CC BY
11
DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-137-144
УДК 616.98:579.841.95
л.В. саяпина1, н.А. осина2, Е.А. нарышкина2, А.В. федоров2, я.м. краснов2, д.с. давыдов1,
В.П. Бондарев1
Совершенствование подходов по верификации вакцинного штамма Francisella tularensis 15 нииЭГ в процессе длительного хранения
'ФБГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», Москва, Российская Федерация;
2ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация
цель исследования - совершенствование способов верификации вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ в процессе длительного хранения в современных условиях. материалы и методы. В работе обобщены результаты изучения фенотипических и генетических свойств лиофилизированных культур вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (1953, 1966, 1969, 1987, 1990, 2003, 2012 и 2013 гг.), хранившихся в ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в течение от одного года до 60 лет. результаты и обсуждение. Проведенные ранее исследования выявили, что лиофилизированные культуры F. tularensis 15 НИИЭГ в основном обладали показателями, характерными для вакцинного штамма, за исключением отклонений от нормативных требований по остаточной вирулентности и специфической безопасности. Подтверждена стабильность сохранения у вакцинного штамма, хранившегося различное время в лифилизированном состоянии, делеций в генах pilA и pilE (область дифференциации RD19) и генах, кодирующих липопротеин lpp (RD18). Определена специфичная для вакцинного штамма мутация C178404T (по геному штамма F. tularensis LVS, GenBank NCBI № CP009694) и разработан подход по ее определению. Полученные данные указывают на перспективность использования описанных выше делеций в регионах RD18/RD19 в совокупности с мутацией C178404T для оценки аутентичности вакцинного штамма с помощью молекулярно-генетических методов. Таким образом, проведенный ретроспективный анализ материалов о культурах вакцинного штамма туляремийного микроба с 1940-х по 2013 год и полученные экспериментальные данные позволили дополнить новыми сведениями единые требования изготовления, изучения, поддержания, хранения и движения вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. На основании полученных результатов коллективом авторов разработан проект методических рекомендаций федерального уровня «Вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ: порядок обращения».
Ключевые слова: вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ, фенотипические и генетические свойства, молекулярно-генетические методы.
Корреспондирующий автор: Саяпина Лидия Васильевна, e-mail: Sayapina@expmed.ru.
Для цитирования: Саяпина Л.В., Осина Н.А., Нарышкина Е.А., Федоров А.В., Краснов Я.М., Давыдов Д.С., Бондарев В.П. Совершенствование подходов по верификации вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ в процессе длительного хранения. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 3:137-144. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-137-144
Поступила 22.02.2022. Отправлена на доработку 23.05.2022. Принята к публ. 21.09.2022.
L.V. Sayapina1, N.A. Osina2, E.A. Naryshkina2, A.V. Fedorov2, Ya.M. Krasnov2, D.S. Davydov1, V.P. Bondarev1
Improvement of Approaches to the Verification of the Vaccine Strain Francisella tularensis 15 NIIEG during Long-Term Storage
'Scientific Center on Expertise of Medical Application Products, Moscow, Russian Federation; 2Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Abstract. The aim of the study was to improve the methods for verifying the vaccine strain Francisella tularensis 15 NIIEG during long-term storage under current conditions. Materials and methods. The paper summarizes the results of studying the phenotypic and genetic properties of lyophilized cultures of the vaccine strain F. tularensis 15 NIIEG (1953, 1966, 1969, 1987, 1990, 2003, 2012 and 2013) stored at SCEMAP for a period of one to 60 years. Results and discussion. Previous studies have revealed that freeze-dried cultures of F. tularensis 15 NIIEG generally had the characteristics of the vaccine strain, with the exception of deviations from the regulatory requirements for residual virulence and specific safety. The stability of preservation of deletions in the pilA and pilE genes (the region of differentiation RD19) and the genes encoding lpp lipoprotein (RD18) in the vaccine strain, which was stored for various periods of time in a lyophilized state, has been confirmed. The vaccine-strain-specific mutation C178404T (by the genome of F. tularensis LVS strain, GenBank NCBI no. CP009694) has been identified, and an approach to determine it has been developed. The data obtained are promising as regards using the above deletions in the RD18/RD19 regions in combination with the C178404T mutation to assess the authenticity of the vaccine strain using molecular genetic methods. Thus, the conducted retrospective analysis of the data on the cultures of tularemia microbe vaccine strain from the 1940s to 2013 and the gathered experimental data, made it possible to supplement the uniform requirements for the manufacture, study, maintenance, storage and movement of F. tularensis 15 NIIEG vaccine strain with new evidence. Based on the results obtained, the authors have drawn a draft methodological recommendations of the federal level "Vaccinal strain Francisella tularensis 15 NIIEG: order of handling".
Key words: Francisella tularensis 15 NIIEG vaccine strain, phenotypic and genetic properties, molecular-genetic methods.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest. Corresponding author: Lidiya V. Sayapina, e-mail: Sayapina@expmed.ru.
Citation: Sayapina L.V., Osina N.A., Naryshkina E.A., Fedorov A.V., Krasnov Ya.M., Davydov D.S., Bondarev V.P. Improvement of Approaches to the Verification of the Vaccine Strain Francisella tularensis 15 NIIEG during Long-Term Storage. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; 3:137-144. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-137-144 Received 22.02.2022. Revised 23.05.2022. Accepted 21.09.2022.
Sayapina L.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2272-2621 Osina N.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0954-5683 Naryshkina E.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9190-099X Fedorov A.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7190-4427
Заболевание туляремией регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России. В настоящее время природные очаги туляремии распространены практически во всех регионах нашей страны. Большое значение в борьбе с туляремией отводится профилактическим мероприятиям, в том числе вакцинации населения.
впервые вакцинация против туляремии проведена Л.М. Хатеневером и Г.Я. Синаем в 1931 г. в юго-восточном Казахстане глицериновой инак-тивированной туляремийной вакциной. Позднее H.A. Гайский и Б.Я. Эльберт (1932-1936 гг.) доказали возможность создания стойкого иммунитета при введении живой вакцины. Используя метод аттенуа-ции, получены два кандидата в вакцинные штаммы: Francisella tularensis № 15 и Ондатра IV. Штамм F. tularensis № 15 признан вакцинным, так как более стабилен при хранении [1, 2].
впоследствии многократные пересевы (в течение 15 лет) штамма F. tularensis № 15 привели к снижению его остаточной вирулентности и, как следствие, к снижению иммуногенности. Для восстановления иммунобиологических свойств в НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи проведена анимализация штамма через организм морских свинок. полученный вариант штамма F. tularensis №15-восстановленный впоследствии еще дважды подвергался восстановлению иммуногенных свойств и получил название «вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ» [3-5].
в настоящее время штамм F. tularensis 15 НИИЭГ хранится в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп пато-генности (ГКПМ) ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава россии, производство живой туляремийной вакцины осуществляется в АО «НПО «Микроген» (филиал в г. омске).
в сложившихся современных условиях отсутствует руководящий документ, регламентирующий единые требования к порядку изготовления, изучения, поддержания и хранения вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Анализ нормативных документов, в которых приведены требования к вакцинным штаммам возбудителей особо опасных инфекций, в том числе и туляремии (МУ 3.31.2161-07. Основные требования к вакцинным штаммам туляре-мийного микроба), показывает, что в них отсутствуют требования к генетической стабильности штамма, в описательной форме приведены технологические операции по культивированию и лиофилизации
Krasnov Ya.M., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4909-2394 Davydov D.S., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1768-1362 Bondarev V.P., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6472-6386
вакцинного и кандидатов в вакцинные штаммы. При этом доступные сведения имеют разную степень детализации свойств вакцинного штамма.
Отсутствие единых подходов к алгоритму поддержания производственного штамма, используемого при изготовлении туляремийной вакцины, может привести в процессе хранения к изменению основных иммунобиологических свойств и несвоевременной их корректировке в случае выявления несоответствия отдельных показателей установленным требованиям. Актуальность проблемы подтверждается исследованиями зарубежных авторов по разработке кандидатов в вакцинные живые туляремийные штаммы с целью сопоставления известных характеристик, связанных с их аттенуацией и иммуногенной активностью [6-8].
Учитывая вышеизложенное, необходимость регламентирования нормативных требований к порядку поддержания и изучения основных свойств штамма Е tularеnsis 15 НИИЭГ в процессе его хранения и поддержания не вызывает сомнений [9], что согласуется с рекомендациями ВОЗ по производству и контролю качества вакцинных препаратов для обеспечения их безопасности и эффективности [10].
На первом этапе важной составляющей является определение единых научно обоснованных подходов и требований к порядку изготовления, изучения, хранения и поддержания эталонной линии вакцинного штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ, предназначенного для производства вакцины туляремийной живой, аллергена туляремийного жидкого (Тулярин) и диагностических противотуляремийных препаратов.
Цель работы - совершенствование способов верификации вакцинного штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ в процессе длительного хранения.
Задачи исследования:
1. Провести анализ нормативных документов, отражающих требования к вакцинным штаммам против особо опасных инфекций.
2. Обобщить данные, полученные при изучении фенотипических свойств штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ.
3. Определить наиболее информативные методы изучения генетических свойств штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ для его аутентификации.
4. Разработать методические рекомендации «Вакцинный штамм Еrancisella tularensis 15 НИИЭГ: порядок обращения».
материалы и методы
В работе обобщены результаты изучения фе-нотипических и генетических свойств, а также отсутствия посторонних микроорганизмов и грибов в лиофилизированных культурах вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (1953, 1966, 1969, 1987, 1990, 2003, 2012 и 2013 гг.), хранившихся в ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России при температуре минус (19±1) °С в течение от одного года до 60 лет. в процессе исследования проанализированы паспорта контроля качества 48 лиофилизированных культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, полученных на базе Одесского предприятия производства бактерийных препаратов в 1980, 1987 и 1990 гг., и 28 паспортов качества - на предприятии НПО «Микроген» (филиал в Омске) за 2003-2013 гг.
Ферментативная активность культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, а также образование сероводорода и индола изучены с использованием питательной среды Dawns, модульного анализатора бактериологического bioMerieux VITEK® 2 Systems, аналитических карт типа bioMerieux GN (21341) и систем индикаторных бумажных (СИБ). Серологические свойства исследовали с использованием коммерческой сыворотки диагностической туляремийной сухой для РА; отсутствие посторонних бактерий и грибов - последующей оценкой однородности тин-кториальных свойств культур и микроскопией мазков. Иммунобиологические свойства (остаточная вирулентность, специфическая безопасность, им-муногенность, прививаемость) штамма F. tularensis 15 НИИЭГ определяли на беспородных белых мышах (масса 18-20 г) и морских свинках (масса 300450 г).
Исследования генетических свойств штамма F. tularensis 15 НИИЭГ проводили методами ERIC-и RAPD-типирования в соответствии с рекомендациями авторов [11], ПЦР и фрагментного секвени-рования (по общепринятой методике) в Российском противочумном институте «Микроб».
Результаты исследований обрабатывали общепринятыми статистическими методами, рисунки и графики - с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2010.
результаты и обсуждение
До 2011 г. в Российской Федерации существовала единая система, которая определяла требования к организации производства и контроля качества иммунобиологических препаратов, в том числе и вакцин против особо опасных инфекций. при этом порядок изготовления, изучения, поддержания и хранения штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, а также условия его получения и использования перед каждым производственным циклом изготовления вакцины были прописаны недостаточно полно в промышленном регламенте на вакцину туляремийную живую (утверж-
дался руководителем учреждения-производителя и согласовывался в ГИСК им. Л.А. Тарасевича).
В ведущих фармакопеях мира (Европейская, Британская, Фармакопея США и др.) ввиду отсутствия производства живых вакцин против особо опасных инфекций требования к живым вакцинным штаммам отсутствуют [12, 13]. В то же время WHO Good Manufacturing Practices for biological products, WHO Expert Committee on Biological Standardization, Международный совет по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для медицинского применения (ICH), Государственная фармакопея Российской Федерации рекомендуют тщательно подходить к выбору и давать детальную характеристику вакцинным штаммам и составу вакцин [14-16].
ранее нами изучены фенотипические, генетические свойства и иммунобиологические показатели вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, хранившегося в лифилизированном состоянии с 1953, 1966, 1969, 1987, 1990, 2003, 2012 и 2013 гг. [17, 18]. При этом иммунногенность вакцинного штамма изучалась на базе трех профильных учреждений. Установлено, что в основном все лиофилизирован-ные культуры вакцинного штамма обладали показателями, характерными для вакцинного штамма, использующегося в производстве живой туляремий-ной вакцины, однако в ряде случаев наблюдались отклонения от нормативных требований по остаточной вирулентности и специфической безопасности. Результаты ежегодного изучения остаточной вирулентности штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (с 1987 по 2013 год) на производственных площадках и в специализированной лаборатории показали, что представляется необходимым снизить верхнюю границу данного показателя в сторону уменьшения: с 2106 м.к. до 5103 м.к. [19].
Известно, что иммуногенность вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ напрямую связана с его остаточной вирулентностью, которая обеспечивает приживаемость, размножение патогена в макроорганизме и формирование активного противо-туляремийного иммунитета [20-23]. Полученные результаты позволили сформулировать основные требования, предъявляемые к изучению, изготовлению, хранению и поддержанию вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, которые нашли отражение в проекте методических рекомендаций федерального уровня, а именно: вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ должен обладать типичными культу-рально-морфологическими, биохимическими, иммунобиологическими и генетическими свойствами для рода Francisella, вида tularensis, подвида holarctica, которые представлены в таблице.
В ходе проведения экспериментов подтверждена стабильность сохранения у вакцинного штамма, хранившегося в лифилизированном состоянии с 1953, 1966, 1969, 1987, 1990, 2003, 2012 и 2013 гг., делеций в генах pilA и pilE (область дифференциации
основные свойства вакцинного штамма F. tularensis 15 нииЭГ Basic properties of F tularensis 15 NIIEG vaccine strain
Показатели Indicators Методы Methods Норма Standard
Окраска по Граму Gram Staining Микроскопический Microscopic Грамотрицательные палочковидные или коккоидные плеоморфные бактерии Gram-negative rod-shaped or coccoid pleomorphic bacteria
Культурально-морфологические свойства Cultural and morphological properties Бактериологический Bacteriological SR - тип колоний (белый цвет) - не менее 80 % SR - colony type (white) - not less than 80 %
Глюкоза + (кислота) Glucose + (acid)
Мальтоза + (кислота) Maltose + (acid)
Левулеза +(кислота) Levuleza + (acid)
Ферментативная активность Биохимический Манноза + (кислота) Mannose + (acid)
Enzymatic activity Biochemical Глицерин -Glycerin -
Цитруллин -Citrulline -
Сероводород + Hydrogen sulfide +
Индол -Indole -
Антигенные свойства Antigenic properties Серологический, реакция агглютинации Serological, agglutination reaction Агглютинация (крупнохлопчатый агглютинат) до титра сыворотки туляремийной Agglutination (coarse agglutinate) up to the titer of tularemia serum
Чистота культуры Purity of the culture Отсутствие посторонних бактерий и грибов Absence of foreign bacteria and fungi чистая культура туляремийного микроба Pure culture of the tularemia microbe
остаточная вирулентность Residual virulence Биологический Biological от 1102 до 5 103 м.к. from 1102 to 5 103 m.c.
Иммуногенность Immunogenicity Биологический Biological ЕД50 - не более 1000 м.к. ED50 - no more than 1000 m.c.
генетические свойства Genetic properties пцр PCR Наличие генетических маркеров: iglBC, fopA и др. (вид Francisella tularensis), Ft-M19, ISFtu2 и др. (подивид holarctica), A526 п.н. pilA-pilE, Д1480 п.н Ipp, SNP C178404T (штамм 15 НИИЭГ) Presence of genetic markers: iglBC, fopA, etc. (Francisella tularensis species), Ft-M19, ISFtu2, etc. (subspecies holarctica), A526 b.p. pilA-pilE, A1480 b.p. lpp, SNP C178404T (strain 15 NIIEG)
Генетическая стабильность Genetic stability ERIC, RAPD, полногеномное секвенирование ERIC, RAPD, whole genome sequencing Специфичные ERIC и RAPD-профили, набор SNP и других мутаций Specific ERIC and RAPD-profiles, a set of SNPs and other mutations
ЯЛ19) и генах, кодирующих липопротеин (ЯЛ18), которые выявлены ранее при получении и анализе нуклеотидной последовательности полного генома штаммов Е. tularensis 15 НИИЭГ и LVS [24]. Все это указывает на перспективность использования указанных генетических маркеров для оценки аутентичности вакцинного штамма с помощью молекулярно-генетических методов [25].
Далее нами изучена стабильность определенных ранее единичных мутаций у вакцинного штамма: АС1169122, G1518663T и С178404Т (по
геному штамма F. tularensis LVS, GenBank NCBI № CP009694). Для подтверждения уникальности указанных полиморфизмов для вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ проведен их поиск в 1025 геномах туляремийного микроба, представленных в базе данных GenBank NCBI. Анализ осуществляли с помощью программы snippy v.4.6.01025, сравнивая последовательности в формате fasta с ре-ференсным геномом штамма F. tularensis LVS [26].
Из описанных выше мутаций только C178404T оказалась специфичной для вакцинного штамма.
Мутации ЛС1169122, G1518663T по данным проведенного анализа встречались в геномах штаммов туляремийного микроба в 73 и 97 % соответственно. Замена C178404T дополнительно выявлена в геноме штамма F. tularensis Tul-161_KZ (GenBank NCBI № JAFCSH010000000), который, по уточненным данным V. Shevtsov et al. [27], представляет собой штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, хранящийся в коллекции Национального научного центра особо опасных инфекций имени М. Айкимбаева Министерства здравоохранения Республики Казахстан. При картировании ридов F. tularensis 15 НИИЭГ на референс-ный геном F. tularensis LVS оказалось, что данная мутация встречалась в 100 % ридов.
Полученные результаты указывают на перспективность использования полиморфизма C178404T при определении аутентичности вакцинного штамма. В связи с этим нами дополнительно к анализу in silico проведена оценка стабильности мутации C178404T in vitro при исследовании референсных штаммов туляремийного микроба различных подвидов, био-варов и субпопуляций: KM3 - подвид holarctica био-вар EryS, KM4 - подвид mediasiatica, KM5 - подвид holarctica биовар japonica, KM6 - подвид tularensis субпопуляция AII, KM7 - подвид tularensis субпопуляция AI, KM8 - подвид holarctica биовар EryR [28] -и штамма подвида novicida Utah 112. Амплификацию фрагмента, содержащего мутацию, осуществляли с использованием подобранных с помощью программы GeneRunner 6.5.52. праймеров: snpC-T_f 5'-ACATAATCTTAACTTGCTCAGC-3'; snpC-T_r 5'-ATCGCTATAGTGGTAATGG-3'. Установлено, что у всех изученных штаммов туляремийного микроба, кроме вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, вне зависимости от подвида, биовара и субпопуляции, в позиции 178404 (по последовательности F. tularensis LVS, GenBank NCBI № CP009694) находился нуклеотид С, тогда как у вакцинного - нуклео-тид Т (рисунок).
Полученные данные указывают на перспективность использования описанных выше делеций в регионах RD18/RD19 в совокупности с мутацией C178404T для оценки аутентичности вакцинно-
го штамма с помощью молекулярно-генетических методов.
Для определения генетической стабильности F. tularensis 15 НИИЭГ дополнительно к ERIC- и RAPD-типированию представляется перспективным использование полногеномного секвенирования. Предложенный подход при наличии технической возможности выполнения позволит в полной мере оценить изменения в геноме вакцинного штамма и определить его аутентичность в процессе хранения в лиофилизированном состоянии, при анимализации и подготовке последующей серии вакцинного штамма. В дальнейшем предстоит определить место и роль молекулярно-генетических методов на всех технологических этапах производства вакцины ту-ляремийной живой.
производство вакцины туляремийной живой осуществляется с использованием лиофилизирован-ной культуры эталонной линии вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, изученной по основным показателям перед началом каждого производственного цикла (таблица). Особо хотелось бы отметить необходимость перед воспроизведением культуры вакцинного штамма на базе предприятия - изготовителя туляремийной вакцины его анимализации путем пассажа через организм морской свинки. Как пример, в омске без проведения анимализации на животных в 2001 г. была изготовлена новая серия штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, которая не соответствовала нормативным требованиям по показателю «Специфическая активность»: завышена концентрация - 250 1010 микробных клеток/мл, снижена жизнеспособность микробных клеток и иммуноген-ность, что привело к выбраковке серии.
Учитывая вышеизложенное, сотрудниками специализированной лаборатории ГИСК им. Л.А. Та-расевича предложены методические подходы по проведению анимализации вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ и рекомендовано включить их в промышленный регламент производства. введение данного этапа позволило получить серию вакцинного штамма в 2003 г., которая полностью соответствовала установленным требованиям и ис-
Анализ фрагмента генома штаммов туляремийного микроба различных подвидов, биоваров, субпопуляций и вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, содержащего мутацию C178404T (по нуклеотидной последовательности F. tularensis LVS, GenBank NCBI № CP009694):
КМ-3 - подвид holarctica биовар Ery5; KM-4 - подвид mediasiatica; KM-5 - подвид holarctica биовар japonica; KM-6 - подвид tularensis субпопуляция AII; KM-7 - подвид tularensis субпопуляция AI; KM-8 - подвид holarctica биовар EryR; Utah 112 - подвид novicida
Analysis of the genome fragment of tularemia microbe strains of various subspecies, biovars, subpopulations and vaccine strain F. tularensis 15 NIIEG containing the C178404T mutation (according to the sequence of F. tularensis LVS GenBank NCBI No. CP009694):
KM-3 - subspecies holarctica biovar Ery5; KM-4 - subspecies mediasiatica; KM-5 - subspecies holarctica biovar japonica; KM-6 - subspecies tularensis subpopulation AII; KM-7 - subspecies tularensis subpopulation AI; KM-8 - subspecies holarctica biovar EryR;Utah 112 - subspecies novicida
пользовалась при производстве туляремийной живой вакцины с 2004 г.
для подтверждения стабильности основных свойств вакцинного штамма необходимо предусмотреть проведение его постоянного изучения в течение регламентируемого срока годности (10 лет). В случае выявления изменений нормы показателей, характеризующих штамм как вакцинный, следует принимать своевременные меры для восстановления или подтверждения типичных фенотипических, генетических и иммунобиологических свойств.
Кроме этого, обобщена информация о надлежащих условиях проведения работ и хранении вакцинного штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ. Работы по изготовлению вакцинного штамма должны выполняться в производственных помещениях, соответствующих правилам надлежащей производственной практики ^МР). Работы по контролю вакцинного штамма необходимо осуществлять в специальном помещении, где не проводят работы и хранение с использованием иных биологических агентов, в том числе с ПБА 1-^ групп патогенности. К работе с вакцинным штаммом допускается квалифицированный персонал, владеющий методами пассирования, изготовления и контроля вакцинного штамма. Персонал, непосредственно занятый в изготовлении штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ, должен быть привит вакциной туляремийной живой и проходить периодические медицинские осмотры в сроки, утвержденные руководителем предприятия - изготовителя препарата.
Ампулы с лиофилизированными эталонной и производственной культурами вакцинного штамма хранятся в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов Ш-^ групп патогенности ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России в отдельно выделенном помещении, где не хранятся другие культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты, в морозильной камере при температуре не выше минус 20 °С. Не допускается хранение в одной морозильной камере вакцинных штаммов других видов микроорганизмов. Металлические пеналы и морозильные камеры, в которых хранится эталонная линия вакцинного штамма, должны быть опечатаны печатями сотрудников, осуществляющих оценку качества туляремийной вакцины живой, и Государственной коллекции патогенных микроорганизмов Ш-^ групп патогенности.
Таким образом, проведенный ретроспективный анализ материалов о культурах вакцинного штамма туляремийного микроба с 1940-х по 2013 год и экспериментальные данные, полученные в последние годы, позволили дополнить новыми сведениями единые требования изготовления, изучения, поддержания, хранения и движения (выдачи) вакцинного штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ к организациям, осуществляющим производство и выпуск препаратов для профилактики и диагностики туляремии, выполняющим контроль их качества и безопасности,
а также к специалистам учреждений, проводящих научные исследования по разработке профилактических и диагностических противотуляремийных препаратов.
На основании проведенных исследований и полученных результатов коллективом авторов (ФГБУ НЦЭСП Минздрава России, ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) разработан проект методических рекомендаций федерального уровня «Вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ: порядок обращения».
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России № 056-00001-22-00 на проведение прикладных исследований (номер государственного учета НИР 121022000147-4).
список литературы
1. Гайский Н.А., Эльберт Б.Я. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.
2. Гайский Н.А., Хижинская О.П. Первые итоги применения живой туляреминой вакцины. Известия Иркутского государственного противочумного института Сибири и Дальнего Востока. 1946; 6:10-5.
3. Сиротюк Л.В. Биологические свойства туляремийных вакцинных штаммов НИИЭГ. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1964; 10:116-20.
4. Олсуфьев Н.Г., Емельянова О.С., Угловой Г.П., Салтыков Р.А., Сиротюк Л.В., Сильченко В.С., Капцын М.С., Левачева З.А., Кочуркова С.А., Бобылкова Т.В., Баранчиков В.Д., Веденеева Е.В., Егорова Л.С., Иванов В.С., Баранова Н.К., Денисова В.Д., Шельмовер Р.С., Хомутова Н.В., Куцерыб Г.Г., Панышева М.Д., Пелехова К.И., Красицкая З.И., Назарова М.Г., Красникова Е.И., Штучная A.A., Владимирова А.И., Коржева В.С. Сравнительное испытание на людях вариантов вакцинного туляремийного штамма 15 Гайского. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1971; 5:55-7.
5. Олсуфьев Н.Г. Итоги и перспективы изучения и применения в СССР живой туляремийной вакцины. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1967; 5:3-10.
6. Pasetti M.F., Cuberos L., Horn T.L., Shearer J.D., Matthews S.J., House R.V., Sztein M.B. An improved Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) is well tolerated and highly immunogenic when administered to rabbits in escalating doses using various immunization routes. Vaccine. 2008; 26(14):1773-85.
7. Barry E.M., Cole L.E., Santiago A.E. Vaccines against tularemia. Hum. Vaccin. 2009; 5(12):832-8. DOI: 10.4161/ hv. 10297.
8. Marohn M.E., Barry E.M. Live attenuated tularemia vaccines: recent developments and future goals. Vaccine. 2013; 31(35):3485-91. DOI: 10.1016/j.vaccine.201l05.096.
9. Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Олефир Ю.В. Современное состояние вакцинопрофилактики особо опасных инфекций. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 2:107-10. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-107-110.
10. WHO Technical Report Series No. 927. WHO Expert Committee On Biological Standardization (54th report). Geneva, 2005. [Электронный ресурс]. URL: https://www.who.int/ publications/i/item/9241209275^
11. de la Puente-Redondo V.A., del Blanco N.G., Gutiérrez-Martín C.B. García-Peña F.J., Rodríguez Ferri E.F. Comparison of different PCR approaches for typing of Francisella tularensis strains. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(3):1016-22. DOI: 10.1128/ JCM.38.3.1016-1022.2000.
12. Sunagar R., Kumar S., Franz B.J., Gosselin E.J. Tularemia vaccine development: paralysis or progress? Vaccine (Auckl). 2016; 6:9-23. DOI: 10.2147/VDTS85545.
13. Reed D.S., Smith L.P., Cole K.S., Santiago A.E Mann B.J., Barry E.M. Live attenuated mutants of Francisella tularensis protect rabbits against aerosol challenge with a virulent type A strain. Infect. Immun. 2014; 82(5):2098-105. DOI: 10.1128/IAI.01498-14.
14. WHO good manufacturing practices for biological products, Annex 2, TRS No. 999. [Электронный ресурс]. URL: https:// www.who.int/publications/m/item/annex-2-trs-no-999-WHO-gmp-for-biological-products.
15. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество. СПб.: ЦОП «Профессия»; 2017. 768 с.
16. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.
17. Соловьев Е.А., Саяпина Л.В. Осина Н.А., Давыдов Д.С., Бондарев В.П. Характеристика фенотипических и генетических свойств вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ с длительными сроками хранения. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; 4:91-5. DOI: 10.21055/0370-1069-20152-91-95.
18. Саяпина Л.В., Соловьев Е.А., Горяев А.А., Бондарев В.П. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ в условиях длительного хранения. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; 2:87-91. DOL 10.21055/0370-1069-2015-2-87-91.
19. Саяпина Л.В., Хорева И.И., Байдалова Н.П., Горяев А.А., Давыдов Д.С., Поступайло В.Б., Меркулов В.А. Оценка остаточной вирулентности вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ по данным многолетних наблюдений. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 1:98-102. DOI: 10.21055/0370-10692018-1-98-102.
20. Мещерякова И.С. Туляремия: современная эпидемиология и вакцинопрофилактика (к 80-летию создания первой ту-ляремийной лаборатории в России). Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010; 2:17-22.
21. Избанова У.А., Куница Т.Н., Лухнова Л.Ю. Достижения в области специфической профилактики туляремии. Medicine (Almaty). 2016; 10:49-59.
22. Stinson E., Smith L.P., Cole K.S., Barry E.M., Reed D.S. Respiratory and oral vaccination improves protection conferred by the live vaccine strain against pneumonic tularemia in the rabbit model. Pathog. Dis. 2016; 74(7):ftw079. DOI: 10.1093/femspd/ ftw079.
23. O'Malley K.J., Bowling J.D., Stinson E., Cole K.S., Mann B.J., Namjoshi P., Hazlett K.R.O., Barry E.M., Reed D.S. Aerosol prime-boost vaccination provides strong protection in outbred rabbits against virulent type A Francisella tularensis. PLoS One. 2018; 13(10):e0205928. DOI: 10.1371/journal.pone.0205928.
24. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Byström M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11):3903-8. DOI: 10.1128/ JB.187.11.3903-3908.2005.
25. Нарышкина Е.А., Краснов Я.М., Альхова Ж.В., Баданин Д.В., Осин А.В., Ляшова О.Ю., Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Олефир Ю.В., Кутырев В.В. Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 2:91-7. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-91-97.
26. Seemann T Snippy: fast bacterial variant calling from NGS reads. 2015. [Электронный ресурс]. URL: https://github.com/ tseemann/snippy?ysclid=l8bilbj7rp802266956.
27. Shevtsov V., Kairzhanova A., Shevtsov A., Shustov A., Kalendar R., Abdrakhmanov S., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Vergnaud G. Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in Kazakhstan. PLoS Negl. Trop. Dis. 2021; 15(5):e0009419. DOI: 10.1371/journal.pntd.0009419.
28. Осина Н.А., Уткин Д.В., Сеничкина А.М., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор штаммов бактерий вида Francisella tularensis для получения комплекта контрольных ДНК препаратов, комплект ДНК препаратов для генно-диагностических исследований. Патент РФ № 2443772, опубл. 27.02.2012. Бюл. № 6.
References
1. Gaisky N.A., Elbert B.Ya. [On the mechanism of infection and immunity in experimental tularemia]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1941;(12):37-42.
2. Gaisky N.A., Khizhinskaya O.P. [The first results of the use of live tularemia vaccine]. Izvestiya Irkutskogo Gosudarstvennogo Protivochumnogo Instituta Sibiri i Dal'nego Vostoka [Proceedings of the Irkutsk State Anti-Plague Institute of Siberia and Far East]. 1946; (6):10-5.
3. Sirotyuk L.V. [Biological properties of tularemia vaccine strains NIIEG]. ¿.hurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1964; (10):116-20.
4. Olsufiev N.G., Emelyanova O.S., Uglovoi G.P., Saltykov R.A., Sirotyuk L.V, Sil'chenko V.S., Kaptsyn M.S., Levacheva Z.A., Kochurkova S.A., Bobylkova T.V., Baranchikov V.D., Vedeneeva E.V., Egorova L.S., Ivanov V.S., Baranova N.K., Denisova V.D., Shelmover R S., Khomutova N.V., Kutseryb G.G., Panysheva M.D., Pelekhova K.I., Krasitskaya Z.I., Nazarova M.G., Krasnikova E.I.,
Shtuchnaya A.A., Vladimirova A.I., Korzheva V.S. [Comparative human trial of variants of Gaisky tularemia vaccine strain 15]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1971; (5):55-7.
5. Olsuf'ev N.G. [Results and prospects of studying and using the live tularemia vaccine in the USSR]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1967; (5):3-10.
6. Pasetti M.F., Cuberos L., Horn T.L., Shearer J.D., Matthews S.J., House R.V., Sztein M.B. An improved Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) is well tolerated and highly immunogenic when administered to rabbits in escalating doses using various immunization routes. Vaccine. 2008; 26(14):1773-85.
7. Barry E.M., Cole L.E., Santiago A.E. Vaccines against tularemia. Hum. Vaccin. 2009; 5(12):832-8. DOI: 10.4161/hv.10297.
8. Marohn M.E., Barry E.M. Live attenuated tularemia vaccines: recent developments and future goals. Vaccine. 2013; 31(35):3485-91. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.05.096.
9. Sayapina L.V., Bondarev V.P., Olefir Yu.V. [The current state of vaccinal prevention of particularly dangerous infections]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; (2):107-10. DOI: 10.21055/0370-1069 -2016-2-107-110.
10. WHO Technical Report Series No. 927. WHO Expert Committee on Biological Standardization (54th report). Geneva, 2005. [Internet]. Available from: https://www.who.int/publications/i/ item/9241209275.
11. de la Puente-Redondo V.A., del Blanco N.G., Gutiérrez-Martín C.B. García-Peña F.J., Rodríguez Ferri E.F. Comparison of different PCR approaches for typing of Francisella tularensis strains. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(3):1016-22. DOI: 10.1128/ JCM.38.3.1016-1022.2000.
12. Sunagar R., Kumar S., Franz B.J., Gosselin E.J. Tularemia vaccine development: paralysis or progress? Vaccine (Auckl). 2016; 6:9-23. DOI: 10.2147/VDTS85545.
13. Reed D.S., Smith L.P., Cole K.S., Santiago A.E., Mann B.J., Barry E.M. Live attenuated mutants of Francisella tularensis protect rabbits against aerosol challenge with a virulent type A strain. Infect. Immun. 2014; 82(5):2098-105. DOI: 10.1128/LAI.U1498-14.
14. WHO good manufacturing practices for biological products, Annex 2, TRS No. 999. [Internet! Available from: https://www. who.int/publications/m/item/annex-2-trs-no-999-WHO-gmp-for-biological-products.
15. [ICH Guidelines for the Pharmaceutical Industry. Quality]. St. Petersburg; 2017. 768 p.
16. [State Pharmacopoeia of the Russian Federation]. XIV ed. Moscow; 2018.
17. Solov'ev E.A., Sayapina L.V., Osina N.A., Davydov D.S., Bondarev V.P. [Characterization of phenotypic and genetic properties of Francisella tularensis vaccine strain 15 NIIEG with long shelf life]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2015; (4):91-5. DOI: 10.21055/0370-106918. Sayapina L.V., Solov'ev E.A., Goryaev A.A., Bondarev V.P.
[Study of the immunobiological properties of the vaccine strain Francisella tularensis 15 NIIEG under long-term storage conditions]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2015; 2:87-91. DOI: 10.21055/0370-10692015-2-87-91.
19. Sayapina L.V., Khoreva I.I., Baidalova N.P., Goryaev
A.A., Davydov D.S., Postupailo V.B., Merkulov V.A. [Evaluation of the residual virulence of the vaccine strain Francisella tularen-sis 15 NIIEG based on long-term observations]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2018; (1):98-102. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-98-102.
20. Meshcheryakova I.S. [Tularemia: modern epidemiology and vaccination (on the occasion of the 80th anniversary of the creation of the first tularemia laboratory in Russia)]. Epidemiologia I Vaktsynoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2010;
21. Izbanova U.A., Kunitsa T.N., Lukhnova L.Yu. [Advances in specific prevention of tularemia]. Medicine (Almaty). 2016; (10):49-59.
22. Stinson E., Smith L.P., Cole K.S., Barry E.M., Reed D.S. Respiratory and oral vaccination improves protection conferred by the live vaccine strain against pneumonic tularemia in the rabbit model. Pathog. Dis. 2016; 74(7):ftw079. DOI: 10.1093/femspd/ ftw079.
23. O'Malley K.J., Bowling J.D., Stinson E., Cole K.S., Mann
B.J., Namjoshi P., Hazlett K.R.O., Barry E.M., Reed D.S. Aerosol prime-boost vaccination provides strong protection in outbred rabbits against virulent type A Francisella tularensis. PLoS One. 2018; 13(10):e0205928. DOI: 10.1371/journal.pone.0205928.
24. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Byström M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11):3903-8. DOI: 10.1128/ JB.187.11.3903-3908.2005.
25. Naryshkina E.A., Krasnov Ya.M., Al'khova Zh.V., Badanin D.V., Osin A.V., Lyashova O.Yu., Sayapina L.V., Bondarev V.P., Merkulov V.A., Olefir Yu.V., Kutyrev V. V. [Whole-genome sequencing and phytogenetic analysis of Francisella tularensis vaccine strain 15 NIIEG]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; (2):91-7. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-91-97.
26. Seemann T Snippy: fast bacterial variant calling from NGS reads. 2015. [Internet]. Available from: https://github.com/tseemann/ snippy?ysclid=l8bilbj7rp802266956.
27. Shevtsov V., Kairzhanova A., Shevtsov A., Shustov A., Kalendar R., Abdrakhmanov S., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Vergnaud G. Genetic diversity of Francisella tula-rensis subsp. holarctica in Kazakhstan. PLoS Negl. Trop. Dis. 2021; 15(5):e0009419. DOI: 10.1371/journal.pntd.0009419.
28. Osina N.A., Utkin D.V., Senichkina A.M., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V. [A panel of bacterial strains of the Francisella tularensis species for obtaining a set of control DNA preparations, a set of DNA preparations for genetic diagnostic studies]. RF patent No. 2443772, publ. 02/27/2012. Bull. No. 6.
Authors:
Sayapina L.V., Davydov D.S., Bondarev V.P. Scientific Center on Expertise of Medical Application Products. Building 2, 8, Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation.
Osina N.A., Naryshkina E.A., Fedorov A.V., Krasnov Ya.M. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
об авторах:
Саяпина Л.В., Давыдов Д.С., Бондарев В.П. Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский б-р, 8, стр. 2.
Осина Н.А., Нарышкина Е.А., Федоров А.В., Краснов Я.М. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
