, кардиотоническим, капиляроз-мицнюючу действием [10,11].

Для использования культуры изолированной ткани женьшеня в качестве источника раститель-

ного сырья промышленного назначения необходимо было установить ее идентичность естественному корню.

Сравнительный анализ природного корня и биомассы женьшеня показал их идентичность с ор-ганолептическими свойствами, а также по химическому и биохимическому составу, что позволяет рекомендовать биомассу женьшеня для получения из нее препаратов

Количество золы (микро и макроэлементы) в биомассе женьшеня почти в два раза больше чем в естественном корни, что связано с повышенным содержанием в ней некоторых микроэлементов

Сравнительный анализ интактных растений и полученных из них штамм культур ткани показал, что они содержат одинаковые наборы свободных аминокислот. Но количество их в штаммах культуры ткани обычно в несколько раз больше, чем в интактной растении.

В экспериментах получена четкая зависимость выхода экстрактивных веществ от концентрации этанола. Так, глубина извлечения существенно уменьшается с увеличением концентрации этанола в экстрагенте (табл. 1.6.). [14].

Экстрагирования целесообразно проводить смесями с низким содержанием этилового спирта, так как разница в количестве экстрактивных веществ, изъятых 20- и 40% этанолом, составляет 6,6%.

Сопоставление результатов стимулирующей активности настойки из корня женьшеня и каллу-сных ткани показывает, что активность настойки из природного корня в два раза выше чем с каллусных тканей [12 -15].

Биомасса женьшеня содержит значительно большее количество растворенных углеводов.

Для получения культуры используют ткани, изолированные из стебла, листа, корня, побега, зародыша, плода и других частей целого растения. Данная работа посвящена культуре клеток женьшеня, полученных из корня. Поэтому рассмотрим процесс образования тканевой культуры на эксплантаты (кусочкам) корня [23-25].

Сначала корни тщательно моют водой с мылом, стерелизують растворами диациду, сулемы или 96% -ным спиртом и промывают несколькими порциями стерильной дестильованнои воды. Затем маленьким пробкобуром (диаметром внутреннего отверстия 1 мм) вырезают из корня диска высотой около 2-4 мм и вносят их в питательную среду, содержащую набор макро- и микросолей, ростовые вещества, сахарозу, агар-агар (для затвердевания среды) (табл . 1.7.1). Емкости закупоривают ватно-марлевыми пробками или пищевой фольгой. Все работы, которые связаны с выделением дисков и культивированием изолированных тканей проводят с соблюдением строгих правил асептики [24].

Для образования и роста каллусных ткани емкости переносят в кондиционированный помещение, где тщательно выдерживают температуру - 26 ± 1 оС, влажность - около 70% и световой режим. На десятый день выращивания на раневых поверхностях дисков корня образуется ткань - калус.

Состав компонентов питательной среды выглядит следующим образом: Макросоли на 10 л:

- N^N03 - 332 г;

- KNOз - 384 г;

- СаСЪ - 68 г;

- мя804 - 74 г;

- КН2РО4 - 34 г;

- Н20дист до метки. Микроэлементы на 2 л:

- Н3ВО3 - 12,4 г;

- мя804 - 44,6 г;

- ги804 - 17,2 г;

- К1 - 1,64 г;

- NaMoO4 - 0,5 г;

- Си804 - 0,05 г;

- С0С126Н2О - 0.05 г;

- Н20дист до метки.

Процесс калусообразования заключается в следующем. Отчлененные с корня диски содержат различные специализированные ткани. В полноценном растении клетки этих тканей несут определенные функции и характерезуються определенной морфологией. В условиях in vitro они теряют свою специализацию, то есть деспециализируются (деди-ференциируются) [23,24]. Дедиференциированные клетки приобретают способность к делению, которая стимулируется как индукторами деления, что находятся в питательной среде, так и раневыми гормонами (защитная реакция организма). В результате деления возникает калусная ткань.

Результаты и обсуждение

Калусная ткань отличается от ткани первичного экспланта морфологией клеток и ее составляющих. Она состоит в основном из крупных вакуо-лизованных клеток. Это связано с тем, что клетки после одного или нескольких делений переходят к росту растяжением, который в каллусных тканях более интенсивный и менее ограничен чем в целом растении. Наряду с крупными вакуолизованными клетками встречаются мелкие клетки меристем-ного типа, а также элементы, которые проводят - в основном гидроциды [9]. Образовавшуюся калу-сную ткань выделяют от первичного эксплантаты (диска корня), разрезают на кусочки массой около 1 г и пересевают на свежую приготовленную питательную среду для получения биомассы, которая неорганизованно растет . Цикл выращивания составляет от 30 до 60 суток. За это время количество биомассы в одной емкости увеличивается примерно в 15-20 раз. Частота пересадок ткани на свежий питательную среду зависит от скорости нарастания биомассы и использования культурой питательной среды. Как правило, продолжительность роста ткани (пассаж) колеблется от 30 до 45 суток.

Заключение

Подытоживая анализ литературных и экспериментальных данных можно сделать следующие выводы и сказать, что:

- калусние клетки, выращенные биотехнологическим методом, имеют содержание биологически

1) FeSO4 - 5,56 г; Н20дист до 400 см3.

2) Трилон Б (Na2 EDTA) - 7,46 г; Н20дист до 400 см3.

3) Н20дист до метки.

АНО (а-нафтиоцтова к-та):

- а-нафтиоцтова кислота - 2 г

- Н20дист до метки. Тиаминхлорид на 1 л:

- тиаминхлорид - 1 г;

- Н2Одист до мггки Кинетин на 0,5 л:

- кинетин (C10H9N5O) - 0,50 г;

- 10% 1дкий Na - 12,5 см3;

- Н20дист до метки.

активных веществ в среднем не ниже по сравнению с содержанием их в естественном корне женьшеня. В частности, содержание гинзенозидив в культивируемых растениях не уступает, а в некоторых случаях даже и превышает их содержание в дикорастущем женьшене [2-5];

- наземная часть женьшеня: листья, стебли, цветы, - обладают не меньшими целебными свойствами, в частности, суммарное содержание в них гликозидов ничуть не меньше аналогичного в корнях. В ходе современных биохимических исследований установлено, что листья женьшеня обладает примерно схожим с корнями растения составом. Суммарная гликозидная фракция женьшеня составляет 21-23% от массы абсолютно сухого сырья, что в 3-6 раз превышает подобную в корнях.

Данные результаты показывают, что можно успешно использовать не только корень, но и другие части самого растения женьшеня как первичный эксплантаты для культивирования биомассы [6-9]. ;

- основные биологически активные вещества женьшеня - тритерпеновые сапонины, среди которых преобладает гинзенин. Также необходимо выделить и следующие физиологически активные вещества: панаксин, панаксова кислота, панаквилон, эфирное масло панаксен [15-18];

- экстракты биомассы женьшеня имеют широкую терапевтическое действие и соответственно широкую область применения: парфюмерная и косметическая промышленность, фармакологическая и медицинская промышленность, пищевая и ликеро-водочной промышленность ;

- состав питательной среды и внесения в него определенных стимуляторов роста существенно влияет на прирост как самой биомассы, так и отдельных биологически активных веществ, что позволяет искать более оптимальный состав питательной среды, который был бы экономически рентабельным

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Смоленская И., Смирнова Ю., Решетняк О. Штамм культивируемых клеток растения женьшеня настоящего (panax ginseng c.a. mey) в условиях in vitro - продуцент гинзенозидов. Патент РФ 2415927. Опубл 10.04.2011

2. Лжарсьш рослини: Енциклопедичний довщник /. Л-56 Ввдп. ред. А. М. Гродзшський.— К.: Видавництво. «Укранська Енциклопедiя» iM. М. П. Бажана, Украш- ський виробничо-комерцш-ний центр «Олiмп», 1992.—. 544 с:

3. Kiefer D, Pantuso T. Panax ginseng // Am Fam Physician. - 2003. - Vol 68, N 8. - P:1539-42.

4. Geng .J, Dong J., Ni H., Lee M.S., Wu T. Ginseng for cognition // Cochrane Database Syst Rev. -2010. - Vol 8, N 12. - P:CD007769. doi: 10.1002/14651858.CD007769.pub2

5. Smith I., Williamson E.M., Putnam S., Farri-mond J., Whalley B.J. Effects and mechanisms of ginseng and ginsenosides on cognition // Nutr Rev. -2014.- Vol 72, N 5. - P:319-33. doi: 10.1111/nure.12099. Epub 2014 Mar 25.

6. Wang C.Z., Anderson S., Yuan C. Phytochem-istry and Anticancer Potential of Notoginseng // Am J Chin Med. - 2016. - Vol 44, N 1. - P:23-34. doi: 10.1142/S0192415X16500026.

7. Chen C.F., Chiou W.F., Zhang J.T. Comparison of the pharmacological effects of Panax ginseng and Panax quinquefolium // Acta Pharmacol Sin. -2008. - Vol 29, N 9. - P:1103-8. doi: 10.1111/j.1745-7254.2008.00868.x.

8. Choi J., Kim T.H., Choi T.Y., Lee M.S. Ginseng for health care: a systematic review of randomized controlled trials in Korean literature // PLoS One. -

2013. Vol 8, N 4. - P:e59978. doi: 10.1371/jour-nal.pone.0059978.

9. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. — М.: Ме-дицына, 1978. — 656 с.: ил.

10. Tian X, Tang H, Lin H, Cheng G, Wang S, Zhang X. Saponins: the potential chemotherapeutic agents in pursuing new anti-glioblastoma drugs // Mini Rev Med Chem. - 2013. - Vol 13, N 12. P:1709-24.

11. Le T.H., Lee G.J., Vu H.K., Kwon S.W. Ginseng Saponins in Different Parts of Panax vietnamen-sis. // Chem Pharm Bull. - 2015. - Vol 63, N 11. P:950-4. doi: 10.1248/cpb.c15-00369.

12. PaekK.Y., MurthyH.N., HahnE.J., Zhong J.J. Large scale culture of ginseng adventitious roots for production of ginsenosides // Adv Biochem Eng Bio-technol. - 2009. - N 113. - P:151-76. doi: 10.1007/10_2008_31.

13. Murthy H.N., Paek K.Y. Panax ginseng Adventitious root suspension culture: protocol for biomass production and analysis // Methods Mol Biol. - 2016. -N 1391. - P:125-39. doi: 10.1007/978-1-4939-3332-7_9.

14. Liang Y., Wu J., Li Y., Li J., Ouyang Y., He Z., Zhao S. Enhancement of ginsenoside biosynthesis and secretion in Panax ginseng hairy roots // Biotech-nol Appl Biochem. - 2015. - Vol. 62, N 2. - P:193-9. doi: 10.1002/bab.1256.

15. Murthy H.N., Georgiev M.I., Kim Y.S., Jeong C.S. Ginsenosides: prospective for sustainable biotech-nological production // Appl Microbiol Biotechnol. -

2014. - Vol 98, N 14. - P:6243-54. doi: 10.1007/s00253 -014-5801-9.

16. Kim Y.J., Zhang D., Yang D.C. Biosynthesis and biotechnological production of ginsenosides // Bi-otechnol Adv. - 2015. - Vol 1, N 33. - P:717-35. doi: 10.1016/j.biotechadv.2015.03.001.

QUALITATIVE CHARACTERISTICS VARIETY OF TOBACCO OF VIRGINIA

Kandashkina I.

candidate of technical sciences, senior research employee Federal state Budget Scientific Institution "All-Russian research institute of tobacco, makhorka and tobacco products"

Samoilenko N.

senior research employee Federal state Budget Scientific Institution "All-Russian research institute of tobacco, makhorka and tobacco products"

Gromova L.

senior research employee Federal state Budget Scientific Institution "All-Russian research institute of tobacco, makhorka and tobacco products"

Belinskaya N.

senior research employee Federal state Budget Scientific Institution "All-Russian research institute of tobacco, makhorka and tobacco products"

КАЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТАБАЧНОГО СЫРЬЯ СОРТОТИПА

ВИРДЖИНИЯ

Кандашкина И.Г.

канд. техн. наук, старший научный сотрудник, лаборатория стандартизации и качества, ФГБНУ ВНИИТТИ

Самойленко Н.П.

старший научный сотрудник, лаборатория стандартизации и качества, ФГБНУ ВНИИТТИ

Громова Л.И.

старший научный сотрудник, лаборатория стандартизации и качества, ФГБНУ ВНИИТТИ

Белинская Н.Г.

старший научный сотрудник, лаборатория стандартизации и качества, ФГБНУ ВНИИТТИ