CC BY
58
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 616.28-008.14-055.5/.7-092:612.017.1]-078.33
Саидов М.З., Рамазанова П.К., Джамалудинов Ю.А.
СОСТОЯНИЕ СИСТЕМНОГО АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА И ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРОДУКЦИЕЙ аутоантител К МИЕлинОВОМУ (PO) белку при сенсоневральной тугоухости
Дагестанская государственная медицинская академия, 367000, г. Махачкала
В настоящее время патогенез наследственных форм сенсоневральной тугоухости (СНТ) связывают с мутациями в гене GJB2, ответственным за синтез белка коннексина 26. Не меньшее патогенетическое значение придают изменениям в системном адаптивном иммунитете, а также индукции выработки аутоантител к миелиновому (РО) белку. Цель настоящей работы - изучение состояния системного адаптивного иммунитета у больных СНТ и оценка взаимосвязей этих изменений с продукцией аутоантител к РО-белку.
Обследованы 64 больных СНТ с наследственными и прогрессирующими формами СНТ. Показано, что у пациентов с наследственной несиндромальной СНТ достоверно повышен уровень CD19+-клеток, а также CD3-CD16+CD56+-клеток (естественные киллеры - ЕК). Усиление тугоухости с III до IV степени сопровождается повышением содержания В-клеток (CD19+) и Т-хелперов (CD3+CD4+-клеток). Среди этих же больных при III степени тугоухости аутоантитела к миелиновому РО-белку встречаются у 10%, а при IV степени - у 18%. При прогрессирующей ненаследственной СНТ определяли достоверное снижение уровня активированных CD3+HLA-DR+-клеток. Прогрессирование ненаследственных форм СНТ сопровождается увеличением числа пациентов с наличием аутоантител к миелиновому РО-белку с 18 до 41%. При наследственной несиндромальной СНТ определяется достоверная корреляция между уровнем Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+-клетки) и T-NK-клеток (CD3+CD16/56+-клетки) и наличием аутоантител к РО-белку, что подчеркивает патогенетическое значение этих клеток в процессах демие-линизации нервных структур внутреннего уха. При прогрессирующей ненаследственной СНТ появляются дополнительные связи между общей популяцией Т-лимфоцитов (CD3+клетки), общей популяцией В-лимфоцитов (CD19+-клетки), уровнем ЕК (CD3-CD16+CD56+-клетки) и продукцией аутоантител к РО-белку. Вероятно, прогрессирование СНТ связано с активацией ЕК, Т- и В-лимфоцитов. Это позволяет говорить об иммунопатогенетическом аспекте прогрессирующей СНТ и обоснованности рекомендаций по применению иммунотропных препаратов, в частности кортикостероидов, в комплексном лечении этих больных.
Ключевые слова: сенсоневральная тугоухость; гены коннексина 26; CD-позитивные клетки; аутоантитела к миелиновому белку; корреляции.
M.Z. Saidov, P.K. Ramazanova, Yu.A. Dzhamaludinov
THE STATE OF SYSTEMIC ADAPTIVE IMMUNITY AND JUNCTION WITH PRODUCTION OF AUTOANTIBODIES TO MYELIN PROTEIN ZERO (P0) PROTEIN IN PATIENTS WITH SENSORINEURAL HEARING LOSS
Dagestan State Medical Academy, 367000, Makhachkala, sq. Lenin, 1
Currently pathogenesis of hereditary forms of sensorineural hearing loss (SHL) is associated with mutations in the GJB2 gene responsible for synthesis of protein - connecsin 26. Not less pathogenetic importance is given to changes in the system adaptive immunity, as well as induction develop antibodies to миелиновому RO-protein. The purpose of this work was to study the state of the system of adaptive immunity in patients SNL and assessment of the interlinkages of these changes with the production of autoantibodies to myelin RO-protein. We examined the 64 patients with SNL with hereditary and progressive forms of SNL. It is shown that in patients with hereditary non-hereditary SNLT significantly increased level of CD19+-cells and CD3-CD16+CD56+-cells (EC). Strengthening of hearing from the III-IV degree is accompanied by the increase of the level of b cells (CD19+) and T-helper cells (CD3+CD4+-cells). In the same patients, III degrees of hearing loss autoantibodies to myelin RO-protein found in 10% of cases, and in IV degrees of hearing loss in 18% of cases. With progressive non-hereditary SNL was determined by the significant reduction of activated lymphocytes CD3+HLA-DR+-cells. The progression of the non-hereditary forms of SNT is accompanied by an increase in the number of patients with the presence of autoantibodies to myelin RO protein from 18% to 41%. When hereditary non-hereditary SNL determined significant correlation between the level of T-cytotoxic lymphocytes (CD3+CD8+-cells) and T-NK cells (CD3+, CD16/56+-cells) and the presence of autoantibodies to myelin RO-protein, which underlines the pathogenetic significance of these cells in the processes of demyelination of nerve structures of the inner ear. With progressive non-hereditary SNL there are additional links between the general population of T-lymphocytes (CD3+-cells), the General population of lymphocytes (CD19+-cells), the level of the EC (CD3-CD16+CD56+-cells) and production of autoantibodies to myelin RO-protein. Probably, the progression of the SNL is associated with activation of the EC, T- and b-lymphocytes. It allows to speak about immunopathogenesis aspect progressive SLL and about the validity of recommendations on the application of immunotropic preparations, in particular, corticosteroids, in the complex treatment of these patients.
Key words: sensorineural hearing loss; genes connecsin 26; CD-positive cells; autoantibodies to миелиновому squirrel; correlation.
В соответствии с современными представлениями сенсоневральная тугоухость (СНТ) является патологическим процессом, при котором поражаются рецепторы наружных и
Саидов Марат Зиявдинович (Saidov Marat Ziavdinovich), Е-mail: [email protected]. Тел. моб. 8-988-300-90-45
внутренних волосковых клеток улитки и частично слухового нерва, вследствие чего индуцируются дегенеративноатрофические изменения в структурах внутреннего уха с последующим нарушением функции звуковосприятия [1]. Патофизиологические, социальные, психологические последствия тугоухости и глухоты особенно у детей очевидны
80 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология
и крайне тяжелы. Снижение слуха в возрасте до 2 лет приводит не только к задержке речевого развития, но и оказывает неблагоприятное воздействие на интеллектуальное и психосоматическое развитие ребенка, что затрудняет его общение с окружающими и изолирует от общества. У взрослых больных тугоухость и глухота приводят к инвалидизации и социальной и психологической дезадаптации в трудоспособном возрасте [2, 3].
Это заболевание имеет полиэтиологическое происхождение, неоднородный характер и локализацию патологического процесса. Имеются многочисленные факты, указывающие на мультифакториальную природу СНТ. Более того, некоторые авторы считают, что острая СНТ - это синдром, в основе которого лежит множество причин, провоцирующих факторов и сопутствующих заболеваний [4].
Результаты молекулярно-генетических исследований СНТ с применением высокоспецифичных и чувствительных методов ДНК-диагностики изменили принципиальные подходы к интерпретации этиологии и патогенеза СНТ. Настоящим прорывом в изучении этиологии и патогенеза СНТ стало открытие патологических генов, ответственных за развитие СНТ, прежде всего мутаций в генах белков коннексинов. Эти белки играют существенную роль в нейрофизиологических процессах звуковосприятия во внутреннем ухе. Идентифицировано более 130 генных локусов, ответственных за развитие несиндромальных форм СНТ, и около 400 синдромов, ассоциированных с нарушением слуха [5, 6]. Наиболее важными в отношении атрофических и дегенеративных изменений нейроэпителия улитки при несиндромальной СНТ являются мутации в гене GJB2 (gap junction Р2), картированные в области 13q11-q13. Этот ген является небольшим и включает два экзона, из которых только второй является кодирующим для белка коннексина 26 (СХ26). Наиболее распространенной в этом гене является мутация 35delG, обозначающая делецию гуанина в положении 35 в гомозиготном состоянии, что приводит к сдвигу рамки считывания, образованию стоп-кодона и нарушению синтеза белка коннексина 26, ответственного за транспорт электролитов в волосковых клетках органа Кор-ти и как следствие к нарушению процессов звуковосприятия [4, 6]. Кроме того, из всех описанных мутаций гена GJB2 наиболее практически значимыми в отношении диагностики и прогноза СНТ являются мутации 167den и 235delС [5], обозначающие соответственно делеции нуклеотидов тимина в положении 167 и цитозина в положении 235, что также вызывает нарушение синтеза коннексина 26. Медикогенетическое консультирование семей с наследственными формами СНТ включает обязательное исследование указанных мутаций [5].
Однако, несмотря на очевидные достижения молекулярногенетических исследований, остается много неясных вопросов относительно патогенеза и лечения СНТ. В этом отношении участию иммунной системы в механизмах развития СНТ уделяют достаточно большое внимание. Показано, что при острой СНТ преимущественно на низкие тона определяется существенное повышение Thl-субпопуляции CD4+-лимфоцитов, продуцирующих интерферон у (IFNy). Уровень Th2-CD4+-субпопуляции Т-лимфоцитов, продуцирующей интерлейкин (IL -4), не имел достоверных различий по сравнению с таковым в контрольной группе. Продукция IL-1P, фактора некроза опухоли a (TNFa), IL-4, IFNy в культурах лимфоцитов in vitro у больных СНТ превышала аналогичные показатели у здоровых людей. Активность естественных киллеров (ЕК) у больных СНТ с неадекватным ответом на стандартную терапию увеличена в 3 раза по сравнению с аналогичным в контроле, что, по-видимому, является следствием гиперактивации CD16+CD56+-клеток, которые принимают участие в иммунном повреждении слухового анализатора [7, 8]. Позитивные результаты кортикостероидной терапии, а также терапии метотрексатом при билатеральной СНТ обусловлены снижением продукции таких провоспалительных цитокинов, как IFNy, TNFa, IL-1, IL-2, IL-5, в том числе in situ, а также ингибицией пролиферации Т-лимфоцитов [9].
На фоне указанных изменений адаптивного иммунитета при СНТ крайне интересными оказались данные об индукции гуморального аутоиммунного ответа на миелиновый (РО) белок, входящий в состав миелиновой оболочки клеток Шванна, которые присутствуют в слуховом нерве [10, 11]. Показано, что у 27% пациентов с СНТ определяются антитела (АТ) к РО-белку, причем эти АТ чаще встречались при прогрессирующей СНТ, нежели при внезапной потери слуха [12, 13]. АТ к РО-белку класса IgG были определены у всех больных, страдающих билатеральными формами СНТ и болезнью Меньера, в то время как только у 5 (11%) из 45 пациентов с односторонней потерей слуха определялись указанные АТ [14, 15]. Очевидно, что эти и другие данные имеют непосредственное отношение к процессам демиелинизации нервных волокон и нарушению функции звукопроведения.
Идентификация аутоантител к РО-белку при СНТ и патогенетические следствия этого процесса послужили основанием для выделения отдельной нозологической единицы - аутоиммунных форм СНТ [16, 17]. Результаты подобных исследований меняют принципиальные подходы к диагностике и лечению СНТ.
Целью настоящей работы стали изучение состояния системного адаптивного иммунитета у больных СНТ и оценка взаимосвязей этих изменений с продукцией аутоантител к РО-белку.
Материалы и методы. Обследовали 61 пациента с СНТ среди учащихся МКУ школы-интерната I вида Махачкалы; пациентов, находящихся на учете в сурдологическом кабинете при Республиканской детской клинической больнице, а также пациентов, находящихся на учете в Республиканском медико-генетическом центре. Наследственные формы СНТ верифицировали с обязательным участием врача-генетика. По клиническим, анамнестическим, клинико-генеалогическим,
Таблица 1
Показатели системного адаптивного иммунитета при наследственной несиндромальной СНТ, Me (25; 75 процентилей)
Показатель системного адаптивного иммунитета Наследственная несиндромальная СНТ, n = 23 Контрольная группа, n = 15
CD3+, % 74,6 (66.4; 78,5) 71 (68;78,4)
CD3+, абс. 1460 (1077;1853) 1443 (1115; 2091)
CD19+,% 17,5 (13,6; 19,6)* 14 (11; 17,8)
CD19+, абс. 311 (252; 530)* 230,5 (188; 387,5)
CD3+CD4+, % 46,8 (37.9; 47,8) 39,4 (37; 46,8)
CD3+CD4+, абс. 971 (674; 1060) 893 (557; 1116,7)
CD3+CD8+, % 23 (18,7; 28)* 29,3 (22,6; 31,8)
CD3+CD8+, абс. 413 (395; 664)* 554 (496; 627,5)
CD3+CD25+, % 1,5 (1,4; 1,6)* 2,6 (1,9; 3,6)
CD3+CD25+, абс. 34 (32; 36)* 41,5 (37; 102)
CD3-CD16+CD56+, % 8,5 (7,6; 11) 10,3 (6,7; 16)
CD3-CD16+CD56+, абс. 207 (101; 221)* 188,5 (154; 235,7)
CD3+HLA-DR+, % 2 (1,4; 2,3)** 4,7 (4; 5,8)
CD3+HLA-DR+, абс. 38,5 (29; 44)** 111 (89,5; 133,7)
CD3/CD4 1,67 (1,3; 2,5) 1,45 (1,1; 1,8)
CD3+CD16/56+,T-NK, % 1,9 (1,6; 2,4)** 4 (2,6; 6)
CD3+CD16/56+,T-NK, абс. 35,5 (30; 38)** 56 (50; 103,5)
Примечание. Здесь и в табл. 3: * - p <0,05 по сравнению с показателями контрольной группы (Г-критерий Манна-Уитни); ** - p < 0,01 по сравнению с показателями контрольной группы (Г-критерий Манна-Уитни). Здесь и в табл. 2, 3: абс. - абсолютное количество позитивных клеток в 1 мкл;
- 81 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
аудиометрическим данным сформировали следующие группы больных: с наследственной несиндромальной СНТ в случаях, когда имелись клинико-генеалогические данные, подтверждающие наследственную природу несиндромальной СНТ (n = 23); с прогрессирующей ненаследственной СНТ в случаях, когда имелись факты прогрессирования тугоухости и отсутствовали данные, подтверждающие наследственную природу СНТ (n = 26); с прогрессирующей наследственной СНТ в случаях, когда определялось сочетание наследственных форм СНТ с прогрессированием тугоухости (n = 12).
В группу сравнения вошли пациенты с кондуктивной тугоухостью, не имеющей патогенетического родства с СНТ (n = 13). Контрольную группу составили 15 практически здоровых доноров. Степень тугоухости и определение прогрессирования процесса проводили на основании клинических данных, а также результатов аудиометрических исследований на аудиометре xeta. Все данные вносили в слуховой паспорт пациента.
Системный адаптивный иммунитет изучали методом проточной лазерной цитофлюориметрии на цитофлюориме-тре Beckman coulter cytomics™ Fc500 с программным обеспечением cxP-Analysis с использованием моноклональных АТ компании Beckman coulter c двойной меткой по стандартной методике. Результат выражали в абсолютном количестве и процентах флюоресцирующих клеток. Работу проводили в отделении лабораторной диагностики Республиканского диагностического центра (Махачкала).
Общее количество Т-лимфоцитов оценивали по абсолютному и относительному количеству CD3+-клеток в периферической крови; общее количество В-лимфоцитов - по абсолютному и относительному количеству CD19+-клеток в периферической крови; содержание Т-хелперов - по аналогичному уровню CD3+CD4+-клеток; Т-цитотоксических клеток - по абсолютному и относительному уровню CD3+CD8+-клеток; активированных Т-лимфоцитов - по абсолютному и относительному уровню CD3+CD25+- и CD3+HLA-DR+-клеток; ЕК -по абсолютному и относительному уровню CD3-CD16+CD56+-клеток. Кроме того, изучали клетки, несущие и Т-клеточный маркер (CD3+), и маркер ЕК (CD 16/56+) - это так называемые T-NK-клетки - CD3+CD16/56+-клетки.
Для определения аутоантител к РО-белку в сыворотке крови применили иммуно-блотт. С этой целью использовали наборы ImmuBlot™ Anti-PO Antibody Western Blot компании «Immco Diagnostics», Product Code 1192. В данном методе анализа аутоантител к РО-белку в качестве антигена использован очищенный РО-белок из нервной ткани крупного рогатого скота. Этот белок наносили на нитроцеллюлозные полоски (стрипы). В случаях, когда в исследуемой сыворотке имелись аутоантитела к РО-белку, происходило специфическое взаимодействие аутоантител с РО-белком на стрипе и результат этого взаимодействия визуализировался в виде горизонтальной полоски, соответствующей положению маркера 30 кД (anti-PO). Контроль качества анализа достигался путем нанесения на стрип маркера другой молекулярной массы - 116 кД (MW-marker). Положительный результат представлялся в виде +++, ++,
+ в зависимости от интенсивности окраски полосок.
Статистическую обработку полученных результатов провели, используя программы Microsoft Excel, Stat Soft Statistica 6.1 и Вiostat. exe. Результаты представлены в виде медианы (Ме) и 25; 75 процентилей для каждой из исследуемых выборок. При сравнении показателей двух групп использовали Г-критерий
Манна-Уитни, при множественных сравнениях - критерии Крускала-Уоллеса и Данна. Корреляционную взаимосвязь между изученными показателями определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). Достоверность отличий устанавливали по значению р. Критическим принят уровень статистической значимостир < 0,05.
Результаты и обсуждение. Результаты оценки системного адаптивного иммунитета у больных с наследственной несиндромальной СНТ представлены в табл. 1. Достоверную разницу между показателями иммунного статуса у больных наследственной несиндромальной СНТ у лиц контрольной группы отметили в отношении абсолютного и относительного уровня CD19+-клеток, а также абсолютного количества ЕК - CD3-CD16+CD56+-клеток в сторону повышения (р < 0,05). Напротив, абсолютный и относительный уровень Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+-клеток), активированных Т-лимфоцитов (CD3+CD25+ и CD3+HLA-DR+-клетки), а также T-NK-клеток (CD3+CD 16/56+-клетки) претерпевал противоположные изменения в сторону достоверного снижения по сравнению с таковым в контроле (р < 0,05 и р < 0,01).
Изменения демонстративны. Речь идет о том, что при наследственной несиндромальной СНТ происходит достоверное увеличение количества В-лимфоцитов и ЕК-клеток. Первые ответственны за выработку аутоантител к PO-белку, вторые, возможно, - за деструкцию (демиели-низацию) нервных волокон. Регуляторные механизмы этих процессов при СНТ полноценно не выполняют свою функцию, о чем может свидетельствовать достоверное снижение содержания активированных клеток в периферической крови.
Изменения системного адаптивного иммунитета при наследственной несиндромальной СНТ в зависимости от степени снижения слуха отражены в табл. 2. Представлены
Таблица 2
Показатели системного адаптивного иммунитета при наследственной несиндромальной СНТ в зависимости от степени тугоухости, Me (25; 75 процентили)
Показатель системного адаптивного иммунитета Наследственная несиндромальная СНТ Контрольная группа(n =15)
III степень (n = 13) IV степень (n = 10)
CD3+, % 76,9 (75; 79)* 70 (60; 76)** 71 (68; 78,4)
CD3+, абс. 1042 (1008; 1077) 1657 (1267; 1858)* 1443 (1115; 2091)
CD19+, % 15,5 (14; 17,5) 19 (13; 24) 14 (11; 17,8)
CD19+, абс. 213 (174; 252) 430 (282; 598)* 230,5 (188; 387,5)
CD3+CD4+, % 42 (38; 46,8) 44 (36; 48) 39,4 (37; 46,8)
CD3+CD4+, абс. 579 (484; 674) 991 (880; 1060)** 893 (557; 1116,7)
CD3+CD8+, % 32 (28; 35,3) 21 (17; 26)* 29,3 (22,6; 31,8)
CD3+CD8+, абс. 426,5 (402; 451) 530 (323; 712) 554 (496; 627,5)
CD3+CD25+, % 1,7 (1,2; 2,1)* 2(1; 2) 2,6 (1,9; 3,6)
CD3+CD25+, абс 23,5 (15; 32)* 36 (33; 38) 41,5 (37; 102)
CD3-CD16+CD56+, % 7 (6; 8) 9(8; 14) 10,3 (6,7; 16)
CD3-CD16+CD56+, абс. 95,5 (87; 104) 207 (207; 260)** 188,5 (154; 235,7)
CD3+HLA-DR+,% 2 (1,5; 2,7)* 2 (1; 2)* 4,7 (4; 5,8)
CD3+HLA-R+, абс. 28,5 (19; 38)* 39 (31; 51)* 111 (89,5; 133,7)
CD3/CD4 1,37 (1; 1,67) 2 (1; 2) 1,45 (1,1;1,8)
CD3+CD 16/56+, % 2,5 (2,2; 2,7) 2 (1; 2)* 4 (2,6;6)
CD3+CD 16/56+, абс. 24 (15; 33)* 37 (34;37) 56 (50;103,5)
Примечание. * -p< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе
** - p < 0,05 по сравнению с показателями при СНТ III степени (критерии Крускала-Уоллиса и Данна).
- 82 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология
Таблица 3
Показатели системного адаптивного иммунитета при прогрессирующей ненаследственной снТ, Me (25;75 процентили)
Показатели системного адаптивного иммунитета Прогрессирующая ненаследственная СНТ, (n = 26) Контрольная группа (n = 15)
CD3+, % 71,6 (66; 76) 71 (68; 78,4)
CD3+, абс. 1415 (1280; 1551) 1443 (1115; 2091)
CD19+, % 12,5 (10,6; 15,7) 14 (11; 17,8)
CD19+, абс. 241 (206; 286) 230,5 (188; 387,5)
CD3+CD4+, % 41 (38,5; 44) 39,4 (37; 46,8)
CD3+CD4+, абс. 857 (763; 871) 893 (557; 1116,7)
CD3+CD8+, % 26 (23; 29) 29,3 (22,6; 31,8)
CD3+CD8+, абс. 481 (420; 568) 554 (496; 627,5)
CD3+CD25+, % 3 (2,7; 3,1) 2,6 (1,9; 3,6)
CD3+CD25+, абс. 58,5 (47,5; 67) 41,5 (37; 102)
CD3-CD16+CD56+, % 12,6 (9,9; 15) 10,3 (6,7; 16)
CD3-CD16+CD56+, абс. 203 (154; 295) 188,5 (154; 235,7)
CD3+HLA-DR+, % 3 (2,6; 3,3)** 4,7 (4; 5,8)
CD3+HLA-DR+, абс. 58 (49,5; 54) ** 111 (89,5; 133,7)
CD3/CD4 1,5 (1,2; 2,7) 1,45 (1,1; 1,8)
CD3+CD 16/56+, T-NK, % 4,9 (3,9; 5,2) 4 (2,6; 6)
CD3+CD 16/56+, T-NK, абс. 68 (60; 91) 56 (50; 103,5)
данные по III и IV степени, поскольку все обследованные пациенты с этой формой СНТ имели указанные степени тугоухости. Из табл. 2 видно, что разделение больных на субгруппы по степени снижения слуха сопровождается появлением дополнительных различий в сравнении с контрольной группой. Прежде всего обращает внимание то, что повышение абсолютного и относительного уровня Т-лимфоцитов и при III, и при Iv степени тугоухости становится статистически достоверным (p < 0,05). Более того, эта же достоверность появляется и при сравнении групп СНТ между собой, причем при III степени тугоухости показатели выше, чем при Iv степени. Можно предположить, что увеличение количества Т-лимфоцитов в периферической крови связано с индукцией выработки аутоантител к РО-белку. Интересно, что достоверное увеличение абсолютного количества В-лимфоцитов в общей группе больных СНТ достигается за счет числа пациентов с Iv степенью тугоухости. Аналогичная ситуация определяется и в отношении ЕК-клеток (cD3-cD16+cD56+-клетки).
Кроме того, обозначается важный факт. При разделении больных СНТ по степеням тугоухости появляются достоверные различия по абсолютному количеству ключевых клеток в отношении индукции аутоиммунного ответа Т-хелперов (CD3+CD4+-клеток). В нашей выборке больных СНТ статистическую достоверность определяли при сравнении больных с III и Iv степенью тугоухости. При Iv степени регистрировали повышение абсолютного уровня CD3+CD4+-клеток по сравнению с таковым у пациентов с III степенью тугоухости (р < 0,05). В то же время снижение уровня Т-цитотоксических лимфоцитов достигалось за счет пациентов с Iv степенью тугоухости. Достоверное угнетение количества активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+-клетки и CD3+CD25+-клетки) определялось у пациентов с III степенью тугоухости.
Результаты изучения системного адаптивного иммунитета при прогрессирующей ненаследственной СНТ представ-
лены в табл. 3. Подчеркнем, что данная группа больных не имела анамнестических и клинико-генеалогических данных, указывающих на наследственную природу тугоухости. В то же время факт прогрессии тугоухости установлен. Это означает, что при сравнительном анализе изменений иммунного статуса у данной группы больных СНТ и больных с наследственными формами СНТ можно оценить возможную связь мутаций в гене коннексина 26 с достоверными изменениями системного адаптивного иммунитета.
Как видно из табл. 3, изменения касаются только активированных Т-лимфоцитов CD3+HLA-DR+-клеток. Определяется достоверное снижение абсолютного и относительного уровня этих клеток (р < 0,01). Аналогичные изменения отмечали и при наследственной несиндромальной СНТ. Между тем по остальным показателям достоверных изменений не зарегистрировали. Однако это не исключает значения изменений в системном адаптивном иммунитете в отношении прогрессии патологического процесса, прежде всего индукции выработки аутоантител к РО-белку.
В табл. 4 представлены результаты изучения продукции аутоантител к РО-белку у больных наследственной несин-дромальной СНТ. В группу сравнения включили больных с кондуктивной тугоухостью. Видно, что при наследственной несиндромальной СНТ аутоантитела при III степени тугоухости встречаются у 10% пациентов, а при Iv степени тугоухости - у 18%, т. е. с нарастанием степени тугоухости при данной форме СНТ увеличивается и продукция аутоантител к РО-антигену. Среди больных с кондуктивной тугоухостью уровень аутоантител был незначительным - 8,3%. Вероятно, патологический процесс в полости среднего уха при кондуктивной тугоухости не сопровождается продукцией патогенетически значимого уровня аутоантител к РО-белку.
Продукцию аутоантител изучали и в группе с прогрессирующей наследственной СНТ. Результаты сравнительного анализа между этими группами позволили вынести суждение о значении наследственного фактора в прогрессии тугоухости при СНТ. Результаты представлены в табл. 5.
Видно, что прогрессия тугоухости сопровождается увеличением числа пациентов с наличием аутоантител к РО-белку. В группе с ненаследственными формами прогрессирующей
Таблица 4
Аутоантитела к рО-белку у больных с наследственной несиндромальной снТ
Показатель Наследственная несин- Кондуктивная Контроль-
дромальная СНТ тугоухость ная группа
III степень тугоухости (П = 13) ^степень тугоухости (n = 10) II степень тугоухости (П = 12) (n = 4)
Аутоантитела 2 (10) 6 (18) 1 (8,3) -
к миелиново-му РО-белку
Примечание. Здесь и в табл. 5 в скобках указан процент.
Таблица 5
аутоантитела к рО-белку у больных с различными формами снТ
Форма СНТ Степень тугоухости Аутоантитела к РО-белку
Прогрессирующая II (n = 12) 5 (41)
ненаследственная III (n = 11) 4 (36,3)
Прогрессирующая наследственная II (n = 12) 2 (28,8)
Кондуктивная тугоухость II (n = 12) 1 (8,3)
Контрольная группа n = 4 -
- 83 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
Таблица 6
Корреляционные взаимосвязи между показателями системного адаптивного иммунитета и уровнем аутоантител к миелиновому рО-белку у больных наследственной несиндромальной снТ
Показатель Аутоантитела к РО-белку
CD3+CD4+, % r = -0,610, p = 0,033
CD3+CD8+, % r = 0,525, p = 0,05
CD3+CD16/56+ T-NK, % r = 0,734, p = 0,008
CD3/CD4 r = -0,618, p = 0,02
Таблица 7 Корреляционные взаимосвязи между показателями системного адаптивного иммунитета и уровнем аутоантител к миелиновому РО-белку у больных прогрессирующей ненаследственной снТ
Показатель Аутоантитела к РО-белку
CD3+, % r = 0,638; p = 0,012
CD19+, % r = 0,638; p = 0,012
CD3+CD8+, % r = 0,879; p = 0,01
CD3+CD8+, абс. r = 0,638; p = 0,012
CD3-CD16+CD56+, % r = -0,567; p = 0,029
CD3-CD16+CD56+, абс. r = -0,567; p = 0,029
CD3+CD 16/56+ T-NK, % r = 0,542; p = 0,038
тугоухости число больных с позитивными результатами на аутоантитела больше, чем в группе с наследственной формой прогрессирующей тугоухости. Очевидно, что наследственный фактор менее значим в прогрессии тугоухости по сравнению с известными факторами риска при прогрессировании СНТ (вирусные инфекции, применение ототоксических препаратов, черепно-мозговые травмы и др.). Также ясно и то, что при кондуктивной тугоухости аутоиммунитет не имеет существенного патогенетического значения в сравнении с СНТ.
Среди больных с наследственной несиндромальной СНТ определены корреляционные взаимосвязи между показателями системного адаптивного иммунитета и уровнем аутоантител к РО-белку (табл. 6). В работу включили только тех пациентов, у которых одновременно изучали и показатели системного адаптивного иммунитета, и продукцию аутоантител к РО-белку. На основании таких методических подходов рассчитали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена. Прежде всего обращает на себя внимание достоверная (р = 0,008), сильная (г > 0,7), положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем T-NK-клеток (cD3+cD16/56+-клетки) в периферической крови и наличием аутоантител к РО-белку. Эти данные дают основание предположить участие этих клеток в процессах деструкции (демиелиниза-ция) нервных волокон внутреннего уха, что высказывалось нами ранее. Кроме того, такая же связь, но средней силы (г=0,525) прослеживается между уровнем Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+-клетки) в периферической крови и аутоантителами. Это и неудивительно, поскольку известна родственность по функциональным свойствам между T-NK-клетками и Т-цитотоксическими лимфоцитами.
Достаточно интересна отрицательная (г = -0,610), достоверная (р = 0,033) корреляционная взаимосвязь между уровнем Т-хелперов (CD3+CD4+-клетками) в периферической крови и аутоантителами к РО-белку. В этом случае есть основания высказать мнение о том, что ингибиция активности этих регуляторных клеток способствует активации клеток-продуцентов аутоантител (В-лимфоциты и плазматические клетки) и индукции выработки аутоантител к РО-белку при СНТ.
Достоверные корреляционные взаимосвязи между показателями системного адаптивного иммунитета и аутоантите-
лами у больных с прогрессирующей ненаследственной СНТ представлены в табл. 7. Анализ данных табл. 7 интересен с точки зрения участия клеток адаптивного иммунитета в прогрессировании СНТ и участия в этом процессе аутоантител к РО-белку. В этой группе больных появляются дополнительные связи. В частности, между общей популяцией Т-лимфоцитов (CD3+-клетки), общей популяцией В-лимфоцитов (CD19+-клетки), уровнем ЕК (CD3-CD16+CD56+-клетки) и продукцией аутоантител к РО-белку. Остальные корреляции аналогичны корреляциям при наследственной несиндромальной СНТ. Вероятно, прогрессирование СНТ связано в том числе и с вовлечением в процесс активированных Т- и В-лимфоцитов и их растворимых факторов. Это позволяет говорить о иммунопатогенетическом аспекте прогрессирующей СНТ и обоснованности рекомендаций по применению иммунотропных препаратов в комплексном лечении больных с данной патологией.
Таким образом, представленные результаты изучения состояния системного адаптивного иммунитета у больных с разными формами СНТ и взаимосвязей с продукцией аутоантител к РО-белку свидетельствуют об активном участии иммунной системы в патогенезе СНТ. Очевидно, тестирование продукции аутоантител к РО-белку, а также оценка иммунного статуса больных с данной патологией достаточно информативны и патогенетически обоснованы. Не менее важны и рекомендации по применению иммунотропных препаратов, в частности курсов кортикостероидной терапии при комплексном лечении аутоиммунных форм СНТ.
литература
1. Корниенко А.М. Корниенко Р. А. Нейросенсорная тугоухость: новые возможности терапии. Вестник оториноларингологии. 2011; 2: 46-8.
2. Лалаянц М.Р., Близнец Е.А., Маркова Т.Г, Поляков А.В., Та-варткиладзе Г.А. Результаты аудиологического обследования детей первого года жизни с сенсоневральной тугоухостью, обусловленной мутациями в гене GJB2. Вестник оториноларингологии. 2011; 3: 31-5.
4. Джемилёва Л.У, Гринберг Э.Р., Хабибуллин Р.М. и др. Гены белков-коннексинов, принимающих участие в процессе звуковосприятия. Вестник оториноларингологии. 2006; 4:15-20.
5. Маркова Т.Г. Организация медико-генетического консультирования в отношении наследственных нарушений слуха. Вестник оториноларингологии. 2009; 1: 34-6.
6. Джемилева Л.У, Посух О.Л., Тазетдинов А.М. и др. Анализ генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой наследственной этиологии из различных регионов России. Генетика. 2009; 7: 982-91.
7. Егоров В.И., Лазарева Л.А., Ханферян Р.А. Иммунологические аспекты внезапной сенсоневральной тугоухости. Российская оториноларингология. 2010; 6(49): 77-82.
8. Егоров В.И., Лазарева Л.А. Состояние адаптивного звена иммунитета у больных острой нейросенсорной тугоухостью. Российская оториноларингология. 2010; 6(49): 20-5.
references
1. Kornienko A.M., Kornienko R.A. Sensorineural hearing loss: new possiblities of therapy. Vestnik otorinolaringologii. 2001; 2: 46-8 (in Russian).
2. Lalayants M.R., Bliznets E.A., Markova T.G., Poliakov A.V, Tavartkiladze G.A. Results audiologic investigation of childrens first year life with sensorineural hearing loss consequently the mutations in GJB2 gene. Vestnik otorinolaringologii. 2011; 3: 31-5 (in Russian).
3. Smith R.J., Bale J.F., White K.R. Sensorineural hearing loss in children. Lancet. 2005; 365: 879-90.
4. Dzhemilyoeva L.U., Grinberg E.R., Khabibulin R.M. et al. Genes of proteins - connexines parting in process of hear perception. Vestnik otorhinolaringologii. 2006; 4: 15-20 (in Russian).
5. Markova T.G. Organization of medical-genetics consultation
- 84 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология
in hereditary hearing loss. Vestnik otorinolaringologii. 2009; 1: 34-6. (in Russian).
6. Dzhemilyoeva L.U., Posukh O.L., Tazetdinov A.M. et al. Analysis of genes 12SrRNA и tRNASer(UCN) mtDNA in patients with nonsyndromic sensorineural hearing loss from different regions of Russia. Genetika. 2009; 7: 982-91(in Russian).
7. Egorov VI. Lazareva L.A., Hanferyan R.A. Immunologic aspects of sudden sensorineural hearing loss. Russian otorinolar-yngology. 2010; 6(49): 77-82 (in Russian).
8. Egorov V.I. Lazareva L.A. State of adaptive immunity in patients with acute sensorineural hearing loss. Russiyskaya otorhinolar-ingologiya. 2010; 6(49): 20-5 (in Russian).
9. Buniel M.C., Geelan-Hansen K.,Weber P.C. Immunosuppressive therapy for autoimmune inner ear disease. Immunotherapy. 2009; 1(3): 425-34.
10. Pham B.N., Rudic M., Bouccara D. et al. Antibodies to myelin protein zero (P0) protein as markers of auto-immune inner ear diseases. Autoimmunity. 2007; 40(3): 202-07.
11. Bonaguri C., Orsoni G., Zavota L. et al. Anti-68 kDa antibodies in autoimmune sensorineural hearing loss: are these autoantibod-
ies really a diagnostic tool? Autoimmunity. 2007; 40(1): 73-8.
12. Tomasi J.P., Lona A., Deggouj N. et al. Autoimmune sensorineural hearing loss in young patients: an exploratory study. Laryngoscope. 2001; 111(11): 2050-53.
13. Yehudai D, Shoenfeld Y, Toubi E. The autoimmune characteristics of progressive or sudden sensorineural hearing loss. Autoimmunity.. 2006; 39(2): 153-58.
14. Passali D. V., Damiani H., Mora R. et al. P0 antigen detection in sudden hearing loss and Meniere’s disease: a new diagnostic marker? Acta Otolaryngol. 2004; 124(10): 1145-48.
15. Fuse T., Hayashi T., Oota N. Immunological responses in acute low-tone sensorineural hearing loss and Meniere’s disease. Acta Otolaryngol. 2003; 123(1): 26-31.
16. Bovo R., Ciorba A., Martini A. The diagnosis of autoimmune inner ear disease: evidence and critical pitfalls. Eur. Arch. Otorhi-nolaryngol. 2009; 266(1): 37-40.
17. Ruckenstein M.J. Autoimmune inner ear disease. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 2004; 12(5): 426-30.
Поступила 02.09.13 Received 02.09.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 612.112.94.083
Семикина Е.Л., Родионова Т.В., Закиров Р.Ш., Филянская Е.Г., Маянский Н.А.
методические возможности оценки активации лимфоцитов in VITRO
ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН РФ, 119991, г. Москва
В работе представлены результаты оценки активации мононуклеаров периферической крови (МПК) тремя современными методами, определенными в одних и тех же пробах клеточных культур у здоровых доноров на 1, 3, 7-е сутки инкубации in vitro. изучали экспрессию мембранных маркеров клеточной активации методом проточной цитофлюорометрии, концентрацию цитокинов в культуральной среде методом мультиплексного анализа, пролиферацию стимулированных клеток с помощью красителя CyQuant с последующим определением количества ДНК. При оценке экспрессии поверхностных маркеров CD69, CD71, CD95 (Fas/Apo-1), CD154 (CD40L), CD25, HLA-DR на T-лимфоцитах/хелперах с фенотипом CD3+CD4+CD45+ в ответ на стимуляцию ФгА выявили, что для всех без исключения маркеров экспрессия значимо повышалась по сравнению с таковой в контроле, но время достижения максимального уровня экспрессии оказалось разным для каждого из них. При исследовании продукции цитокинов мы зарегистрировали синтез всех показателей через 24 ч, в том числе в условиях спонтанного культивирования. индекс стимуляции после 3 сут инкубации возрастал у большинства цитокинов (интерлейкин (IL)-2, IL-4, IL-6, интерферон-у (IFNy), фактор некроза опухоли а, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) более чем в 2-4 раза. При увеличении срока инкубации отметили, что индекс стимуляции к 7-м суткам снижался для большинства цитокинов, но оставался высоким для IL-6, GM-CSF и IFNy. Пролиферативная активность МПК через 1 сут возрастала более чем в 2 раза (иС = 2,5). Наибольшую активность наблюдали через 3 сут (иС = 5,89). Через 7 сут инкубации она снижалась (иС = 1,7). Представленные методы могут быть полезны для оценки ответа лимфоцитов на воздействие различными агентами in vitro.
Ключевые слова: активация лимфоцитов; проточная цитофлюориметрия; bio-plex.
SemikinaE.L., Rodionova T.V., ZakirovR.S., FilyanskayaE.G., Mayanskiy N.A.
METHODICAL POSSIBILITIES OF EvALUATING THE ACTUATION OF LYMPHOCYTES IN VITRO
Scientific Center Children’s Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
The paper presents estimates of the activation of peripheral blood mononuclear three modern methods defined in the same samples of cell cultures of healthy donors on 1st, 3rd, 7th day incubation in vitro.
Determined the expression of membrane markers of cell activation by flow of cytofluorometry, the concentration of cytokines in the culture medium by the method of a multiplex analysis, the proliferation of stimulated cells by dye CyQuant with subsequent determination of the amount of DNA. When evaluating the expression of surface markers CD69, CD71, CD95 (Fas/Apo-1), CD154 (CD40L), CD25, HLA-DR on T-lymphocytes/hellers phenotype CD3+CD4+CD45 in response to stimulation of PHA, it was found that for all markers expression level was significantly increased compared with the control, but the time to reach the maximum level of expression was different for each of them. In the study of cytokine production we registered synthesis of all investigated parameters in 24 hours including in the conditions of spontaneous cultivation. Stimulation index after 3 days of incubation increased in most determined of cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, INF-y, TNF-a, GM-CSF) more than 2-4 times. When increasing the incubation period we noted that the stimulation index to 7 days decreased for most of cytokines, but remained high for IL-6, GM-CSF and INF-y. Proliferative activity of blood lymphocytes through the day grew more than 2 times (IP = 2,5). The greatest activity was noted in 3 days (IP = 5,89). After 7 days of incubation it decreased (IP = 1,7). The methods can be useful to evaluate the response of lymphocytes to the impact of various agents in vitro.
Key words: activation of lymphocytes; flow cytofluometry; bio-plex.
Семикина Елена Леонидовна, д-р мед. наук, зав. централизованной клинико-диагностической лабораторией НЦЗД РАМН, 119991, Москва, Ломоносовский проспект, д. 2, т. 499-134-03-59, el-mail: [email protected]
- 85 -
