CC BY
177
Инфекционные болезни,
иммунология, иммунотерапия
УДК 616.36-002.2-085.37
Д. А. Сахарова, Ю. А. Витковский, П. П. Терешков
КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С
Читинская государственная медицинская академия, 672090, ул. Горького, 39а, тел. 8-(3022)-35-43-24, факс 8-(3022)-32-30-58, e-mail: pochta@medacadem.chita.ru, г. Чита
Резюме
В статье представлен анализ изменений клеточного иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом С. Всего было обследовано 69 человек в возрасте от 16 до 58 лет. В ходе исследования установлено, что у всех больных хроническим вирусным гепатитом С изменены показатели иммунограммы по сравнению с нормой: выявлен выраженный рост популяции активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) при значительном снижении популяций активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLA-DR+), активированных Т-киллеров (CD3+CD8+HLA-DR+), NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) и T-NK-клеток (CD3+CD16+CD56+), что является проявлением дизрегуляции клеточного иммунитета. При этом, установлено снижение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в 73,8 % случаев, что свидетельствует о дисфункции Т-лимфоцитов, проявляющейся в уменьшении их способности к адгезии тромбоцитов.
Ключевые слова: хронический гепатит С, иммунитет, иммунограмма, Т-лимфоциты, лимфоцитарно-тромбоци-тарная адгезия.
D. A. Sakharova, Yu. A. Vitkovskiy, P. P. Tereshkov CELLULAR IMMUNITY IN PATIENTS WITH CHRONIC VIRAL HEPATITIS C
Chita State Medical Academy, Chita Summary
The analysis of changes of cellular immunity in patients with chronic viral hepatitis C is studied. 69 people at the age from 16 to 58 years were examined. The study demonstrated that all patients with chronic viral hepatitis C had changed immunological indicators, compared to the norm: a pronounced growth in the population of activated T-lymphocytes (CD3+HLA-DR+) with a significant reduction in populations of activated T-helper lymphocytes (CD3+CD4+HLA-DR+), activated T cells (CD3+CD8+HLA-DR+), NK-cells (CD3-CD16+CD56+) and T-NK-cells (CD3+, CD16+CD56+) manifesting deregulation of cellular immunity. Adhesion of lymphocytes with platelets decreased in 73, 8 % of cases. This indicates the dysfunction of T-lymphocytes, which is manifested in the decrease of platelet adhesion.
Key words: chronic viral hepatitis C, immunity, immunogram, T-lymphocytes, adhesion of lymphocytes with platelets.
Мировая пандемия вирусного гепатита С являет- К сожалению, в мире еще не создана вакцина прося одной из самых актуальных проблем современной тив гепатита С и ВОЗ прогнозирует, что к 2015 году медицины, что обусловлено не только его широкой показатель заболеваемости вирусным гепатитом С мо-распространенностью, но и латентностью течения, жет утроиться [9]. Россия не является исключением. высокой частотой хронизации, выраженностью не- Еще на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов благоприятных исходов - цирроза печени и гепатоцел- Главный санитарный врач РФ Г. Г. Онищенко (2002) люлярной карциномы, которые являются ведущими особо отметил неуклонный рост заболеваемости гепа-в структуре смертности от заболеваний печени. титом С в стране. Предполагается, что к 2015-2020 гг.
21
увеличится частота выявления хронического гепатита С на стадии цирроза печени и возрастет количество HCV-ассоциированной гепатокарциномы [6].
В настоящее время считается установленным, что высокая частота (50-85 % по данным различных авторов) формирования хронических форм и развития осложнений обусловлена «ускользанием» вируса от иммунного надзора [5, 7]. Механизмы этого феномена до сих пор четко не установлены. Предполагается, что центральную роль в элиминации вируса гепатита С играет Т-клеточное звено иммунитета [1, 8]. Существенное значение в поддержании патологического процесса у больных придается недостаточности CD4+Т-хелперов и дисбалансу цитокинов [9].
Таким образом, основную роль в формировании характера иммунного реагирования макроорганизма играет взаимодействие в системе «вирус-хозяин», что определяет сценарий развития событий при HCV-инфекции [4]. В тоже время многие аспекты иммунного ответа при гепатите С остаются невыясненными, хотя это актуально как в теоретическом аспекте для понимания иммунопатогенеза, так и в практическом плане для прогноза течения болезни.
Целью настоящей работы стало изучение иммунного статуса больных хроническим вирусным гепатитом С.
Материалы и методы
Было обследовано 69 человек, находившихся на стационарном лечении в ГУЗ «Краевая клиническая инфекционная больница» г. Читы за период с 2011 по 2013 гг. по поводу хронического вирусного гепатита С. Женщин было 30,4 % (21), мужчин - 69,6 % (48). Обследованные находились в возрасте от 16 до 58 лет, средний возраст - 36±1 лет. От всех пациентов получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Диагноз хронического вирусного гепатита С выставлен на основании клинико-лабораторных данных и обнаружения РНК HCV методом ПЦР. Длительность заболевания до 5 лет выявлена у 66,7 %, свыше 5 лет -у 33,3 %. Первая степень биохимической активности процесса определялась у 55,0 % больных ХВГС, вторая - у 45,0 %. Стадия заболевания по Metavir F 0-F 1 была диагностирована у 43,5 %; F 2 - у 42,0 %; F 3-F 4 - у 14,5 %.
Кровь для иммунологического обследования получали путем пункции локтевой вены в строго стерильных условиях на 2-3-и сутки стационарного лечения. Взятие крови осуществляли в утренние часы (8-9 часов) строго натощак. Для иммунофенотипирования кровь забирали в пробирку VACUTAINER (BD), содержащую динатриевую соль ЭДТА объемом 2,5 мл.
Изучались активность и количество Lymphocytes (CD45+), T-cell (CD3+), T-help (CD3+CD4+), T-killer (CD3+CD8+), T-cellAktiv (CD3+HLA-DR+), T-helpAktiv (CD3+CD4+HLA-DR+), T-killAktiv (CD3+CD8+HLA-DR+), B-cell (CD19+), NK-cell (CD3-CD16+CD56+), T-NK-cell (CD3+CD16+CD56+).
Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов осуществляли стандартным методом прямого пятипа-раметрического иммунофлюоресцентного окрашива-
ния цельной крови с использованием коммерческого лизирующего/фиксирующего раствора OPTILYSE С (Beckman Coulter) и панели моноклональных антител tetraCHROME™ и IOTest (Beckman Coulter): 1-я панель - CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 и HLA-DR-PC7; 2-я панель - CD45-FITC/CD56-RD1/ CD19-ECD/CD3-PC5 и CD16-PC7. Контрольные пробы инкубировали с иммуноглобулинами, мечеными флуорохромами (FITC, RD1, ECD, PC5, PC7) соответствующего изотипа - мышиные IgG1, IgG2a IOTest (Beckman Coulter). Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре «Cytomics FC-500» (Beckman Coulter, USA), регистрировали суммарно не менее 10 тысяч событий. Данные анализировали с помощью программы CXP Cytometer (Beckman Coulter).
Определение показателя лимфоцитарно-тромбоци-тарной адгезии (ЛТА) проводили по методу, предложенному Ю. А. Витковским и соавт. (1999) [2]. Свежую гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность -1,077) и выделяли лимфоциты. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1 000 об./мин. в течение 3-4 минут. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Показатель ЛТА выражали числом лимфоцитарно-тромбоци-тарных коагрегатов на 100 клеток (норма - 13-15 %). Степень адгезии (ЛТИ) определяли как число кровяных пластинок, адгезированных на поверхности одного лимфоцита (норма - 3,0±0,3).
Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета анализа Microsoft Excel. Она включала описание выборки, нахождение средней арифметической, среднеквадрати-ческого отклонения и ошибки средней арифметической, определялись частоты встречаемости признаков, группировка данных.
Результаты и обсуждение
Установлено, что у всех больных хроническим вирусным гепатитом С изменены показатели иммуно-граммы, по сравнению с нормой. Средние значения показателей иммунограммы представлены в таблице 1; отклонения от нормы - в таблице 2.
Так, у 44,9 % обследованных относительное количество лимфоцитов оказалось сниженным (21,8± 0,8 %), при этом, абсолютное число лимфоцитов было снижено только у 8,7 %. Процент субпопуляции лимфоцитов CD3+CD4+ был повышен у 23,2 % пациентов (59 - 30,8 %), субпопуляции CD3+CD8+ - у 17,4 %.
В 50,7 % случаев обнаружены изменения в клеточном звене иммунитета: у 31,9 % больных выявлено снижение (1,13±0,05) иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), у 18,8 % больных иммунорегуляторный индекс был повышен (3,22±0,22).
Популяция активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) была существенно увеличена у 53,9 % обследованных (14,43 ± 2,10 %; 302,43 ± 40,81). В 89,9 % случаев установлено снижение активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLA-DR+) - 1,94± 0,11 %. Одновременно с этим у 69,6 % пациентов была
снижена субпопуляция активированных Т-киллеров (CD3+CD8+HLA-DR+) - 2,03± 0,15 %. Выявлено значительное снижение относительного и абсолютного количества популяции CD3-CD16+CD56+ у 82,6 % больных: 2,26±0,27 % и 45,70±5,88 соответственно.
Таблица 1
Средние значения показателей иммунного статуса у больных ХВГС
Показатели Норма Больные ХВГС, n=70
Lymphocytes (CD45+), % 28-36 27,65 ± 0,75
Lymphocytes (CD45+), H 1363-2808 2253,47 ± 84,95
T-cell (CD3+), % 61-85 80,05 ± 0,80
T-cell (CD3+), H 946-2079 1796,86 ± 69,04
T-help (CD3+CD4+), % 35-55 48,74 ± 1,03
T-help (CD3+CD4+), H 576-1336 1103,03 ± 48,93
T-killer (CD3+CD8+), % 19-35 27,59 ± 0,91
T-killer (CD3+CD8+), H 372-974 614,84 ± 30,66
CD4+/CD8+ 1,5-2,6 1,96 ± 0,10
T-cellAktiv (CD3+HLA-DR+), % 0,5-6,0 9,22 ± 1,21
T-cellAktiv (CD3+HLA-DR+), H 7-165 199,81 ± 24,34
T-helpAktiv (CD3+CD4+HLA-DR+), % 4-12 2,45 ± 0,26
T-killerAktiv (CD3+CD8+HLA-DR+), % 5-18 4,62 ± 0,69
B-cell (CD19+), % 7-17 10,25 ± 0,61
B-cell (CD19+), H 111-376 232,87 ± 18,61
NK-cell (CD3-CD16+CD56+), % 8-17 3,77 ± 0,46
NK-cell (CD3-CD16+CD56+), H 123-369 79,72 ± 9,70
T-NK-cell (CD3+CD16+CD56+), % 0,5-6,0 1,50 ± 0,30
T-NK-cell (CD3+CD16+CD56+), H 7-165 27,55 ± 5,99
Таблица 2
Отклонения от нормы показателей иммунного статуса у больных ХВГС
Показатели Распределение, в %
ниже норма выше
нормы нормы
Lymphocytes (CD45+), % 44,9 47,8 7,3
Lymphocytes (CD45+), H 8,7 69,6 21,7
T-cell (CD3+), % 1,5 76,8 21,7
T-cell (CD3+), H 2,9 69,6 27,5
T-help (CD3+CD4+), % 5,8 71,0 23,2
T-help (CD3+CD4+), H 5,8 69,6 24,6
T-killer (CD3+CD8+), % 10,2 72,4 17,4
T-killer (CD3+CD8+), H 13,0 81,2 5,8
CD4+/CD8+ 31,9 49,3 18,8
T-cellAktiv (CD3+HLA-DR+), % 0 46,1 53,9
T-cellAktiv (CD3+HLA-DR+), H 0 63,8 36,2
T-helpAktiv (CD3+CD4+HLA-DR+), % 89,9 8,6 1,5
T-killerAktiv (CD3+CD8+HLA-DR+), % 69,6 20,6 4,4
B-cell (CD19+), % 30,4 53,7 15,9
B-cell (CD19+), H 29,0 53,6 17,4
NK-cell (CD3-CD16+CD56+), % 82,6 17,4 0
NK-cell (CD3-CD16+CD56+), H 73,9 26,1 0
T-NK-cell (CD3+CD16+CD56+), % 50,7 44,9 4,4
T-NK-cell (CD3+CD16+CD56+), H 43,5 52,1 4,4
Лите
1. Баранов А. В. Эпидемиологические факторы и клинико-иммунологические аспекты патогенеза хронического гепатита С: автореферат ... дис. д-ра мед. наук. - М., 2009. - 47 с.
2. Витковский Ю. А., Кузник Б. И., Солпов А. В. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарного розеткоо-бразования // Иммунология. - 1999, № 4. - С. 35-37.
3. Гергесова Е. Е., Витковский Ю. А., Солпов А. В. Агрегация тромбоцитов, лимфоцитарно-тромбоцитар-ная адгезия и группы крови АВ0 у больных гриппом А(Н1Ш)/2009 // ЭНИ Забайкальский медицинский вестник. - 2011, № 1. - С. 4-9.
Субпопуляция CD19+ была сниженной в 30,4 % случаев (4,8±0,3 %), повышенной - в 15,9 % случаев (19,13 ±0,63). Процент CD3+CD16+CD56+ был снижен у 50,7 % больных (0,17 ±0,03 %), у 21,7 % был повышен процент CD3+ (88,89±0,86 %).
В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, особенно между системой гемостаза и иммунитета. Установлено, что тромбоциты имеют отношение к протеканию воспалительных реакций: адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения, а, следовательно, воспаления и развития иммунных и репаративных реакций [2, 3]. Этот феномен получил название лимфоцитарно-тром-боцитарной адгезии.
Установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С общий показатель ЛТА является пониженным - 9,130 (56 %). Одновременно с этим уменьшенным было и среднее число тромбоцитов, вступивших в контакт с лимфоцитами - 2,60± 0,12.
Т. е. показатель лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии был ниже нормы у 73,8 % обследованных пациентов (7,300 - 45 %), выше - у 11,5 %; показатель ЛТИ оказался ниже нормы в 47,5 % случаев (1,82±0,11), выше - в 27,1 %.
Выводы
Таким образом, противовирусный потенциал у больных хроническим вирусным гепатитом С обеспечивается выраженным ростом популяции активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) при значительном снижении популяций активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLA-DR+), активированных Т-киллеров (CD3+CD8+HLA-DR+), ЫК-клеток ^3-CD16+CD56+) и Т-ЫК-клеток (CD3+CD16+CD56+), что является проявлением дизрегуляции клеточного иммунитета и отражает иммунопатогенез НСУ-инфекции.
При этом установлено снижение лимфоци-тарно-тромбоцитарной адгезии у больных ХВГС в 73,8 % случаев, что свидетельствует о дисфункции Т-лимфоцитов, проявляющейся в уменьшении их способности к адгезии тромбоцитов.
Вышеизложенное позволяет рекомендовать определение иммунограммы и использование теста лимфо-цитарно-тромбоцитарной адгезии для оценки иммунитета у больных вирусным гепатитом С.
гтура
4. Марченко Л. И. и др. Оценка иммунологической реактивности больных хроническим вирусным гепатитом С // Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов. - СПб., 2003. - С. 381.
5. Мухин Н. А. «Трудный» больной в гепатоло-гии // Гепатологический форум (приложение к журналу «Клиническая фармакология и терапия»). - 2005, № 1. - С. 6-8.
6. Онищенко Г. Г. Ситуация и меры борьбы с вирусными гепатитами в Российской Федерации // Медицинская кафедра. - 2002, № 2. - С. 18-22.
7. Орлова И. И., Зайнудинов З.М., Каганов Б. С. Хронический гепатит С // Вопросы современной педиатрии. - 2004. - Т. 3, № 4. - С. 37-47.
8. Семененко Т. А. Клеточный иммунный ответ при гепатите С // Вирусные гепатиты. - 2000, № 1. -С. 11-17.
9. Скляр Л. Ф. Система цитокинов и показатели оксидативного стресса при хроническом гепатите С с учетом иммунокорригирующей терапии: дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 2006. - 270 с.
Координаты для связи с авторами: Сахарова Дарья Александровна - аспирант кафедры нормальной физиологии, ассистент кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ЧГМА, тел. +7-914-504-64-44, e-mail: d.sakharova@yandex.ru; Витковский Юрий Антонович - д-р мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой нормальной физиологии ЧГМА, тел. +7-914-468-77-66, e-mail: yuvitkovsky@ram-bler.ru; Терешков Павел Петрович - канд. мед. наук, заведующий лабораторией ЧГМА, тел. +7-924-271-6915, e-mail: tpp6915@mail.ru.
□□□
