CC BY
60
Экспериментальная эндокринология
Состояние цитоплазматических мембран при экспериментальном сахарном диабете
Н.П. Микаэлян, Ю.А. Князев, А.Е. Турина, А.Г. Максина, Ф.С. Дзугкоева
Российский государственный медицинский университет I
М3 РФ, Москва, м
Северо-Осетинская медицинская академия, Владикавказ I-
Как известно, конечный метаболический эффект (КМЭ) гормона зависит от состояния мембран клеток-мишеней, на которых расположены рецепторы. Действие инсулина в клетке модулируется на уровне инсулиновых рецепторов (ИР) за счет изменения их количества или сродства к гормону: инсулин + ИР -» ИРК (инсулинрецеп-торный комплекс) -> КМЭ (пострецепторные влияния).
Ранее нами показано, что связывающие параметры ИР зависят от степени пероксидации фосфолипидов в липидном бислое мембран эритроцитов при сахарном диабете (СД) 1 типа [6| и при аллоксано-вом диабете у крыс [7].
Целью настоящего исследования явилось изучение состояния цитоплазматических мембран клеток при экспериментальном СД путем определения связывающих параметров ИР эритроцитов (Эр), гепа-тоцитов (Г), почечной ткани (ПТ), скелетных мышц (СМ) и легочной ткани (ЛТ), а также структурных свойств их плазматических мембран (ПМ) с применением электронно-парамагнитно-резонансной (ЭПР) спектроскопии.
Материалы и методы
Эксперименты поставлены на 180 крысах — самцах линии «Вистар». СД вызывали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана из расчета 17 мг на 100 г массы тела после 30-48часового голодания. Исследования проводились на 3-и, 7-е и 14е сутки после введения аллоксана при гликемии не ниже 16 ммоль/л. Концентрацию инсулина определяли с помощью ра-диоиммунных наборов, количество ИР в ПМ определяли по ранее описанному методу [5|. Связывание |;М инсулина с рецепторами ПМ клеток исследовали с использованием метода вытеснения |!'.1-инсулина из комплекса с рецепторами возрастающими концентрациями немеченого гормона в условиях равновесия инсулина [10, 11]. Общее количество инсулинсвязывающих мест и сродство рецепторов к гормону определяли по стандартным методикам 110-12]. Структурно-функциональные свойства мембран оценивали по,результатам измерения микровязкости и гидрофобное™ методом ЭПР-спектроскопии; исполозовали метод спиновых зондов, позволяющий количественно оценить поверхностный потенциал липидно-белковых комплексов 18]. Перекисное
окисление липидов (ПОЛ) определяли по концентрации малонового диальдегида (МДА) [13].
В ПТ определяли также активность N8+, Кн— АТФазы [15] по приросту неорганического фосфора. Белок в пробах определяли по методу Лоури. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием ^критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Данные, полученные по усредненным сатураци-онным кривым насыщения, показатели количества и сродства свободных и занятых ИР (Яо, Ке, КГ соответственно), а также средние величины максимального специфического связывания '^-инсулина в ПМ гематоцитов свидетельствуют о том, что через 3 сут. после введения аллоксана количество ИР достоверно возрастает, через 7 сут. до 24,8±0,9% по сравнению с контролем (табл. 1).
Анализ данных [14] показал, что количество рецепторов на 1 мг белка на 3-и сутки составляло 4 пг/мг и 7 пг/мг для контрольных и диабетических животных соответственно. Параллельный ход кривых связывания инсулина у опытных и контрольных животных указывает на то, что сродство гормона к рецептору аналогично; различия заключаются в увеличении в 2 раза числа ИР при СД за счет увеличения рецепторной емкости и количества ИР с высоким сродством. Введение инсулина нормализовало состояние ИРК и КМЭ.
На 7-е сутки наблюдалось увеличение количества ИР в ПМ печени без изменения их аффинитета. Через 3 сут. после введения аллоксана имели место аналогичные изменения. Степень отрицательной кооперативности рецепторов, характеризуемая величиной а=КГ/Ке, не изменилась; максимальное уменьшение этой величины при «кратковременном» диабете для мембран печеночных клеток было в пределах 30%.
Повышенное связывание инсулина с рецепторами при аллоксановом диабете имеет место также и в ПМ СМ. Этот эффект наблюдался при всех исследованных концентрациях инсулина, но особенно
Таблица 1
Показатели инсулин-рецепторного взаимодействия ПМ клеток печени в контроле и при СД
Группа животных п Максимальное специфическое связывание |25.1-инсулина, % (М ± т) Ro, нмоль/мг белка Ке Kf 107М' Kf/Ke (°)
Контроль 15 14,3±0,7 0,021 14,8 4,3 0,288
СД
3-й сутки 10 21,5±2,3 0,033 16,3 3,1 0,206
7-е сутки 12 24,8±0,9 0,035 16,9 4,2 0,244
значительно при высоких (табл. 2)*. Увеличение связывания инсулина с рецепторами обусловлено увеличением количества ИР (р<0,05). Количество рецепторов на 1 мг белка ПМ составляло 2,8 и 3,3 пг/мг для контрольных и опытных животных соответственно. Сродство гормона к рецептору не изменялось . Количество рецепторов на 1 мг белка ПМ составляло 2,8 и 3,3 пг/мг для контрольных и опытных животных соответственно. Сродство гормона к рецептору не изменялось [4, 9].
Преинкубация мембран клеток печени и СМ с АТФ подавляла связывание инсулина с рецептора-
ми и не влияла на этот процесс в контроле, что свидетельствует о модулирующем влиянии АТФ на действие инсулина. То обстоятельство, что АТФ не влияет на связыывание инсулина с мембранами клеток здоровых животных, может быть связано с наличием гетерогенных рецепторов в этих тканях, а также с тем, что при СД происходит более интенсивное фосфорилирование некоторых мембранных белков и групп рецепторов, обусловливающих угнетение связывания гормона с частью рецепторов.
* In vitro использовались следующие концентрации инсулина: 10, 50, 100, 1000 нг/мл.
Ингибирование связывания инсулина в мышечной ткани происходило при концентрациях АТФ значительно ниже физиологических (10-12 М). В печени эти концентрации АТФ давали дополнительный угнетающий эффект, хотя торможение связывания гормона наблюдалось и при физиологических концентрациях АТФ(10'1 М). Различие концентраций АТФ, подавляющих связывание гормона в печеночной и мышечной тканях, свидетельствует также о наличии нескольких АТФ-зависимых ступеней, обусловливающих это связывание. Поскольку способность рецепторов связывать инсулин регулируется фосфорилирова-
нием мембранных белков, возможно даже самих рецепторов, есть основание допустить, что АТФ может оказывать существенное влияние на процесс связывания инсулина с его рецепторами при состояниях ин-сулинрезистентности, а не только при СД.
Инкубирование Эр в среде с оптимальным содержанием глюкозы (10 ммоль) и неорганического фосфора (14 ммоль) позволило выявить снижение скорости утилизации глюкозы после введения аллоксана на 40% и уровня АТФ на 13%.
Известно, что при диабете значительно ускоряются процессы ПОЛ [3] в мембранах клеток, в частности, Эр [1, 2]. Результаты наших исследований показали значительное увеличение концентрации МДА в Эр и почечной ткани крыс по сравнению с контрольной группой (табл. 3) При «хронической»
Таблица 2
Специфическое связывание ”М-инсулина с цитоплазматическими мембранами скелетных мышц (М+т)
Группа животных Концентрации инсулина (Р), нг/мл Связанный инсулин (В), нг/мл Ь/? 102 на 1 мг белка мембран
Контроль 10 0,81 ±0,08 8,1
50 3,40+0,29 6,8
100 5,20+0,49 5,2
1000 14,0±1,5 1,4
СД 10 0,95±0,08 0,5
50 3,70±0,29 7,5
100 6,00±0,59 6,0
1000 18,0±0,20 1,80
Таблица 3
Концентрация МДА в эритроцитах и почечной ткани при аллоксановом диабете (М ± т)
Группа животных Концентрация МДА
в эритроцитах, нмоль/кл В мозговом веществе почечной ткани, нмоль/мг белка В корковом веществе почечной ткани, нмоль/мг белка
Контроль 0,687±0,045 2,4325+0,435 2,3014+0,11
Диабет 0*86510,047 3,7329±0,3047 3,4019±0,279
0,01 0,05 0,001
Примечание: п - число животных; р - достоверность результатов опытной группы по сравнению с контролем.
стадии аллоксанового диабета отмечается повышение концентрации МДА до 0,865 ± 0,047 нмоль/мл (р<0,001). Концентрация МДА возрастает и в почечной ткани: в корковом веществе уровень МДА на 62,2% выше, чем в контрольной группе, в мозговом веществе — на 39,9% (р<0,01 и р<0,05 соответственно), по-видимому, вследствие изменения оксигена-ции клеток и качественного состава фосфолипидов, составляющих основу бислоя мембран. В почечной ткани имеет место значительное снижение активности №+, К+-АТФазы при диабете (табл. 4). Существует тесная корреляционная связь между концентрацией МДА в почечной ткани и активностью N8+, К+-АТФазы (г= -0,73).
Изучение инсулинрецепторного взаимодействия в мембранах Эр показало снижение процесса связывания инсулина с собственными рецепторами во всех группах крыс, что зависело от тяжести диабета; в группе животных с легкой степенью инсулинсвязыва-ющая активность (ИСА) клеток уменьшается на 55% (р<0,01), при тяжелой степени — в 2,7 раза (р<0,001).
При гипергликемии в корковом и мозговом веществе ПТ снижен процент связывания |25.1-инсули-на с собственными рецепторами. Между активностью №+, К+-АТФазы и ИСА отмечается прямая корреляционная зависимость 0=0,73, р<0,05), т.е. снижение активности энзима сопровождается снижением ИСА рецепторов, которые также обладают ферментативной (протеинкиназной) активностью. В снижении ИСА в Эр и клетках коркового и мозгового вещества ПТ также имеет место параллелизм О=+0,73, 1=+0,75 соответственно).
Связыывающие характеристики ИР нами сопоставлялись с интегральными показателями структурного свойства липидного матрикса — жидкостнос-тью и экспонированием белков (табл. 5).
Повышение мембранной жидкостности и экспонирования белков Г и Эр после введения аллоксана сопровождалось значительным повышением связывания гормона за счет увеличения количества доступных рецепторов, т.е. выявлена достоверная зависимость связывания инсулина с собственными рецепторами от состояния липидов мембран Эр и Г. В мембранах ЛТ крыс большая микровязкость также сочеталась с большим количеством рецепторов и более высокой ИСА. Изменения в липидном матриксе влияют на доступность рецепторов и их аффинность. Возможно, что изменение спектра липидов в микроокружении рецептора влияет на его конформацию и доступность для регуляторых белков, в частности, для инсулина.
Утилизация глюкозы Эр при аллоксановом диабете у крыс прямо зависиот от степени тяжести болезни: снижено базальное и стимулируемое инсулином потребление глюкозы в большей степени. Даже при легкой степени СД утилизация глюкозы снижается на 33,2% (р<0,05), что дает основание предположить развитие инсулинрезистентности. При инкубации гомогенатов коркового и мозгового вещества ПТ с инсулином получены аналогичные данные: при тяжелой степени СД в корковом веществе базальное потребление глюкозы снижается на 76% (р<0,001), стимулируемое инсулином — на 81,3% (р<0,001); в мозговом веществе — на 91,3% и 96,8%
Таблица 4
Изменение ИСА эритроцитов и клеток коркового и мозгового вещества и ферментативная активность Ыа+,
К+-АТФазы почечной ткани (М ± т)
Группа животных ИСА, % Активность Ыа+, К+-АТФазы, мкмоль р н/мг белка в час
Эритроциты Мозговое вещество Корковое вещество Мозговое вещество Корковое вещество
Контроль Диабет ' 1 8,38±1,32 10,7211,08* 14,36±0,744 10,34±0,994* 14,56±0,689 10,2210,913* 8,426±0,59 4,54310,86* 4,83910,5 3,310,27*
* Различия с контролем достоверны (р<0,05).
Таблица 5
Показатели структурных свойств и количество ИР эритроцитов, гепатоцитов и легочной ткани контрольных и
диабетических крыс
Группа животных Ro, нмоль на 1 мг белка Параметр упорядоченности (S), отн. Ед. Коэффициент корреляции, (t) Экспонирование белков (a/б), отн. Ед.
Эритроциты
Контроль 0,015 0,5 - 0,15
Диабет
3-й сутки 0,026 0,65 0,65 0,25
7-е сутки 0,031 0,78 0,71 0,48
Печень
Контроль 0,021 0,35 - 0,10
Диабет
3-й сутки 0,033 0,74 0,53 0,35
7-е сутки 0,035 0,81 0,59 0,64
Легкие
Контроль 0,32 0,4 - 0,12
Диабет
3-й сутки 0,41 0,48 0,42 0,14
7-е сутки 0,45 0,53 0,48 0,15
(р<0,001) соответственно. Следовательно, при ал-локсановом диабете связывание '^-инсулина собственными рецепторами в Эр, корковом и мозговом веществе ПТ сопровождается уменьшением потребления глюкозы в данных клетках (t=0,72 и t=0,69 соответственно).
Таким образом, при аллоксановом диабете происходит снижение ИСА в эритроцитах в клетках почечной ткани, что свидетельствует об однонаправленности метаболических нарушений в этих тканях, в то время как в ПМ гепатоцитов, легочной ткани и скелетных мышц при всех исследованных концентрациях инсулина in vitro имеет место повышенное связывание инсулина с собственными рецепторами за счет увеличения рецепторной емкости и количества ИР с высоким сродством.
Повышение активности ПОЛ при аллоксановом диабете приводит к увеличению «жесткости» мембранного бислоя, способствует снижению активности №+, К+ЧАТФазы и арушению инсулинсвязыва-ющей активности в цитоплазмаатических мембранах клеток.
Нарушение инсулинрецепторного взаимодействия приводит к угнетению потребления глюкозы в тканях вследствие изменения количества инсулиновых рецепторов и их сродства, что является причиной нарушения синтеза АТФ и угнетения активности №+, К+-АТФазы.
АТФ может оказывать существенное влияние на
процесс связывания инсулина с его рецепторами при экспериментальном сахарном диабете.
Литература
1. Балашова Т.С., Голега Е.Н., Рудько И.А. и др. // Тер. Арх.-1993. -№10.-С.25-27.
2. Дедов И.И., Горелышева В.А., Романовская ГА. и др. // Пробл. эн-докринол.-1992. - № 6. - С. 52-55.
3. Завершхановский Ф.А.. Жулкевич И.В., Данилишина B.C., Жулкевич Г.Д. И Там же-1 987.-№ 4.-С. 15-18.
4. Любарская С.Г., Грачева Н.К., Князева А.П., Старосельцева Л.К. // Биохимия. 1 980. - Т. 45, № 1 - С. 66-71.
5. Микаэлян Н.П. - Метаболический статус и инсулинсвязывающая активность клеток крови и печени при экстремальных состояниях (экспериментально-клиническое исследование): Автвореф. дисс. д.б.н., М., 1992.
6. Князев Ю.А., Максина А.Г., Микаэлян Э.П. // Бюлл экспер. биол. И мед.-1 994.- № 10.- С. 388-392.
7. Микаэлян Н.Г}., Максина А.Г., Гурина А.Е., Микаэлян Э.П. // Вестн. РГМУ 1998. - № 2 (5). - С. 70-73.
8. Cafiso D.S., Hubbell W.L. // Ann.Rev. Biophys, Bioenerg.- 1981.-Vol 10.-P.217.
9. Davidson V.B., Raplan S.A. //I. Clin. Invest.-1 977.-Vol. 59, N 1 .-P. 2230.
1 0. Gruber M. // Biochem. Biophys. Acta.-l 974.-Vol.370, N 1. Ц P. 297307.
1 1. Kahn C.R., Freychet P., Roth I. // J.Biol chem.-1 974.-Vol.249.-P.2249-2257.
1 2. Meyts L.P.M., Roth I. // Biochem.biophys.Res commun.-l 975.-Vol.66, N8.-P.ll 18-1126.
13. Osacawa I., Matsushita S. Coloring conditions of thuobarbituric acid test pf detecting lipid hidroperoxides. // Lipids.-1 980.-Vol. 15.-N 3.-P. 137-140.
14. Scatchard i.O. // Ann. N.Y. Acad/ Sci.- 1 949.-Vol. 51, N 6.-P.660-672.
1 5. Scou I.C. The unfluence of some cations on an adenosine triphosphatase from periferal nerve. // Biochem. Diophys. Acta.-l 957.-V.23, p. 394-401.
