Научная статья на тему 'Характеристика фенотипических и генетических свойств вакцинного штамма Francisella tularensis 15 нИИэГ с длительными сроками хранения'

Характеристика фенотипических и генетических свойств вакцинного штамма Francisella tularensis 15 нИИэГ с длительными сроками хранения Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
155
29
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ВАКЦИННЫЙ ШТАММ FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ / F. TULARENSIS 15 NIIEG VACCINE STRAIN / КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ / БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА / BIOCHEMICAL AND GENETIC PROPERTIES / ДИССОЦИАЦИЯ / DISSOCIATION / CULTURAL-MORPHOLOGICAL

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Соловьев Е.А., Саяпина Л.В., Осина Н.А., Давыдов Д.С., Бондарев В.П.

Изучены культурально-морфологические, биохимические и генетические свойства лиофилизированных культур вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, наработанных в течение 60 лет и депонированых в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Проведенные исследования показали, что хранение штаммов в лиофилизированном состоянии при пониженной температуре не в полной мере предохраняет их от изменения генетических и фенотипических свойств. Установлено, что штамм F. tularensis 15 НИИЭГ1953, 1966, 1969, 2003 и 2012 гг. высушивания при культивировании на питательной среде Ft-агар с добавлением крови и без нее по степени диссоциации (87-99 %) SR-колоний сохранял свои иммуногенные свойства. При этом штамм 1990 г. содержал нормированное количество (не менее 80 %) иммуногенных колоний на питательной среде с добавлением крови и не соответствовал требованиям без крови. Выявленное снижение от 70 до 75 % SR-колоний у штамма 1987 г. при культивировании с добавлением крови и без нее свидетельствует о снижении его иммуногенных свойств. По данным RAPD и ERIC типирования, показана высокая стабильность генома лиофилизированных в разные годы культур F. tularensis 15 НИИЭГ. Вакцинный штамм туляремийного микроба имеет уникальные RAPD и ERIC профили, незначительное изменение которых отмечено при хранении субкультуры патогена в высушенном состоянии.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Соловьев Е.А., Саяпина Л.В., Осина Н.А., Давыдов Д.С., Бондарев В.П.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Characteristics of Phenotypic and Genetic Properties of Francisella tularensis 15 NIIEG Vaccine Strain with an Extended Storage Period

Investigated have been cultural-morphological, biochemical and genetic properties of lyophilized cultures of F. tularensis 15 NIIEG vaccine strain, accumulated within 60-years term and deposited at the State Collection of Pathogenic Microorganisms of Scientific Center on Expertise of Medical Application Products. The studies undertaken have demonstrated that storing of the strains in such a form at low temperatures, does not prevent changes of their genetic and phenotypic properties to the full extent. It is established that F. tularensis 15 NIIEG strain lyophilized in 1953, 1966, 1969, 2003 and 2012 maintains its immunogenic properties when cultivated on nutrient media Ft-agar with or without addition of blood, based on dissociation rates (87-99 %) of SR-colonies. While F. tularensis 15 NIIEG strain 1990 contains specified amounts (not less than 80 %) of immunogenic colonies if cultivated on nutrient media with the addition of blood, and fails to meet the requirements if cultivated without. Identified in F. tularensis 15 NIIEG strain 1987 SR-colony decrement of 70-75 % in case of cultivation with or without addition of blood testifies to the deterioration of its immunogenic properties. RAPD and ERIC typing has showed high stability of the genome of F. tularensis 15 NIIEG cultures lyophilized at different times. Tularemia microbe vaccine strain has unique RAPD and ERIC profiles, insignificant alteration of which is observed upon storage of pathogen subculture in the dried from.

Текст научной работы на тему «Характеристика фенотипических и генетических свойств вакцинного штамма Francisella tularensis 15 нИИэГ с длительными сроками хранения»

УДК616.98:579.841.95

Е.А.Соловьев1, Л.В.Саяпина1, Н.А.Осина2, Д.С.Давыдов1, В.П.Бондарев1

характеристика фенотипических и генетических свойств вакцинного штамма

FRANCISELLA TULARENSIS 15 нииЭГ С длительными сроками хранения

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России», Москва, Российская Федерация; 2ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт

«Микроб», Саратов, Российская Федерация

Изучены культурально-морфологические, биохимические и генетические свойства лиофилизированных культур вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, наработанных в течение 60 лет и депонированых в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Проведенные исследования показали, что хранение штаммов в лиофилизированном состоянии при пониженной температуре не в полной мере предохраняет их от изменения генетических и фенотипических свойств. Установлено, что штамм F. tularensis 15 НИИЭГ1953, 1966, 1969, 2003 и 2012 гг. высушивания при культивировании на питательной среде Ft-агар с добавлением крови и без нее по степени диссоциации (87-99 %) SR-колоний сохранял свои иммуногенные свойства. При этом штамм 1990 г. содержал нормированное количество (не менее 80 %) иммуногенных колоний на питательной среде с добавлением крови и не соответствовал требованиям без крови. Выявленное снижение от 70 до 75 % SR-колоний у штамма 1987 г. при культивировании с добавлением крови и без нее свидетельствует о снижении его иммуногенных свойств. По данным RAPD и ERIC типирования, показана высокая стабильность генома лиофилизированных в разные годы культур F. tularensis 15 нИИэГ. вакцинный штамм туляремийного микроба имеет уникальные RAPD и ERIC профили, незначительное изменение которых отмечено при хранении субкультуры патогена в высушенном состоянии.

Ключевые слова: вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ, культурально-морфологические, биохимические и генетические свойства, диссоциация.

E.A.Solov'ev1, L.V.Sayapina1, N.A.Osina2, D.S.Davydov1, V.P.Bondarev1

Characteristics of Phenotypic and Genetic Properties of Francisella tularensis 15 NIIEG Vaccine Strain with an Extended Storage Period

1Scientific Center on Expertise of Medical Application Products, Moscow, Russian Federation; 2Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation

Investigated have been cultural-morphological, biochemical and genetic properties of lyophilized cultures of F. tularensis 15 NIIEG vaccine strain, accumulated within 60-years term and deposited at the State Collection of Pathogenic Microorganisms of Scientific Center on Expertise of Medical Application Products. The studies undertaken have demonstrated that storing of the strains in such a form at low temperatures, does not prevent changes of their genetic and phenotypic properties to the full extent. It is established that F. tularensis 15 NIIEG strain lyophilized in 1953, 1966, 1969, 2003 and 2012 maintains its immunogenic properties when cultivated on nutrient media Ft-agar with or without addition of blood, based on dissociation rates (87-99 %) of SR-colonies. While

F. tularensis 15 NIIEG strain 1990 contains specified amounts (not less than 80 %) of immunogenic colonies if cultivated on nutrient media with the addition of blood, and fails to meet the requirements - if cultivated without. Identified in F. tularensis 15 NIIEG strain 1987 SR-colony decrement of 70-75 % in case of cultivation with or without addition of blood testifies to the deterioration of its immunogenic properties. RAPD and ERIC typing has showed high stability of the genome ofF. tularensis 15 NIIEG cultures lyophilized at different times. Tularemia microbe vaccine strain has unique RAPD and ERIC profiles, insignificant alteration of which is observed upon storage of pathogen subculture in the dried from.

Key words: F. tularensis 15 NIIEG vaccine strain, cultural-morphological, biochemical and genetic properties, dissociation.

Возбудитель туляремии Francisella tularensis обладает высокой устойчивостью во внешней среде, множественностью путей передачи, вирулентностью и контагиозностью, что представляет значительную угрозу для населения. Разработка Б.Я.Эльбертом и Н.А.Гайским в 1934 г. высокоэффективной живой ту-ляремийной вакцины и дальнейшее ее использование в СССР позволило снизить ежегодную заболеваемость туляремией с десятков тысяч случаев до уровня спорадической, а также увеличить средний период между вспышками с трех до десяти лет [2, 8, 9].

Вместе с тем изменяющиеся особенности эпизоотического и эпидемического проявлений в

современных условиях антропогенной трансформации окружающей среды, широкое распространение и устойчивость природных очагов туляремии в России сохраняют актуальность данной проблемы для здравоохранения. Как следствие - снижение в последние годы числа вакцинированных людей, резкая урбанизация заболеваемости туляремией. На долю городского населения приходится от 70 до 80 % от числа больных туляремией. В России в 1995 г. зарегистрировано 379 случаев, в 2005 г. - 881 случай на территории 35 субъектов; в 2013 г. только в Ханты-Мансийском автономном округе заболело 1015 человек [3, 7].

Известно, что изготовление живых вакцин требует систематического наблюдения за стабильностью вакцинных штаммов из-за возможных изменений их свойств, в процессе хранения и производства препарата [5]. Некоторые исследователи считают, что применение туляремийной вакцины в течение столь длительного периода привело не только к изменению свойств первоначально полученной вакцины, но и в значительной степени увеличило риск утраты вакцинного штамма [1, 4]. Данное положение подтверждается тем, что используемый на протяжении многих лет штамм Е tularensis 15 и 15 НИИЭГ неоднократно подвергался восстановлению иммуногенных свойств (например, в 1954, 1962, 1990, 2003 гг.).

В литературе описан случай производства вакцины из лиофилизированного штамма Е. tularensis 15, хранившегося в течение 12 лет без должного изучения его свойств, что привело к практически полной его диссоциации (количество иммуногенных клеток в вакцине составляло всего 2-3 %). В связи с этим потребовалось длительное восстановление его иммуногенных свойств путем многократного пассирования на животных, после чего он использовался в производстве как «штамм Е. tularensis 15 - восстановленный» [6].

на основании многолетнего изучения сохранности основных свойств вакцинного штамма при хранении в условиях температурного режима -18 °С, установлен срок его годности в течение 10 лет. Однако до сих пор сравнительных исследований культур штамма, лиофилизированных в разное время и хранящихся в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, не проводилось.

Учитывая вышеизложенное, целью настоящего исследования явилось изучение стабильности культурально-морфологических, биохимических и генетических свойств культур штамма Е. tиlаrепsis 15 НИИЭГ различных лет высушивания (более 60 лет), применявшегося в производстве живой туляре-мийной вакцины.

Материалы и методы

В работе изучены 8 лиофилизированных культур штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ, находящихся в государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России и имеющих различные сроки хранения (от 1 года до 60 лет) при температуре не менее -18 °с.

Перед проведением исследования культурально-морфологических свойств, включая степень диссоциации, лиофилизированные культуры штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ ресуспендировали 0,9 % раствором натрия хлорида и культивировали при температуре (37±1) °С в течение 48 ч на питательной среде FT-агар как с добавлением 5 % дефибринированной крови барана, так и без нее. Все исследования проводили с использованием культуры II пассажа.

для определения ферментативной активности

культур, в том числе образования сероводорода и индола, использовали питательную среду Dawns, модульный анализатор бактериологический bioMerieux «VITEK® 2 Systems», аналитические карты типа bioMerieux GN (21341) и системы индикаторные бумажные (СИБ) коммерческого производства.

Серологические свойства штаммов изучали в реакции агглютинации с применением ОСО 42-28409-09 сыворотки диагностической туляремийной сухой для реакции агглютинации.

ERIC- и RAPD-типирования культур туляре-мийного микроба проводили в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» с использованием праймеров ERIC IR, ERIC II, Universal M13, T3, T7, предложенные V.A. de la Puente-Redondo et al. [10]. Работу выполняли в соответствии с рекомендациями авторов: реакционная смесь содержала праймеров в количестве 15 пМоль, дНТФ - 0,2 мМоль, ионов Mg2+ - 2,5 мМоль, фермента DreamTaq-ДНК-полимеразы (Fermentas, США) -4 ед., программа для праймеров ERIC IR, ERIC II -95 °С - 5 мин, 90 °С - 30 с, 50 °С - 30 с, 52 °С -1 мин, 72 °С - 1 мин (30 циклов) 72 °С - 8 мин; для праймеров Universal M13, T3, T7 - 94 °С - 5 мин, 94 °С - 5 мин, 40 °С - 5 мин, 72 °С - 5 мин (2 цикла) 94 °С - 1 мин, 60 °С - 1 мин, 72 °С - 1 мин (35 циклов) 72 °С - 5 мин. Амплификацию осуществляли на термоциклере Veriti (LifeTechology, США), учет результатов проводили в 2 % агарозном геле при градиенте напряжения 5 В/см в течение 2 ч.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов подтверждали в соответствии с требованиями ОФС 42-0066-07 методом прямого посева на тио-гликолевую среду в условиях инкубирования посевов при температурах от 30 до 35 °С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, от 20 до 25 °С для выявления грибов. После инкубирования проводили оценку однородности тинкториальных свойств культур и микроскопию мазков. Обработку результатов исследований осуществляли с помощью общепринятых статистических методов.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований установлено, что внешний вид всех лиофилизированных культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ в ампулах имел вид пористой массы белого с желтоватым оттенком цвета, что соответствует нормативным требованиям по данному показателю. Фенотипические свойства культур вакцинного штамма разных лет высушивания приведены в таблице.

Сравнительное изучение культурально-морфо-логических свойств показало, что на FT-агаре (с кровью и без крови) после инкубирования при температуре (37±1) °С в течение 48 ч все культуры штамма F. tularensis 15 НИИЭГ вырастали в виде беловато-серых, блестящих, круглых колоний. Отмечено, что на FT-агаре с добавлением дефибринированной крови колонии были более однородными, диаметром от

Результаты изучения культурально-морфологических свойств вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ разных лет высушивания

Наименование показателя Норма Год высушивания штамма

1953 1966 1969 1987 1990 2003 2012 2013

Диссоциация колоний на Ft-агаре с кровью ЗЯ-колоний не менее 80 % 91 97 93 75 82 87 95 95

Диссоциация колоний на Ft-агаре без крови 76 93 92 70 68 91 94

Количество выросших колоний на Ft-агаре с кровью Не менее 40 % (из 100 м.к./0,1 мл) 94±8,6 99±14,5 86±13,3 101±14,9 98±5,2 93±3,8 91±7,5

Количество выросших колоний на Ft-агаре без крови Не менее 40 % (из 100 м.к./0,1 мл) 76±12,7 97±11,1 76±11,4 80±11,3 94±8,6 61±4,4 118±5,3

Значение критерия Стьюдента**, рассчитанное по экспериментальным данным tэr£п t б =2,306 (дляУ=8 и Р>0,95) 1,17 0,11 0,57 1,12 0,4 5,5 2,94

Отсутствие патогенных микроорганизмов и грибов Чистая культура Е tularensis 15 НИИЭГ (полиморфные Грам «-» коккобактерии) Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Грам «+» кокки, Грам «-» палочки Соответствует

* Не изучалось.

"Значение критерия Стьюдента, рассчитанное по экспериментальным данным для показателя «количество выросших колоний» для культур штамма 1953 г. ^кс =1,17),1966 г. (^=0,11), 1969 г. (^=0,57), 1987 г. (^сп=1,12),1990 г. (^сп=0,4) меньше, чем табличное равное ^=2,306 для числа степеней свободы 7=8 и уровня значимости а=0,05.

1 до 2,5 мм с отчетливо выраженной типичной для туляремийного микроба морфологией, на питательной среде без крови - от 2,5 до 3 мм. В мазках, окрашенных по Граму, все культуры штамма Е tularensis 15 НИИЭГ представляли собой полиморфные грам-отрицательные коккобактерии.

Степень диссоциации штамма Е tularensis 15 НИИЭГ, которую оценивают по формированию при культивировании SR-колоний белого цвета, является важнейшим показателем, свидетельствующим о развитии иммунологических реакций, обеспечивающих формирование полноценного противотуляремийного иммунитета [5].

Проведенными исследованиями установлено, что культуры штамма 1953, 1966, 1969, 2003 и 2012 гг. высушивания имели в своем составе от 87 до 99 % иммуногенных (белые) колоний (норма не менее 80 %) и меньшее количество (от 1 до 13 % соответственно) неиммуногенных (серые) колоний в R-форме. В то же время штамм 1987 г., выращенный на обеих питательных средах, содержал от 70 до 75 % SR-колоний. Выявлено, что штамм 1990 г. высушивания при культивировании на FT-агаре с кровью соответствовал нормативным требованиям по степени диссоциации, а на FT-агаре без крови имел в своем составе 68 % SR-колоний. Рассчитанное по экспериментальным данным для показателя «количество выросших колоний» для культур штаммов, лиофили-зированных в период с 1953 по 1990 год, значение критерия Стьюдента было меньше, чем табличное равное tтaбл=2,306 для числа степеней свободы ^8 и уровня значимости а=0,05. Таким образом, изменение степени диссоциации указанных культур было незначительными, а для культур 2003 и 2012 гг. - статистически значимым (при доверительной вероятности Р>0,95).

Выявление степени иммуногенности по диссоциации разных культур вакцинного штамма имеет большое значение не только для их сравнительной оценки, но и для своевременного выявления измене-

ния иммуногенности штамма, используемого в производстве живой туляремийной вакцины.

При характеристике биохимических свойств культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ на питательной среде Dawns и при использовании коммерческих СИБ и диагностических систем bioMerieux Vitek выявлено, что все они имели типичные для голарктического подвида свойства: ферментировали с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннозу с разной степенью активности и не ферментировали глицерин и мочевину. Исследуемые штаммы образовывали сероводород и не образовывали индол. При этом наблюдалось существенное снижение интенсивности реакций, выявляемых по слабому окрашиванию используемых субстратов. Также нестабильной была ферментативная активность штаммов в отношении маннита, трегалозы, целлобиозы, галактозы и сахарозы. Ложноположительные реакции не выявлены. В целом, совпадение биохимического профиля с типовым для F. tularensis подвида holarctica составило от 90 до 99 % для штаммов, лиофилизиро-ванных в 1963, 1966, 1969, 2003 гг. Ферментативная активность производственных штаммов 1987, 1990 и 2012 гг. высушивания была атипичной и/или слишком низкой для достоверной оценки подлинности.

Нами отмечено, что наиболее активными были культуры штаммов 1953, 1966 и 1969 гг. высушивания, так как при их исследовании наблюдалось наиболее интенсивное желтое окрашивание питательной среды Dawns, что свидетельствует об активности сахаролитических ферментов бактерий. При посеве других культур питательная среда имела слабый желтовато-зеленый цвет. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что исследованные образцы характеризуются пониженной реакционной способностью. Это указывает на необходимость совершенствования методов восстановления культур вакцинного штамма и строгого соблюдения условий культивирования и пробоподготовки.

Антигенные свойства культур штамма F tularensis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 1. Результаты ERIC (А) и RAPD с праймерами Т3-Т7 (Б) титрования культуры F tularensis 15 НИИЭГ с различным сроком хранения в лиофильном состоянии и после двух пассажей на плотной питательной среде (Ft-агар):

1 - маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000); 2 - F tularensis 15 НИИЭГ (1990 г.), нативная культура; 3 - F. tularensis 15 НИИЭГ (1990 г.), 1-й пассаж; 4 - F. tularensis 15 НИИЭГ (1990 г.), 2-й пассаж; 5 - F tularensis 15 НИИЭГ (2003 г.), нативная культура; 6 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2003 г.), 1-й пассаж; 7 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2003 г.), 2-й пассаж; 8 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2012 г.), нативная культура; 9 - F tularensis 15 НИИЭГ (2012 г.), 1-й пассаж; 10 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2012 г.), 2-й пассаж; 11 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2013 г.), нативная культура; 12 - F tularensis 15 НИИЭГ (2013 г.), 1-й пассаж; 13 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2013 г.), 2-й пассаж

15 НИИЭГ изучали с помощью ОСО сыворотки диагностической туляремийной агглютинирующей. Исследование показало идентичность серологических свойств культур, которые агглютинировались ОСО сыворотки туляремийной до титра 1:1600.

Важным производственным показателем, влияющим в дальнейшем на качество живой туляремийной вакцины, является отсутствие в культуре вакцинного штамма посторонней микрофлоры и грибов. Из 8 изученных культур штамма 7 соответствовали предъявляемым требованиям и представляли собой чистую культуру туляремийного микроба, так как в посевах не обнаружен рост посторонних микроорганизмов и грибов (таблица). Испытание не выдержала культура 2012 г. высушивания. В посевах на тиогликолевой среде был выявлен нетипичный для туляремийного микроба рост в виде помутнения среды, хлопьев и осадка. В мазках, окрашенных по Граму, обнаружены грамположительные кокки и грамотрицательные палочки. При повторном испытании новых образцов штамма F. tularensis 15 НИИЭГ подтвердилась контаминация посторонней микрофлорой. Учитывая

Рис. 2. Результаты RAPD с праймером М-13 типирования культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ с различным сроком хранения в лиофильном состоянии и после двух пассажей на плотной питательной среде:

i - маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000); 2 - F. tularensis 15 НИИЭГ (1990 г.), нативная культура, 3 - F. tularensis 15 НИИЭГ (1990 г.); 1-й пассаж; 4 - F. tularensis 15 НИИЭГ (1990 г.) 2-й пассаж; 5 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2003 г.), нативная культура; 6 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2003 г.), 1-й пассаж; 7 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2003 г.), 2-й пассаж; 8 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2012 г.), нативная культура; 9 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2012 г.), 1-й пассаж; i0 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2012 г.), 2-й пассаж; ii - F. tularensis 15 НИИЭГ (2013 г.), нативная культура; 12 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2013 г.), 1-й пассаж; i3 - F. tularensis 15 НИИЭГ (2013 г.), 2-й пассаж

вышеизложенное, было рекомендовано приготовить новую серию производственного штамма.

Результаты исследования культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 1990, 2003, 2012 и 2013 гг. высушивания с помощью ПЦР со случайными праймерами Universal M13, T3, T7 и праймерами на основе последовательности ERIC показали высокую генетическую однородность изученных культур вне зависимости от сроков их хранения (рис. 1, 2).

При RAPD типировании с праймерами Т3-Т7 во всех случаях отмечено формирование фрагментов размером - 1000, 1400, 1900, 2200, 4000 п.н., с праймером Universal M13 - - 750, 900, 1300, 1600, 3000 п.н. При изучении распространения ERIC последовательностей на электрофореграмме выявлены локусы размером - 730, 1500, 1600, 2100, 2800 п.н. Полученные результаты указывают на то, что штамм имеет уникальные RAPD и ERIC профили, которые отличаются от таковых для штаммов туляремийного микроба разных подвидов, полученные V.A. de la Puente-Redondo et al. [10]. При этом данные профили не имели отличий для всех изученных культур. Последующие после вскрытия ампулы, 2-кратные пассажи культур на плотной питательной среде, также не привели к изменению RAPD и ERIC профилей.

Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой стабильности генома лиофилизиро-ванных культур вакцинного штамма при длительном хранении. В ряде случаев при изучении ДНК, выделенной из содержимого ампул, отмечено образование дополнительных фрагментов низкой интенсивности. Однако при исследовании препаратов ДНК, получен-

ных из культур вакцинного штамма, высеянных на плотную питательную среду, формирование таких локусов не зафиксировано. Выявленные отличия могут быть связаны с наличием в лиофилизате незначительного количества погибших клеток туляремий-ного микроба, ДНК которых могла быть подвергнута деградации.

Изучение стабильности культур вакцинного штамма по генетическим свойствам показало, что исследуемые штаммы имеют практически одинаковые ERIC- и RAPD-профили, характерные для штаммов туляремийного микроба подвида holarc-tica. Несмотря на то, что данные подходы не обладают высокой дискриминирующей способностью при исследовании штаммов туляремийного микроба, они в полной мере могут показать возможные изменения в геноме вакцинных штаммов туляремийного микроба под воздействием неблагоприятных факторов при длительном хранении.

Следует также отметить отсутствие в настоящее время единых методических подходов к алгоритму приготовления, изучения, поддержания и хранения живых вакцинных штаммов, что затрудняет проведение подобных работ и интерпретацию полученных данных.

Таким образом, изучение культур вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, хранившихся в лио-филизированном состоянии в течение длительного периода времени (до 60 лет), позволяет сделать заключение, что фенотипические свойства большинства культур штаммов соответствуют современным требованиям, предъявляемым к вакцинному штамму F. tularensis 15 НИИЭГ. Вместе с тем полученные данные свидетельствуют о нестабильности свойств отдельных культур штамма F. tularensis 15 НИИЭГ по культурально-морфологическим свойствам и степени диссоциации в зависимости от состава используемых питательных сред, а также вариабельности единичных фрагментов дНк при длительном хранении.

Отсутствие в настоящее время единых методических требований к поддержанию вакцинных штаммов показывает необходимость разработки документа по алгоритму изготовления, изучения, поддержания и хранения вакцинного штамма F.tиlаrепsis15 НИИЭГ.

Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кисличкин Н.Н., Кисличкина О.И. Живая туляремийная вакцина Nik-sp. Francisella tularensis. Патент РФ № 2308969, опубл. 27.10.2007.

2. Мещерякова И.С. Туляремия: современная эпидемиология и вакцинопрофилактика (к 80-летию создания первой туляре-

мийной лаборатории в России. Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. 2010; 2:17-22.

3. Никифоров В.В., Кареткина Г.Н. Туляремия: от открытия до наших дней. Инф. бол. 2007:5(1):67-76.

4. Олсуфьев Н.Г. Туляремия. М.; 1960. 459 с.

5. Саяпина Л.В., Соловьев Е.А., Горяев А.А., Бондарев В.П. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ в условиях длительного хранения. Пробл. особо опасных инф. 2015; 2:87-91.

6. Сиротюк Л.В. Биологические свойства туляремийных вакцинных штаммов НИИЭГ. Журн. микробиол., эпидемиол и иммунобиол. 1964; 10:116-20.

7. Транквилевский Д.В., Удовиков А.И., Попов В.П., Захаров К.С., Попов Н.В., Безсмертный В.Е. Состояние численности грызунов и эпидемиологическая обстановка по туляремии на территории Российской Федерации во втором полугодии 2014 г. и прогноз на 2015 г. Пробл. особо опасных инф. 2015: 1:30-5.

8. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(40J:631-46.

9. Cole L.E., Elkins K.L., Michalek S.M., Qureshi N., Eaton L.J., Rallabhandi P Cuesta N., Vogel, S.N. Immunologic consequences of Francisella tularensis live vaccine strain infection: role of the innate immune response in infection and immunity. J. Immunol. 2006; 176:6888-99.

10. de la Puente-Redondo V.A., del Blanco N.G., Gutiérrez-Martín C.B., García-Peña F.J., Rodríguez Ferri E.F. Comparison of different PCR approaches for typing of Francisella tularensis strains. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(3):1016-22.

References

1. Kislichkin N.N., Kislichkina O.I. [Live tularemia vaccine Nik-sp. Francisella tularensis]. RF Patent 2308969. 27.10.2007.

2. Meshcheryakova I.S. [Tularemia: modern epidemiology and preventive vaccination (To the 80th Anniversary since the first tularemia laboratory foundation in Russia]. Epidemiol. Vaktsinoprof. 2010; 2:17-22.

3. Nikiforov V. V., Karetkina G.N. [Tularemia: since the discovery up to the present day]. Infek. Bol. 2007; 5(1):67-76.

4. Olsuf'ev N.G. [Tularemia]. M.; 1960. 459 p.

5. Sayapina L.V., Solov'ev E.A., Goryaev A.A., Bondarev V.P. [Studies of immunobiological properties in Francisella tularensis vaccine strain 15 NIIEG under extended storage conditions]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2015; 2:87-91.

6. Sirotyuk L.V. [Biological properties of tularemia vaccine strains NIIEG]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1964; 10:116-20.

7. Trankvilevsky D.V., Udovikov A.I., Popov V.P., Zakharov K.S., Popov N.V., Bezsmertny V.E. [Situation on rodents abundance and epidemio-logical situation on tularemia in the territory of the Russian Federation in the second half of 2014, and prognosis for 2015]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2015; 1:30-5.

8. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(40):631-46.

9. Cole L.E., Elkins K.L., Michalek S.M., Qureshi N., Eaton L.J., Rallabhandi P., Cuesta N., Vogel, S.N. Immunologic consequences of Francisella tularensis live vaccine strain infection: role of the innate immune response in infection and immunity. J. Immunol. 2006; 176:6888-99.

10. de la Puente-Redondo V.A., del Blanco N.G., Gutiérrez-Martín C.B., García-Peña F.J., Rodríguez Ferri E.F. Comparison of different PCR approaches for typing of Francisella tularensis strains. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(3):1016-22.

Authors:

Solov'ev E.A., Sayapina L.V., Davydov D.S., Bondarev V.P. Scientific Center on Expertise of Medical Application Products. 8, Petrovsky Bulvar, Moscow, 127051, Russian Federation. E-mail: Sayapina@xpmed.ru

Osina N.A. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@ microbe.ru

об авторах:

Соловьев Е.А., Саяпина Л.В., Давыдов Д.С., Бондарев В.П. Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8. E-mail: Sayapina@xpmed.ru

Осина Н.А. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Поступила 19.06.15.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.