CC BY
12
Кардиология
КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ
A.B. Ефремов*, С.Д. Маянская*, А.Т. Тепляков**, С.Н. Шилов*, E.H. Березикова*, М.Г. Пустоветова*, Н.Ф. Яковлева*, И.Д. Сафронов*
* Новосибирский государственный медицинский университет, Новосибирск ** ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН, Томск
Ключевые слова: биоцидная активность лейкоцитов, эндотелиальная дисфункция.
В последние два десятилетия высокий, непрерывно возрастающий уровень распространенности хронической сердечной недостаточности (ХСН) в экономически развитых странах и в России позволяет говорить о надвигающейся «эпидемии ХСН» [3, 6]. Важная роль в развитии и прогрессировании ХСН отводится нарушениям функции эндотелия [5, 7, 8].
Эндотелий является «плацдармом», на котором постепенно развиваются все стадии ХСН [5, 7, 8]. Результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о нарушении функции эндотелия в крупных артериях при атеросклерозе и факторах его риска, а также при развитии ХСН. Многие исследователи рассматривают эндотелиальную дисфункцию как ранний ключевой этап сосудистого поражения при данных патологических состояниях [8, 12]. Согласно последним достижениям в ней-роэндокринологии, иммунологии и молекулярной медицине, активация системы провоспали-тельных цитокинов играет существенную роль в развитии и прогрессировании дисфункции эндотелия и ХСН [4, 11, 13]. Самыми изученными цитокинами, вовлеченными в патогенез ХСН, считаются фактор некроза опухоли, ин-терлейкины (ИЛ) ИЛ-1 и ИЛ-6. Хотя причинная связь детально не установлена, доказано, что состояние хронического воспаления имеет прогностическое значение для больных с ХСН [9]. В развитии молекулярных механизмов, лежащих в основе цитокининдуцируемых нарушений сократительной способности и ремоделирова-ния миокарда могут быть изменения генов, ответственных за выработку соответствующих факторов. В литературе данных об исследованиях ассоциаций полиморфизмов генов цитокинов ИЛ-113 (+3953) с сердечно-сосудистой патологией имеется относительно не много, а исследований о связи этих полиморфизмов с риском развития и характером прогрессирова-
ния ХСН у больных с ИБС и АГ мы не нашли, в. ЬаИшув^э е! а1. при исследовании взаимодействия между уровнем С-реактивного белка и полиморфизмами генов, кодирующих ИЛ-113 (-511), ИЛ-1(3 (+3953), ИЛ-1 Ра (УИТИ ¡Шгоп 2), ИЛ-6 (-174) и ИЛ-6 (-572) у 160 пациентов с ате-росклеротическим повреждением коронарных артерий обнаружили: высокие уровни СРБ у носителей Т-аллеля гена ИЛ-1 (3 (+3953) (Р<0,05) и низкие показатели СРБ у носителей аллеля гена ИЛ-1 Ра (Р<0,01) [10]. В другом исследовании у 674 пациентов с такой же патологией авторы не обнаружили ассоциаций между полиморфизмами генов, кодирующих ИЛ-1 а (-889), ИЛ-113 (-511 и +3953) с риском возникновения коронарной патологии [15]. В целом, все эти данные показывают неоднозначность результатов по ассоциации полиморфных вариантов выше перечисленных генов, поэтому данная проблема требует дальнейшего изучения и исследования. Показано, что эндотелий микрососудов сердца является одной из главных мишеней для активных форм кислорода (АФК) нейтрофилов [1]. Обладая высокой динамичностью и пластичностью, мощным биоцидным аппаратом, включающим широкий спектр гидролитических ферментов, способность наработки АФК, большого количества цитокинов и других факторов, фагоциты крови полностью реализуют свой эффекторный потенциал через воспалительные реакции в ходе ХСН. В связи с этим именно флогогенные факторы и медиаторы воспаления наиболее существенно влияют на фагоциты, побуждая их к функциональным перестройкам. Лейкоциты выступают как детектор воспаления, его интенсивности, кинетики и тенденции развития [1]. От активности всех кле-ток-эффекторов во многом зависит течение и прогрессирование дисфункции эндотелия, поэтому представляется крайне важным исследовать функциональную активность клеток как
звена, занимающего ключевую позицию в проблеме развития и прогрессирования ХСН.
Все это послужило основанием для планирования данного исследования. В связи с этим целью нашей работы было изучить влияние полиморфных вариантов гена ИЛ-1 (3 и биоцидной активности лейкоцитов на состояние функции эндотелия, а также на развитие и характер течения ХСН.
Для достижения цели определены следующие задачи: 1. Исследовать влияние полиморфизмов гена, кодирующего провосполительные цитокины, в частности ИЛ-1 (ИЛ-1 Р), на развитие и прогрессирование ХСН. 2. Исследовать спонтанную и индуцированную кислород зависимую биоцидность нейтрофилов крови в зависимости от тяжести ХСН. 3. Оценить выраженность эндотелиальной дисфункции в условиях системной воспалительной реакции у больных с ХСН с разной степенью тяжести заболевания.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
На базе отделения неотложной терапии МУЗ ГКБ № 1 г. Новосибирска и отделения хронической сердечной недостаточности ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра г. Томска было обследовано 165 пациентов (121 мужчина и 44 женщины) в возрасте от 45 до 65 лет (средний возраст 56,7±5,3), которые находились на стационарном лечении по поводу декомпенсации ХСН различной этиологии: ИБС в сочетании с АГ - 129 случаев, ИБС - 24 случая, АГ - 12 случаев. В группу контроля вошли 114 человек (54 мужчины и 60 женщин) в возрасте от 45 до 65 лет (средний возраст 53,2±4,9), не имеющих поданным клинического обследования и электрокардиографии признаков сердечно-сосудистых нарушений.
Верификация диагноза основывалась, прежде всего, на анализе клинических данных, а также данных инструментальных исследований, включающих электрокардиографию в покое в 12 общепринятых отведениях, рентгенографию грудной клетки, эхокардиографию, общеклиническом и биохимическом исследовании крови и мочи.
Все пациенты, включенные в исследование, были разделены по функциональному классу ХСН согласно классификации Нью-йоркской ассоциации кардиологов (NYHA) (1964), с использованием теста с 6-минутной ходьбой. ХСН ФК I в 37 случаях (22,4%); ФК II в 69 случаях (41,8%); ФК III в 54 случаях (33%); ФК IV в 5 случаях (3%). Кроме того, у 92 пациентов (56%)
был выявлен постинфарктный кардиосклероз. Из них мужчин 34 - в возрасте от 43 до 81 года (средний возраст 64,3±1,5 лет), женщин - 42, в возрасте от 51 до 89 лет (средний возраст 69,7±1,4 лет).
На каждого больного заполнялась соответствующая клиническая карта. В течение последующих 2 месяцев проводилось клиническое наблюдение обследованных больных. Оценивались конечные точки: летальность, частота повторных госпитализаций по поводу ХСН, ухудшения течения хронической сердечной недостаточности.
Всем пациентам производился забор генетического материала (букальный эпителий) с последующим типированием аллелей гена ИЛ-1 ß (С+3953Т). Для выделения ДНК использовали метод фенол-хлороформной экстракции. Для проведения ПЦР использовали праймеры, синтезированные в Институте химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН). Структуры праймеров гена ИЛ-Iß (С+3953Т): прямой-TCCCTACTGGTGTTGTCATCAG; обратный - CTTGGGTGGACATGGTCCTG. ПЦР проводили в конечном объеме 12 мкл, содержащем 650 мМ трис.-HCI (pH 8,9), 160 мМ сульфат аммония; 20 мМ MgCI2; 0,05% Tween 20; 2 mM dNTP; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 20-100 нг ДНК и 1 ед. Taq-полиме-разы. Реакцию проводили на амплификаторе «Eppendorff» с начальной денатурацией при 95 °С 3 мин, далее в течение 35 циклов с денатурацией 10 с при 95 °С, отжигом 10 с при 62 °С и синтезом 15 с при 72 °С. Финальная элонгация проводилась при 72 °С 5 мин.
Для проведения ПДРФ-анализа полученных фрагментов ДНК, рестрикцию осуществляли следующим образом. К амплификационной смеси добавляли 1/10 V 10х буфера для рестрикции и эндонуклеазу рестрикции (1-3 ед. акт. фермента) и инкубировали 2 ч при 65 °С. Буфер для рестрикции использовали с учетом рекомендаций производителя эндонуклеазы рестрикции. Фермент инактивировали добавлением 1 мкл 0,5 М ЭДТА.
При гидролизе амплификационного фрагмента гена ИЛ-Iß эндонуклеазой рестрикции Taql выявлялось три фрагмента размером 550, 440 и 110 п.н. Фрагмент 550 п.н. соответствует ам-плификационному фрагменту, не подвергнувшемуся гидролизу, что указывает на присутствие аллеля Т (+3953Т) гена ИЛ-Iß. При наличии ал-леля С (С+3953) происходит разрезание амплификационного фрагмента ДНК на два, размером 440 и 110 п.н.
Кардиология
Функциональная активность нейтрофилов оценивалась с помощью спонтанного и стимулированного теста с тетразолием синим (сНСТ-тест и иНСТ-тест), спектрофотометрическим методом [2] (спектрофотометр Мультискан МСС 340). Материалом для исследования служила венозная кровь. Спонтанная кислород зависимая биоцидность лейкоцитов крови у пациентов ХСН оценивалась по индексу фагоцитоза (ИФ). Индуцибельная активность лейкоцитов крови оценивалась по коэффициенту функцио-нально-метаболической активности фагоцитов (КФМА).
Эндотелиальная дисфункция оценивалась допплерометрическим измерением диаметра плечевой артерии (аппарат «Sonolim Versa Plus», Simens, Германия) в покое и в пробе с реактивной гиперемией и нитроглицерином. Исходно измерение диаметра плечевой артерии осуществляли в покое с помощью линейного датчика 7 МГц. Для оценки эндотелий-зависи-мой вазодилатации (ЭЗД) проводили пробу с реактивной гиперемией. Изменения диаметра сосудов выражали в процентах по отношению к исходной величине. Эндотелий-независимую вазодилатацию (ЭНЗД) оценивали путем измерения диаметра плечевой артерии в ответ на сублингвальный прием нитроглицерина 0,0005 г.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью стандартного статистического пакета программ SPSS 13,0. Сравнение частот встречаемости генотипов полиморфных локусов в различных популяциях проводили методом %2. Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций методом %2 проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия; http://ihg.gsf.de/ihg/ index_engl.html) [14]. Сравнение средних значений анализируемых показателей проводили с помощью t-критерия Стьюдента или U-крите-рия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение частот встречаемости генотипов гена ИЛ-1Р в группе больных соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга, а в контрольной группе в целом и у мужчин из этой группы наблюдалось значимое отклонение от ожидаемого распределения генотипов (р=0,032 и р=0,015, соответственно), что, вероятнее всего, может быть обусловлено тем, что группа контроля не является случайной выборкой. Результаты исследования полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-113 в целом в группе контроля и в группе больных представлены в табл. 1.
Оказалось, что в целом в группе больных частота аллеля С и генотипа С/С была достоверно выше, а частота аллеля Т и генотипов С/Т и Т/Т была достоверно ниже, чем в группе контроля. Таким образом, аллель С (014=1.886, С.I.=[1.283-2.774], %2 =10.55, р=0.00116) и генотип С/С (014=3.798, С.1.=[1.060-13.607], %2 =4.72, р=0.02984) являются факторами риска развития ХСН, а аллель Т (014=0.530, С.I.=[0.360-0.780], х2 =10.55, р=0.00116) и генотипы С/Т (014=0.453, С.I.=[0.275-0.746], %2 =9.83, р=0.00172) и Т/Т (014=0.263, С.I.=[0.073-0.943], х2 =4.72, р=0.02984) проявили себя как протективный фактор. Результаты исследования влияния генетических маркеров гена ИЛ-1(3 на степень тяжести ФК ХСН (по ЫУНА) представлены в табл. 2.
Были получены достоверные различия по частоте встречаемости генетических маркеров гена ИЛ-1[3 в зависимости от тяжести ФК ХСН. Частота генотипа С/С у пациентов с ФК 3 и 4 была достоверно выше, чем у пациентов с ФК 2 и 1 (83,1, 59,4 и 32,4%, р<0,05 и р<0,001, соответственно), а у пациентов с ФК 2 значимо выше, чем у пациентов с ФК 1 (р<0,05). Тогда как генотипы, содержащие аллель Т, у пациентов с ФК 2 встречались чаще, чем у па-
Таблица 1
Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1р
в группе больных ХСН и в группе контроля
Выборка Аллели, п (%) Генотипы, п (%)
С Т С/С С/Т Т/Т
Группа контроля, п=114 154 (67,5) 74 (32,5) 47 (41,2) 60 (52,6) 7 (6,2)
Группа больных, п=165 263 (79,7)* 67 (20,3)* 102 (61,8)* 59 (35,8)* 4 (2,4)*
* достоверность различий по сравнению с группой контроля, р<0,05
циентов с ФК 3 и 4 (40,6 и 16,9%, р<0,001), но реже, чем у пациентов с ФК 1 (40,6% против 67,6%, р<0,05). Различия по частоте ал-леля С (ФК 1 - 63,5%, ФК 2 - 79% и ФК 3+ФК 4 - 90,7%) и аллеля Т (ФК 1 - 36,5%, ФК 2 -21% и ФК 3+ФК 4 - 9,3%) также оказались достоверными.
Оказалось, что среди пациентов, имеющих генотип С/С полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1 р, реакция на гиперемию (ЭЗД) и нитроглицерин (ЭНЗД) существенно снижена по сравнению с данными показателями у пациентов, имеющих аллель Т (4,7±1,2 против 8,9±1,6, р<0,05 и 11,7±0,31 против 16,3+0,27, р<0,05, соответственно). При этом исходный диаметр артерии у пациентов с разными генотипами достоверно не различался.
Эндотелиальная дисфункция прямо коррелировала с тяжестью процесса (г=0,7354, р<0,05), о чем говорит явное снижение эндотелий зависимой вазодилатации у пациентов с высоким ФК по отношению к пациентам с начальными классами ХСН.
Была прослежена прямая корреляция показателей НСТ-теста с тяжестью процесса (г=0,7826, р<0,05), глубиной ремиссии. Спонтанная биоцидность лейкоцитов у всех больных ХСН была значительно снижена по сравнению с контролем, так, ИФ у пациентов с ФК 2 и ФК 3 был в 1,9 раза и в 1,4 раза был выше, чем у пациентов с ФК 4. Принципиально важно, что у больных ХСН во всех группах не выявлялось признаков активного воспаления общедоступными методами (нормальные СОЭ, число лейкоцитов в крови, сдвиг лейкоцитарной формулы влево). У пациентов с ФК 4 наблюдалось наибольшее истощение индуцибель-ного потенциала клеток по сравнению с другими функциональными классами, что свидетельствовало о неблагоприятном течении заболевания в данной группе.
ВЫВОДЫ
1. Таким образом, в ходе проведенного исследования было выявлено, что аллель С полимор-
Таблица 2
Распределение частот встречаемости генотипов и аллелей гена ИЛ-1р (С+3953Т)
в зависимости от ФК ХСН (ЫУНА)
Генетический ФК 1, ФК 2, ФК 3+ФК 4,
маркер п=37 п=69 п=59
Генотип С/С 12 (32,4%) 41 (59,4%)*# 49 (83,1%)**
Генотип С/Т 23 (62,2%) 27 (39,1 %)*# 9 (15,2%)**
Генотип Т/Т 2 (5,4%) 1 (1,5%) 1 (1,7%)
Аллель С 47 (63,5%) 109 (79%)* 107 (90,7%)*
Аллель Т 27 (36,5%) 29 (21%)*# 11 (9,3%)**
* достоверность различий по сравнению с ФК 1, р<0,05; ** достоверность различий по сравнению с ФК 1, р<0,001; #достоверность различий по сравнению с ФК 3, р<0,05
Таблица 3
Показатели сосудодвигательной функции эндотелия у больных ХСН в зависимости от генотипов гена ИЛ-1Р
Генотипы гена ИЛ-1 в
Показатель С/С С/Т + Т/Т
(п=102) (п=63)
Исходный диаметр 3,58±0,08 3,75±0,15
артерии, мм
ЭЗД, % 4,7±1,2* 8,9±1,6
ЭНЗД, % 11,7±0,31* 16,3±0,27
* достоверное различие с генотипами С/Т+Т/Т (р<0,05)
Кардиология
фного локуса С+3953Т гена ИЛ-113 ассоциирован с риском развития, тяжестью клинических проявлений ХСН, тогда как аллель Т полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-113 ослабляет риск развития данной патологии.
2. Прогрессирование хронической сердечной недостаточности сопровождается снижением эндотелий зависимой и эндотелий независимой вазодилатации. Значимо более выраженные нарушения сосудодвигательной функции эндотелия отмечаются у гомозигот по аллелю С полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1 р по сравнению с носителями аллеля 3953Т.
3. Выраженность эндотелиальной дисфункции нарастает по мере прогрессирования хронической сердечной недостаточности и сопровождается снижением спонтанной и индуцированной биоцидности нейтрофилов крови в зависимости от тяжести заболевания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маянская С.Д. Патогенетическая роль и прогностическая значимость воспалительных реакций в развитии нестабильной стенокардии и острого инфаркта миокарда: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Новосибирск, 2000. С. 247.
2. Маянский Д.Н. и др. Определение биоцидности лейкоцитов: методич. рекомендации. Диагностическая ценность лейкоцитарных тестов. Новосибирск, 1996. С. 32.
3. Тепляков А. Т. Клиническая диагностика ише-мической дисфункции при минимально инва-зивной реваскуляризации миокарда. Томск: Изд-во ТГУ, 2003. С. 11.
4. Bozkurt В. // Ann. Rheum. Dis. 2000. V. 59. P. 90-93.
5. Burnier M. // Schweiz. Rundsch. Med. Prax. 1997. V. 86. № 7. P. 242-245.
6. Cleland J. // Heart. 1996. V. 76. P. 53-59.
7. Dusting G.J. //EXS. 1996. V. 76. P. 33-55.
8. Katz S.D. // Curr. Opin. Cardiol. 1997. V. 12. № 3. P. 259-264.
9. Landmesser U. //Circulation. 2002. V. 106. № 24. P. 3073-3078.
10. Latkovskis G. //Eur. J. Immunogenet. 2004. № 31 (5). P. 207-213.
11. Long C.S. // Heart Fail Rev. 2001. V. 6 (2). P. 81-94.
12. Luscher T.F. // Circulation. 1993. V. 87. № 7. P. 97-103.
13. Mann D.L. //Circulât Res. 2002. V. 91. P. 988-998.
14. Weir BS. Statitical Data Analysis II. Methods for Discrete Population Genetic Data. USA, Sinauer As-sociates. 1996. P. 91-140.
15. Vohnout B. // Haematologica. 2003. V. 88 (1). P. 54-60.
CELLULAR AND MOLECULAR-GENETIC ASPECTS OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION IN PATIENTS WITH CHRONIC CARDIAC FAILURE
A.V. Yefremov, S.D. Mayanskaya, A.T. Tepliakov, S.N. Shilov, Ye.N. Beresikova, M.G. Pustovetova, N.F. Yakovleva, I.D. Safronov Focus of the study was placed on the impact of multiform versions of Hfl-ip gene and biocidal activity of leukocytes on the endothelium function condition, as well as on chronic cardiac failure (CCF) development and course. Sampling of genetic material (bucal epithelium) was carried out in 165 patients with CCF of varied severity, which was followed by typing the alleles of Hfl-ip (C+3953T) gene. One of the objectives was to evaluate the endothelium function by making use of endothelium-dependent and endo-thelium-independent vasodilatation of brachial arteries and to simultaneously study the functional activity of neutrophils. It was found out that multiformity of 1/1X1-1 p gene was related to the risk of CCF development and severity, as well as to the vasomotor dysfunction of endothelium. The endothelial dysfunction becomes more evident, as CCF advances and it is accompanied by a decrease in idiopathic and induced biocidity of blood neutrophils depending on severity of the failure.
