CC BY
2
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1992
УДК 614.445:578.8911-078
К. В. Блохин, М. Д. Алейник, А. Н. Бурков, Т. Н. Быстрова
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИКИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А И АПРОБАЦИЯ ЕЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ВОДЫ
Горьковский НИИ эпидемиологии и микробиологии
Вопросы, связанные с вирусологическим контролем, прежде всего на вирус гепатита А (ВГА), объектов окружающей среды и воды до сих пор остаются весьма актуальными. Однако существующие методики обнаружения ВГА или его антигена в воде не нашли широкого применения в практических лабораториях. Это связано с их трудоемкостью и необходимостью использования сложного лабораторного оборудования, включающего ультрацентрифугирование или ультрафильтрацию [3].
Целью настоящего исследования является усовершенствование методики концентрирования ВГА в воде, включающей в себя сорбцию вируса на гидроокиси алюминия, десорбцию 0,05 М раствором глицинового буфера рН 11,5 и ультрафильтрацию. Представлялось необходимым оптимизировать такие ее этапы, как фильтрование на колонке с сорбентом и повторное концентрирование вируса.
Для фильтрования исследуемой воды использовали один вид сорбента — гидроокись алюминия. Однако опыт работы с большими объемами воды показал, что такой фильтр малопроизводителен. В процессе пропускания воды зерна сорбента образовывали на поверхности плотный слой, через который жидкость проходила с трудом, в результате чего скорость фильтрования падала. В связи с этим была предпринята попытка формирования фильтра на основе двух сорбентов: гидроокиси алюминия и ионообменной смолы анионита АВ-17-8. Крупные зерна последней составляли основу, а мелкие гранулы гидроокиси алюминия, распределяясь в ней, в меньшей степени затрудняли прохождение воды.
Ионообменную смолу анионит АВ-17-8 использовали для работы после предварительной обработки по известной методике [4]. Фильтры, сформированные на основе двух сорбентов, хорошо зарекомендовали себя в практике работы с большими объемами воды (30 л и более). Активность их не снижалась из-за добавления анионита АВ-17-8, так как его способность сорбировать ВГА лишь немного уступает таковой, присущей гидроокиси алюминия.
На втором этапе работы была изучена возможность применения сульфата аммония для осаждения вируса (антигена) из водной среды [2]. При проведении экспериментов за основу была взята методика, используемая для высаливания сывороточных белков [5]. Насыщенный раствор сульфата аммония готовили следующим образом: в 1 л теплой воды (30—40 °С) растворяли 800 г сульфата аммония, полученный раствор фильтровали, доводили рН до 7,2 и хранили при 4 °С.
Осаждение вируса (антигена) проводили при 4 °С. Для этого к исследуемому материалу добавляли '/г объема насыщенного раствора сернокислого аммония. Реагент вносили в течение 15—20 мин дробными порциями при периодическом перемешивании. Затем смесь оставляли при 4 °С на 18 ч. На следующее утро материал центрифугировали при 6000 об/мин в течение 60 мин. Супернатант сливали, а осадок растворяли в I—3 мл физиологического раствора рН 7,2—7,4. Концентрат переносили в пенициллиновые флаконы и хранили до начала исследования при —10—15 °С и ниже.
Для проведения опытов использовали систему, состоящую из стеклянной колонки, оснащенной фильтром из пористого стекла (Шотта № 2), резиновых шлангов с винтовым зажимом и емкости для исследуемой воды, которую помещали
Таблица 1
Показатели оптической плотности материалов, полученных после концентрирования ВГА в сильно разведенных суспензиях (при длине волны 492 нм)
на подставке на высоте 2—2,5 м от пола. В колонку вносили предварительно подготовленную ионообменную смолу анионит АВ-17-8 (слой высотой 3—4 см) и навеску порошка гидроокиси алюминия 5 г. Через сформированный таким образом фильтр самотеком пропускали вируссодержащнй материал. Скорость тока жидкости устанавливали с помощью винтового зажима на уровне 8±2 мл/мин. Верхнее отверстие колонки необходимо герметично перекрыть резиновой пробкой, через которую пропущен стеклянный дрот, соединенный резиновым шлангом с верхней емкостью.
Эффективность модернизированной методики оценивали в модельных опытах, исследуемый материал для которых готовили следующим образом. Воду в количестве 1 л брали из водопроводного крана и оставляли на 1 сут при комнатной температуре. Затем подкисляли ее соляной кислотой до рН 3,0—4,5 и добавляли 1 мл суспензии концентрированного фекального вируса, выделенного и очищенного по общепринятой методике. Степень разведения вируса составила 1:1000.
Для элюирования вируса (антигена) с сорбента использовали 0,05 М глициновый буфер рН 11,5. Нейтральной реакции (рН 7.0—8,0) достигали с помощью 0,05 М глицинового буфера рН 1,5—1,6. От посторонних примесей избавлялись путем обработки элюата хлороформом (в соотношении 1:10) с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 30 мин. Затем полученный материал делили на 2 порцин. Одну из них подвергали ультрафильтрации, а другую — обработке сульфатом аммония. В итоге получали 2 порции материала объемом I мл каждая. Затем исследовали их в ИФА с помощью коммерческой тест-системы для выявления антигена ВГА, разработанной и выпускаемой нашим институтом [1). Положительными считали те пробы, в которых оптическая плотность исследуемого образца (ОП ИО) превышала среднее значение оптической плотности отрицательного контроля (ОП ОК) в 2.1 раза.
Суммарные данные сравнительных опытов представлены в табл. 1.
Показатели отношения ОП ИО/ОП ОК, приведенные в табл. I, свидетельствуют о том, что обе методики обеспечивают возможность обнаружения ВГА в разведенных суспензиях (1:1000). Вместе с тем стандартная методика оказалась несколько чувствительнее: показатели экстинкции были выше (от 13,6 до 17,9), чем при модифицированном способе концентрирования (11,3—15,0). Эти различия можно объяснить тем, что при обработке суспензий сульфатом аммония теряется некоторое количество вируса. Однако небольшое различие показателей дает основание полагать, что модернизированная методика может быть использована в практических лабораториях как не требующая сложного и дорогостоящего оборудования.
На следующем этапе работы была проведена апробация усовершенствованной методики концентрирования ВГА. С этой целью отбирали различные образцы воды объемом не менее 30 л. В общей сложности была исследована 41 проба. Среди них 4 образца представляли собой сточную воду, которую брали в период с марта по апрель 1989 г. на станции аэрации на этапе выпуска ее в реку после очистки (активным илом
Таблица 2
Результаты исследования питьевой воды, воды водоисточников и сточной воды на наличие антигена ВГА
Число проб
Материал Всего с положительным
результатом
№ п/п Методика концентрирования Вода питьевая В том числе из: 28 9
ОП ОК модернизированная стандартная
0Г1 ИО ОП ИО/ОП ОК ОП ИО ОП ИО/ОП ОК резервуаров чистой воды водопровода Вода водоисточников (речная) Сточная вода 14 14 9 4 6
1 2 з 0,031 0,029 0,035 0,043 0,414 0,385 0,525 0,569 12.1 11,3 15,0 13,2 0,423 0,465 0,629 0,652 13,6 16,0 17.0 15.1 5 0
4 Итог о... 41 ' 14
и в биологических прудах). Речную воду, служащую источником водоснабжения (9 проб) доставляли с июня по декабрь 1989 г. Питьевую воду (28 проб) брали либо из резервуаров чистой воды фильтростанций (14 образцов), либо из водопроводных кранов потребителей. Последние отбирали в основном но эпидемиологическим показаниям. После двухэтапного концентрирования материалы изучали на наличие ВГА с помощью ИФА, результаты которого представлены в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что разработанная методика позволяет исследовать воду разной степени загрязненности. При этом из 41 пробы положительными оказались 14. Большой процент положительных находок можно объяснить тем, что значительную часть проб отбирали по эпидемиологическим показаниям, в период эпидемическою неблагополучия по ВГА. Отрицательные результаты исследования сточных вод свидетельствуют о качественной работе станции аэрации. Немаловажное значение имеет и то обстоятельство, что эти исследования проводились в межэпидемический сезон (март — апрель).
Таким образом, приведенные в настоящем сообщении материалы свидетельствуют о возможности обнаружения антигена ВГА в пробах воды (с различной степенью загрязненности) с помощью модифицированной методики его концентри-
рования. Последняя отличается от существующих ныне тем, что не требует использования сложного лабораторного оборудования. Это обстоятельство позволяет рекомендовать данную методику для широкого внедрения в практические лаборатории.
Литература
1. Быстрова Т. Н., Алейник М. Д. // Новое в практике лабораторных исследований — Горький, 1984.— С. 67—70.
2. Вирусология. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Б. Мейхи.— М„ 1988.- С. 58.
3. Методические рекомендации по изучению роли водного фактора в заболеваемости населения вирусным гепатитом А.— М., 1986.
4. Методические рекомендаций по санитарно-вирусологиче-скому контролю объектов окружающей среды.— М., 1982.
5. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ.— М., 1985,- С. 66-72.
Поступила 05.06.90
© А. В. КРАВЧУК, 1992 УДК 615.91.076.9
А. В Кравчук
ПРИМЕНЕНИЕ ДИСКРИМИНАНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТА
Экспериментальная лаборатория медико-биологических проблем, Кемерово
Традиционный подход к статистическому анализу результатов медико-биологических исследований зачастую сводится к последовательной проверке контролируемых параметров на достоверность отличий с помощью статистик Стьюдента, Фишера, Уилкоксона и т. д. В большинстве случаев этого достаточно, но в некоторых ситуациях такой подход приводит к потере ключевой информации, поскольку вне поля зрения исследователя остаются скрытые взаимосвязи между наблюдаемыми изменениями, не учитываются относительная значимость контролируемых параметров, их корреляции между собой, иными словами, теряется фактор многомерности. Особенно нежелательна потеря фактора многомерности, когда ожидаемый эффект воздействия трудно предсказуем и/или контролируется большое количество параметров.
Примером может служить изучение воздействия многокомпонентных смесей веществ (или смесей неизвестного состава) на лабораторных животных в токсикологическом эксперименте. Авторы многочисленных работ, касающихся механизмов сочетанного действия веществ на организм, до сих пор не пришли к единому мнению относительно методики прогнозирования токсичности смесей, что связано с существованием различных типов взаимодействия между ее ингредиентами (3). В этой ситуации при постановке токсикологического эксперимента исследователь вынужден контролировать значительное количество физиологических, биохимических и других параметров, чтобы получить реальную картину патологического воздействия изучаемой смеси на организм.
Цель работы состоит в определении наиболее информативных показателей различия контрольной и экспериментальной групп с помощью дискриминантного анализа.
Подобный хронический токсикологический эксперимент был поставлен как один из этапов работы по гигиенической оценке водопроводной воды в г. Юрга Кемеровской обл. Ранее было показано, что и речная, и водопроводная вода г. Юрга, водо-
снабжение которого осуществляется из р. Томь, содержит большое количество вредных химических соединенкй в значительных концентрациях 4). Кроме того, были обнаружены соединения, идентификация которых затруднена. Это позволяет рассматривать изучаемую воду как сложную смесь веществ. Эксперимент проводился на самцах белых нелинейных крыс. В течение 6 мес экспериментальная группа животных получала юргинскую водопроводную воду, а контрольная — чистую воду, по качеству соответствующую ГОСТу «Вода питьевая». В течение последнего, 7-го, месяца все животные получали чистую воду для изучения обратимости возникающих патологических изменений в организме.
Отбор материала для исследований проводился в сроки 2, 4, 8, 16, 24 и 28 нед. В каждый из указанных сроков в сыворотке крови определялись содержание общих липидов, р-липопротеи-дов, фосфолипидов, мочевины, церулоплазмина, суммарное содержание продуктов перекисного окисления липидов (ТБК-тест), SH-групп, гемоглобина и его дериватов, активность церулоплазмина, каталазы, холинэстеразы, АЛТ, оЛДГ, ГГТ. Кроме того, учитывали массу тела и органов, частоту дыхания, удельное потребление кислорода и суммационно-пороговый показатель.
Для анализа полученных данных был применен метод дискриминантного анализа |1, 5], во всяком случае те его статистические процедуры, .которые имеют отношение к интерпретации данных. Выбранный метод позволяет, во-первых, изучать различия между группами объектов по нескольким параметрам одновременно без потери фактора многомерности, во-вторых, выявить наиболее значимые параметры, отбросив второстепенные, в-третьих, найти устойчивые «связки» параметров, определяющих обнаруженные различия между группами объектов. Все расчеты произведены с помощью статистического пакета CSS В640.
В результате проведенного эксперимента для каждой из
Доминантные переменные канонических дискриминантных функций и их стандартизованные коэффициенты
Параметр Кстаид Параметр Кстаид Параметр Кстаид Параметр Кстаид Параметр Кстаид Параметр Кстаид
Мочевина 0,61 Каталаза 0,65 ГГТ 1,12 р-липопро- 0,69 Церулоплаз- 0,92 Мочевина 0,90
теиды мин
ТБК-тест —0,50 АЛТ 0,41 Мочевина —1,11 АЛТ —0,68 Фосфолипиды 0,47 Каталаза —0,31
Р-липопротеи- 0,36 Общие ли- —0,26 Фосфолипи- 0,99 Мочевина 0,41 Ды г.иды ды
ТБК-тест —0,40
2 нед 4 нед 8 нед 16 нед 24 нед 28 нед
