CC BY
74
Медицинская иммунология 2010, Т. 12, № 1-2, стр. 133-138 © 2010, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
СОСТОЯНИЕ ИММУНИТЕТА И ЛИМФОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНОЙ АДГЕЗИИ ПРИ ДИФФУЗНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ЗОБЕ
Кузник Б.И., Витковский Ю.А., Гвоздева О.В.,
Роднина О.С., Солпов А.В.
ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия, г. Чита
Резюме. У больных диффузным токсическим зобом выявили снижение относительного числа лимфоцитов, клеток, несущих маркеры CD4+, CD8+, активных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), уменьшение абсолютного содержания Т-независимых (CD3-CD16+CD56+) и Т-зависимых (CD3+CD16+CD56+) NK-клеток. У больных диффузным токсическим зобом снижался уровень IgA и IgM. У подавляющего большинства этих больных резко уменьшалось количество лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов. Исследования параметров иммунограммы и адгезии тромбоцитов к лимфоцитам позволяет оценить особенности изменений адаптивного иммунного ответа при диффузном токсическом зобе.
Ключевые слова: зоб, иммунитет, лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты.
Kuznik B.I., Vitkovsky Yu.A., Gvozdeva O.V., Rodnina O.S., Solpov A.V.
IMMUNITY AND LYMPHOCYTE-PLATELET ADHESION IN DIFFUSE TOXIC GOITER Abstract. In patients with diffuse toxic goiter (DTG), relative numbers of CD4+, CD8+ lymphocytes, activated T-lymphocytes (CD3+HLA-DR+) proved to be increased, whereas absolute contents of T-independent (CD3"CD16+CD56+), and T-dependent (CD3+CD16+CD56+) NK-cells were found to be decreased. Moreover, IgA and IgM levels were decreased among DTG patients. In most DTG cases, amounts of lymphocyte-to-platelet agregates were sharply decreased. Studying parameters of immunogram, lymphocyte-
platelet adhesion allows of assessing specific changes (Med. Immunol., vol. 12, N1-2, pp 133-138)
Key words: goiter, immunity, leukocyte/RBC/platelet agregates.
Введение
Известно, что диффузный токсический зоб (ДТЗ), иначе болезнь Грейвса, является ярким примером аутоиммунного поражения щитовидной железы [4, 7]. Из-за нарушения иммунной толерантности цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ)
Адрес для переписки:
Кузник Борис Ильич,
ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия
672000, г. Чита, ул. Горького, 39а.
Тел.: (3022) 32-16-23.
Факс: (3022) 32-30-57.
E-mail: bi_kuznik@mail.ru
of adaptive immune response in diffuse toxic goiter.
инфильтрируют паренхиму щитовидной железы, вызывая ее деструкцию [9, 10, 11]. В конечном итоге наступает стимуляция В-лимфоцитов и начинается продукция стимулирующих щитовидную железу антител, повышенный синтез и высвобождение тиреоидных гормонов, а также пролиферация тиреоцитов.
Вместе с тем данные о состоянии иммунитета при ДТЗ отличаются противоречивостью. Рядом исследований [1, 11, 12] обнаружено, что при ДТЗ снижается абсолютное и относительное количество клеток, несущих маркеры CD3+, CD4+, но повышается CD16+ и CD19+. Одновременно уменьшается активность Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+) 7, 11, 20]. По данным
133
Кузник Б.И. и др.
Медицинская Иммунология
S.B. Solerte et al. [21], у больных ДТЗ существуют дефекты NK-клеток, связанные с нарушением синтеза и секреции фактора некроза опухолей (TNF) и интерлейкина-2 (IL-2). Снижение деятельности клеток NK при аутоиммунных болезнях щитовидной железы сопровождается увеличением соотношения T/B-лимфоцитов, что в конечном итоге приводит к усилению продукции аутоантител.
Между тем за последние годы предложен целый ряд новых тестов, позволяющих значительно расширить наши представления о функциях врожденного и адаптивного иммунитета. Один из них получил наименование лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) и заключается в том, что лимфоциты при активации присоединяют к себе тромбоциты, образуя конгломераты [2, 3, 6, 8, 14, 15, 17, 19]. Однако при ДТЗ эти взаимосвязи, оказывающие воздействие на состояние врожденного и адаптивного иммунитета, до последних лет не привлекали внимания исследователей.
В связи со сказанным основной целью наших исследований явилось изучение клеточного и гуморального иммунитета, а также лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) у больных диффузным токсическим зобом.
Клиническая характеристика больных. Под наблюдением находилось 76 больных ДТЗ в возрасте от 18 до 55 лет. Большинство из них (63 человека) составляли женщины. У 55 больных диагноз был выставлен впервые, 21 пациент обратились с рецидивом заболевания. Манифестная форма тиреотоксикоза наблюдалась у 70, осложненная — у 6 больных.
Всем больным проводилось клиническое обследование, включающее общий осмотр, измерение частоты сердечных сокращений, артериального давления, проведение ультразвукового исследования щитовидной железы и электрокардиографии.
Материалы и методы
Основные показатели иммунограммы изучались на проточном цитометре EpicsXL-MCL фирмы Beckman Coulter, США (реактивы Immunotech, Франция, поставка компании «Биохиммак») с определением в двухпараметрическом анализе поверхностных маркеров лейкоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD56+, CD19+, HLA-DR+.
Концентрация иммуноглобулинов классов G, А, М определялась методом турбодиме-трии с использованием поликлональных анти-
иммуноглобулиновых антител (реактивы Sentinel Diagnostics, Италия) на биохимическом анализаторе Pronto, Италия.
Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, относящегося к функциональным тестам оценки иммунокомпетентных клеток, проводили по методу, предложенному Ю.А. Витковским идр. [2]. Свежую гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографинфикол (плотность 1,077) и выделяли лимфоциты. Собирали интерфазное кольцо, содержащее клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали процент и абсолютное число лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов (ЛТА) к общему содержанию лимфоцитов, а также к количеству Т-хелперов (Тх) и Тх совместно с NK-клетками. Одновременно высчитывали, какое количество кровяных пластинок способен присоединить один лимфоцит, или лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс — ЛТИ [6].
У всех больных производилось определение концентрации тиреотропного гормона гипофиза (ТТГ) и основных гормонов щитовидной железы (Т3, Т4 и их свободных фракций), а также антител к тиреоидной пероксидазе осуществлялось в радиоизотопной лаборатории Областной клинической больницы методом радиоиммунного анализа (набор рио-Т3-ПГ и рио-Т4-ПГ)
Статистическая обработка данных проведена с использованием критерия Стьюдента, результаты представлены в виде М (среднее значение), m (средняя ошибка средней), SD (стандартное отклонение). C этой целью использована программа MS Excel.
Результаты и обсуждение
Как показывают наши исследования, у больных ДТЗ снижено относительное число лимфоцитов и клеток, несущих маркеры CD4+, CD8+. Одновременно у них уменьшалось количество активных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), а также абсолютное содержание NK (CD3-CD16+CD56+) и NKr (CD3+CD16+CD56+) клеток. Следует напомнить, что при болезни Грейвса одновременно нарушается функция натуральных киллеров [21], что является одним из патогенетических механизмов развития указанного заболевания.
134
2010, Т. 12, № 1-2
Иммунитет и диффузный токсический зоб
ТАБЛИЦА 1. СОСТОЯНИЕ КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНЫМ токсическим зобом (M±SD)
Показатель Контроль (здоровые) Больные
Лейкоциты 5922±925,2 6041,2±1463,3
Лимфоциты, % 35,1±9,3 35,9±11,5
абс./мкл 2255,1±713,3 2087,9±782,6***
CD3+, % 79,1±5,3 74,9±7,5*
абс./мкл 1662,3±468,6 1546,6±600,5
CD4+, % 49,2±7,8 49,5±6,9
абс./мкл 973,1±377,5 975,6±373,0
CD3+CD8+, % 27,3±6,5 22,8±5,3*
абс./мкл 561,2±214,7 508,4±289,9
(CD4+/CD8+) 1,9±0,8 2,3±0,7*
CD3+CD16+CD56+, % 4,2±2,1 3,4±2,4
абс./мкл 88,5±56,8 61,1±37,9*
CD3-CD16+CD56+, % 9,3±5,7 7,8±4,2
абс./мкл 211,6±139,5 156,2±86,2*
CD3-CD19+, % 9,3±2,5 15,2±8,3**
абс./мкл 194,2±70,6 327,4±216,4*
Т-кл./В-кл. (CD3+/CD19+) 9,1±2,3 6,1±4,2**
CD3+ HLA-DR, % 4,3±3,7 2,0±1,3***
абс./мкл 79,4±57,0 26,7±21,3***
IgA, г/л 2,1±0,8 1,9±0,9
IgM, г/л 1,6±0,6 0,9±0,6***
IgG, г/л 12,7±2,8 12,9±4,8
АТ к ТПО, ЕД/мл 0,0-30,0 333,0±233,5***
Примечание. ТПО - тиреоидная пероксидаза; * - р < 0,05; ** - p < 0,005; *** - p < 0,001.
У больных ДТЗ было повышено соотношение CD4+/CD8+, что характерно для заболеваний, сопровождающихся иммуноагрессией [4, 11,
16, 18, 21]. Кроме того, у этой категории больных значительно возрастало как абсолютное, так и относительное содержание В-лимфоцитов и уменьшалось соотношение Т/В (CD3+/CD19+) лимфоцитов. Уровень IgA и IgM у обследуемых больных снижался, тогда как концентрация IgG не претерпевала существенных изменений (табл. 1). У всех больных оказалось резко повышенным содержание антител к тиреоидной пе-роксидазе. Полученные нами данные во многом соответствуют сведениям, имеющимся в литературе [4, 5, 12, 21].
В следующей серии исследований мы изучили, как изменяется лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных с ДТЗ. Известно, что степень
лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии зависит от функционального состояния лимфоцитов и кровяных пластинок. В связи с тем, что клетками, способными к адгезивному взаимодействию с тромбоцитами, являются Т-хелперы (CD4+) и натуральные киллеры (CD16+), расчеты велись следующим образом: нами определялось не только процентное и абсолютное содержание ЛТА, но и лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ — среднее число тромбоцитов, присоединившихся к одному лимфоциту), а также общее количество тромбоцитов, связанных с лимфоцитами. Кроме того, вычислялось процентное и абсолютное содержание клеток CD4+ и CD16+, способных взаимодействовать с тромбоцитами (табл. 2).
Из представленных данных следует, что при ДТЗ наблюдается значительное снижение
135
Кузник Б.И. и др.
Медицинская Иммунология
ТАБЛИЦА 2. СОСТОЯНИЕ ЛИМФОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНОЙ АДГЕЗИИ У БОЛЬНЫХ ДТЗ (M±SD)
Исследуемые показатели Контроль (здоровые) Больные
Лимфоциты, мкл 2348±77 2084±492
ЛТА, % 14,11±1,1 5,7±4,2*
ЛТА/мкл 331,8±21,2 103,7±48,6*
ЛТИ 5,4±0,5 2,8±1,3*
Число тромбоцитов, принявших участие в ЛТА, в 1 мкл 1792,8±22,6 283,05±88,3*
Абсолютное содержание CD4+/мкл 1028±93 894,6±313,3
% ЛТА по отношению к клеткам CD4+ 32,2±3,3 11,35±3,5*
Абсолютное содержание CD4+ и СD16+/мкл 1255,6±123,4 1070±351,5
% ЛТА по отношению к Тх + NK (CD4+ и CD16+) 26,5±1,6 10,1±2,8*
Примечание. ЛТА - лимфоцитарно-тромбоцитарные агрегаты, ЛТИ - лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс. * - р < 0,05.
абсолютного и относительного числа ЛТА и лимфоцитарно-тромбоцитарного индекса (ЛТИ). Одновременно отмечается резкое уменьшение процента и абсолютного количества Т-хелперов (CD4+), а также суммы Т-хелперов и NK-лимфоцитов, способных присоединять к себе тромбоциты. Все это свидетельствует о том, что при ДТЗ существуют более серьезные изменения со стороны иммунитета, чем это может показаться на первый взгляд при изучении иммунограммы. Более того, оказалось, что чем тяжелее протекает заболевание и чем выше содержание гормонов щитовидной железы, тем меньшее число лимфоцитов способно присоединять к себе тромбоциты.
Все представленные нами данные свидетельствуют о том, что у больных диффузным токсическим зобом имеются характерные иммунологические изменения. В частности, обнаружено повышение числа клеток, несущих маркеры CD16+, CD19+, а также увеличение соотношения CD4+/CD8+. У больных ДТЗ показатели ЛТА и ЛТИ оказались значительно сниженными, что также свидетельствует о значительных нарушениях функции иммунной системы.
Как же могут быть расценены эти данные?
Известно, что ДТЗ является аутоиммунным процессом, и все основные реакции клеточного и гуморального иммунитета в основном протекают в тканях. Не вызывает сомнения, что при ДТЗ непосредственно в щитовидной железе возникает нарушение целости и функциональной активности эндотелия, благодаря чему затрудняется
экспрессия большинства адгезивных молекул. В результате этого нарушается кооперация и миграция клеток в зоне повреждения.
Между тем тромбоциты, с одной стороны, способны прилипать к субэндотелию, а с другой — к лимфоцитам. Прикрепление кровяных пластинок к поврежденной поверхности снижает реакцию лимфоцитов на коллаген как антиген. Одновременно с этим тромбоцит отчасти компенсирует недостающую антигенпрезен-тирующую функцию, утраченную в связи с повреждением эндотелия. Из тромбоцитов высвобождается IL-1, благодаря чему усиливается их контакт с лимфоцитами. Под воздействием IL-1 повышается продукция IL-2, стимулирующего функцию Т-хелперов второго клона (Th2), и натуральных киллеров (CD16+). Следует заметить, что IL-2 является специфическим индуктором адгезивной молекулы ICAM-1, рецептор которой находится на мембране лимфоцита [13, 18]. Таким образом, активированные лимфоциты, усиленно адгезирующие тромбоциты, благодаря ретракции последних продвигаются дальше через поврежденную сосудистую стенку вглубь к месту развития аутоиммунных реакций [14, 15, 17, 18, 22].
Но тромбоциты обладают и иными свойствами. Они усиливают миграцию не только ^ (CD4+), NK- и NKT-лимфоцитов, но и способствуют проникновению в ткани Т-киллеров (CD8+) и В-лимфоцитов. При этом они могут уменьшать иммуносупрессивный ответ Th и увеличивать клеточную пролиферацию Т-киллеров
136
2010, Т. 12, № 1-2
Иммунитет и диффузный токсический зоб
и их цитотоксичность. Кровяные пластинки стимулируют продукцию антител В-клетками, а также повышают эффективность цитолитической активности NK-лимфоцитов [14, 15].
Следовательно, уменьшение числа ЛТА, связанное с их уходом из кровотока в ткани при ДТЗ, является явно неблагоприятной реакцией, усиливающей аутоиммунные процессы.
Полученные данные свидетельствуют о том, что исследование ЛТА становится особенно ценным при одновременном определении показателей клеточного иммунитета. В подобных ситуациях ЛТА помогает более точно оценить те сдвиги, которые возникают в иммунитете, и сделать заключение о необходимости применения иммуномодулирующей терапии.
Список литературы
1. Бубнова Л.Н., Глазанова ТВ. Сравнительная характеристика иммунных нарушений у больных с диффузным токсическим зобом и аутоиммунным тиреоидитом // Научнопрактическая конференция «Клиническая эндокринология — достижения и перспективы», посвященная 80-летию со дня рождения проф. Д.Я. Шурыгина. - 2003. - С. 169-170.
2. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарного розеткообразования // Иммунология. - 1999. -№ 4. - С. 35-37.
3. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В. Патогенетическое значение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии // Медицинская иммунология. - 2006. -Т. 8, № 5-6. - С. 745-753.
4. Дедов И.И., Трошина Е.А., Антонова С.С. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы: состояние проблемы // Пробл. эндокринологии. - 2002. - № 2. - С. 6-13.
5. Жигжитова Е.Б. Патогенетическая иммунокоррекция тималином у больных диффузным токсическим зобом и аутоиммунным тиреоиди-том: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Чита, 2002. - 22 с.
6. Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., Витковский Ю.А. Единая клеточно-гуморальная система защиты организма // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2005. - № 2. - С. 3-16.
7. Петунина Н. Факторы прогноза консервативной терапии диффузного токсического зоба // Врач. - 2005. - № 3. - С. 62-63.
8. Солпов А.В. Влияние цитокинов на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию //
Тромбоз, гемостаз, реология. - 2002. - № 1. -С. 126-129.
9. Фадеев В.В., Бузиашвили И.И., Абрамова Н.А. Отдаленные результаты консервативного и хирургического лечения токсического зоба // Пробл. эндокринологии. - 2004. - Т. 50, № 6. -С. 3-9.
10. Фадеев В.В., Абрамова Н.А. Консервативное лечение болезни Грейвса: маркеры рецидива и ремиссии // Пробл. эндокринологии. - 2005. -Т. 51, № 6. - С. 44-49.
11. Фадеев В.В., Бузиашвили И.И., Мельниченко Г.А. Лечение токсического зоба; состояние и перспективы изучения проблемы // Врач. -2005. - № 3. - С. 32-36.
12. Шарипова З.Ф., Фархутдинова Л.М. Зависимость функции щитовидной железы от степени выраженности аутоиммунного компонента // Мед. иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 239.
13. Kuznik B.I., Tsibikov N.N. Cytokines, Immunoglobulins and Hemostasis // Hematol. Rev. - 1996. - Vol. 7, Part 2. - P. 43-70.
14. Li N. Platelet-lymphocyte cross-talk // J. of leukocyte Biol. - 2008. - Vol. 83. (In рпМ).
15. Li N., Ji Q., Hjmdahl P. Platelet-limphocyte conjugation differs between lymphocyte subpopulations // J. Thromb. Haemost. - 2006. -N 4. - P. 864-871.
16. Niemetc J. The role of protein synthesis on the generation of tissue factor activity by leucocytes // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). - 1972. - N 4. -Р. 1276-1277.
17. Savion N., Shenkman B., Brill G., Solpov A. Platelets Promote CD4+ Lymphocyte Adhesion to Extracellular Matrix and Fibronectin Under Flow: Role of Integrins, CD40 Ligand and P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 // J. Thromb. Haemost. -2005. - Vol. 3, N 1. - Р. 929.
18. Schmidt A.M., Hofmann M., Taguchi A. Rage: a multiligand receptor contributing to the cellular response in diabetic vasculopathi and inflammation // Semin. Thromb. Hemost. - 2000. - Vol. 26. -P. 485-493.
19. Shenkman B., Brill G., Solpov A.
CD4+ lymphocytes require platelet for adhesion to immobilized fibronectin in flow: Role of
P1 (CD29), P2 (CD18) related integrins and non-integrin receptors // Cellular Immunology. - 2006. -Vol. 242, N 1. - P. 52-59.
20. Shevach E.M. Supressor T cells: Rebirth function and homeostasis // Curr. Biol. - 2000. -Vol. 10. - P. 572-575.
137
Кузник Б.И. и др.
Медицинская Иммунология
21. Solerte B., Precerutti S., Garzaruso G. Defect of subpopulation of natural killer immune cells in Graves disease and Hashimoto's thyroiditis normalizing effect of degydroepian-drosterone sulfates // European journal of Endocrinology. — 2005. - Vol. 152. - P. 703-712.
22. Solpov A., Shenkman B., Vitkovsky Yu. Platelets enhance CD4+ lymphocyte adhesion
to extracellular matrix: role of CD40 ligand and P-selectin glycoprotein ligand // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2004. — N 4. — P. 25-27.
поступила в редакцию 01.06.2009 отправлена на доработку 21.08.2009 принята к печати 04.09.2009
138
