С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2006
УДК 615.356:577.161.3]. 03:615.9.015.4.076.9
А. С. Иванова, О. А. Пахрова, С. Б. Назаров
СОСТОЯНИЕ ЭРИТРОФАГОЦИТОЗА У КРЫС ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПОСТУПЛЕНИИ В ОРГАНИЗМ НИТРИТА НАТРИЯ И а-ТОКОФЕРОЛА
Кафедра нормальной физиологам, физики, математики, информатики ГОУ ВПО Ивановская государственная медицинская академия Росздрава
Изучение влияния нитритов на организм человека и животных имеет важное прикладное значение. Эти анионы способны поступать в организм различными путями, а также синтезироваться dc novo. Нитриты оказывают влияние на клетки и ткани непосредственно и через образование NO, N02, N203, ONOO", которые являются регуляторами физиологических функций и участвуют в развитии патологических процессов [7, 17].
При нитритной интоксикации отмечаются изменения количественных показателей периферической крови, которые в первую очередь связаны с метгемоглоби-немией, активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран эритроцитов, снижением активности системы антиоксидантной защиты (АОЗ) [1,2, 13]. В этих условиях для предупреждения повреждения клеток в литературе описано применение как естественных антиоксидантов (витамин Е [1], аскорбиновая кислота [3]), так и ксенобиотиков (метиленовый синий |19], производные виолуровой кислоты [1], ферроцены, 5-окси-6-метилуроцил [9]). Токоферол — типичный ингибитор процессов ПОЛ, обладающий высокой константой взаимодействия со свободными радикалами. Он раньше других антиоксидантов расходуется в окислительных реакциях, протекающих в липидах. Действие витамина Е на состояние эритрофагоцитоза при нитритной интоксикации не изучено.
Цель работы — оценка влияния а-токоферола на показатели клеточных механизмов эритродиереза у крыс при нитритной интоксикации различной длительности.
Исследование проводили на 121 белой беспородной крысе-самке массой 180—255 г. Нитритную интоксикацию вызывали, используя вместо питьевой воды 0,2% раствор нитрита натрия [18]. Животные были разделены на 4 группы. Крысы 1-й группы (я = 60) получали вместо питьевой воды 0,2% раствор нитрита натрия, 2-й (л = 20) — раствор нитрита натрия и внутримышечные инъекции фармакопейного а-токоферола в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю, 3-й (w = 20) — токоферол в дозе 150 мг/кг, животные 4-й группы (л = 10) — раствор нитрита натрия и внутримышечные инъекции стерильного растительного масла (эта группа была контрольной). Перед началом эксперимента производили забор периферической крови из насечки хвоста. В крови определяли содержание эритроцитов, гемоглобина, оценивали поверхностную цито-архитектонику эритроцитов, количество ретикулоцитов. Повторно показатели периферической крови, состояние эритропоэза и клеточных механизмов эритродиереза, концентрацию нитратов в крови оценивали на 3, 7, 14 и 21-й дни эксперимента. Для получения нормативных значений показателей, характеризующих состояние эритроидного ростка кроветворных органов, активности эритрофагоцитоза, содержания нитратов в крови были дополнительно исследованы 11 крыс.
Состояние клеточных механизмов эритродиереза оценивали, используя методику краткосрочного культивирования перитонеальных макрофагов с аутологичны-ми эритроцитами [16]. Макрофаги крыс взаимодействуют с аутологичными эритроцитами in vitro с образованием розеткоподобных структур. Производили дифференциальный подсчет этих структур с выделением макрофагов, не адгсзировавших эритроциты (МФ0), и макрофагов, несущих на своей поверхности 1—2 (1-й тип; МФ,), 3-5 (2-й тип; МФ2), 6-8 (3-й тип; МФЛ), более 9 эритроцитов (4-й тип; МФ4). Для характеристики завершен-
ного фагоцитоза проводили реакцию на внутриклеточный гемоглобин, после чего определяли количество макрофагов без гемоглобина (МФ6/Г) и макрофагов с фаго-сомами (МФф„) и диффузными гемоглобиновыми включениями (МФ„„).
Для интегральной оценки клеточных механизмов эритродиереза рассчитывали индекс адгезионно-фаго-цитарной активности (ИАФА) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) по формулам
ИАФА = (МФ, + 2 • МФ2 + 3 • МФ3 + 4 • МФ4)/МФ0;
ИЗФ = (МФ„иг + 2 • МФ„И)/МФ6/Г.
Концентрацию нитратов определяли с использованием ионоселективного электрода (НИИ химии СПбГУ). Эвтаназию животных осуществляли под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) путем дислокации шейных позвонков.
Статистическую обработку полученных результатов производили методами вариационного анализа с использованием /-критерия Стьюдента.
В результате потребления 0,2% раствора нитрита натрия у животных наблюдается достоверное увеличение концентрации нитратов в крови — до 4,5 ± 0,43 ммоль/л на 3-й день (р < 0,05) и до 7,9 ± 0,57 ммоль/л на 21-й день (р < 0,05) при 1,1 ±0,11 ммоль/л в контроле. Введение растительного масла в контрольной группе не влияет на этот показатель.
При нитритной интоксикации на 3-й сутки эксперимента отмечаются существенные изменения показателей периферической крови, что может быть связано с токсическим влиянием нитритов на эритрон. Количество эритроцитов и гемоглобина снижается, значительно увеличивается число деформированных клеток с преобладанием необратимо деформированных эритроцитов. Изменений содержания эритроидных клеток в кроветворных органах не отмечается. К 14-му дню опыта развивается эритроцитоз, происходит повышение концентрации гемоглобина, активируется эритропоэз в красном костном мозге и селезенке. На 21-й день эксперимента основные показатели возвращаются к исходному уровню, но активность эритропоэза остается выше контрольных значений [2].
При введении токоферола на фоне нитритной интоксикации к 3-му дню развивается эритроцитоз, далее количество эритроцитов возвращается к исходным значениям. Поверхностная цитоархитектоника красных клеток не изменяется во все сроки наблюдения. Ретикуло-цитоз наблюдается на 7-й и 21-й дни, его выраженность снижается. В кроветворных органах содержание эритроидных клеток достоверно не отличается от контрольных значений.
Введение токоферола интактным животным не оказывает влияния на количество эритроцитов, гемоглобина, поверхностную цитоархитектонику, но способствует увеличению содержания ретикулоцитов без эритроидной гиперплазии кроветворных органов, вероятно, за счет замедления скорости их созревания.
При нитритной интоксикации на всех сроках эксперимента отмечается активация клеточных механизмов эритродиереза (см. таблицу). На 3-й день опыта количество МФ, увеличивается на 67,9% по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Также достоверно повышается число МФ2 и МФ3. Результаты реакции на внутриклеточный гемоглобин демонстрируют увеличение коли-
Изменение показателей клеточных механизмов эритроднереза
Показатель Группа животных Исходное значение 3-й день 7-й день 14-й день 21-й день
МФ„, % 1-Я 73,6 ± 1,63 49,7 ± 3,62* 60,9 ± 4,07* 53,0 ± 2,50* 44,1 ±4,15*
2-я 73,6 ± 1,63 72,5 ± 1,98 79,7 ± 1,50*
3-я 73,6 ± 1,63 81,0 ±4,06 84,3 ± 2,66*
МФ„ % 1-я 24,5 ± 1,75 41,7 ± 2,93* 31,6 ± 3,30** 34,9 ± 2,05* 46,8 ± 3,29*
2-я 24,5 ± 1,75 26,5 ±1,81 19,0 ± 1,26*
3-я 24,5 ± 1,75 16,8 ± 2,50* 14,3 ± 2,03*
МФг, % 1-я 2,00 ± 0,75 5,07 ± 1,51* 6,23 ± 1,17* 2,29 ± 0,61** 8,07 ± 1,42*
2-я 2,00 ± 0,75 1,00 ± 0,57 1,30 ±0,51
3-я 2,00 ± 0,75 2,20 ± 1,88 1,40 ±0,89
МФ„ % 1-я 0,00 0,71 ± 0,26* 0,54 ± 0,23* 0,14 ± 0,14 0,00
2-я 0,00 0,00 0,00
3-я 0,00 0,00 0,00
МФ4, % 1-я 0,00 0,07 ± 0,07 0,00 0,00 0,00
2-я 0,00 0,00 0,00
3-я 0,00 0,00 0,00
ИАФА 1-я 0,40 ± 0,03 1,79 ± 0,76 0,96 ± 0,26 0,68 ± 0,08* 2,05 ± 0,44*
2-я 0,40 ± 0,03 0,41 ± 0,05 0,28 ± 0,03*
3-я 0,40 ± 0,03 0,33 ±0,13 0,22 ± 0,05*
МФ6/Г, % 1-я 74,5 ±1,41 53,5 ± 2,96* 66,5 ± 1,64* " 65,0 ± 1,48* 53,5 ± 1,47*
2-я 74,5 ±1,41 76,0 ± 2,52 78,1 ± 1,57
3-я 74,5 ±1.41 78,5 ± 1,94 79,0 ±2,16
МФ,И, % 1-я 17,6 ± 1,09 26,1 ± 2,11* 20,9 ± 1,03*- *• 21,0 ± 1,04* 31,5 ± 1,05*
2-я 17,6 ± 1,09 14,4 ± 1,64 12,9 ± 1,04*
3-я 17,6 ± 1,09 12,5 ± 1,23 13,3 ± 1,53
МФШ. % 1-я 8,00 ± 0,60 19,7 ± 1,51* 12,5 ± 1,55* *' 14,0 ± 1,20* 14,3 ± 0,57*
2-я 8,00 ± 0,60 9,60 ± 1,09 9,00 ± 0,95
3-я 8,00 ± 0,60 9,00 ± 1,03 7,70 ± 1,12
ИЗФ 1-я 0,46 ± 0,03 1,44 ± 0,22* 0,71 ± 0,03* 0,77 ± 0,06* 1,15 + 0,07*
2-я 0,46 ± 0,03 0,45 ± 0,03 0,40 ± 0,04
3-я 0,46 ± 0,03 0,40 ± 0,04 0,38 ± 0,05
Примечание. Звездочка — достоверные различия с исходными данными; две звездочки — достоверные отличия от предыдущего срока наблюдения.
чества макрофагов с фагосомами и диффузными гемо-глобиновыми включениями. ИАФА макрофагов достоверно не изменяется, ИЗФ повышается на 214% (р < 0,05). С 7-го по 14-й день активность клеточных механизмов эритродиереза снижается, оставаясь выше контрольных значений. На 7-й день на фоне снижения количества макрофагов, образующих розетки 1-го типа, увеличивается количество розеток 2-го типа, индекс завершенного эритрофагоцитоза повышен на 55,4% (р < 0,05). К 14-му дню наблюдается значительное снижение количества макрофагов, образующих розетки 2-го и 3-го типов. ИАФА макрофагов выше на 71,7% (р < 0,05), чем в контрольной группе, а ИЗФ — на 68,9% (р < 0,05). К 21-му дню эксперимента повторно отмечается значительное повышение активности эритрофагоцитоза за счет макрофагов, образующих розетки 1,2,3-го типов. ИАФА макрофагов достигает максимальных значений, повышаясь на 416,6% (р < 0,05), ИЗФ увеличивается на 152,4% по сравнению с таковым в контрольной группе (р < 0,05).
Причиной активации эритродиереза может быть влияние нитритов и их метаболитов как на эритроциты, так и на макрофаги [4]. Токсическое влияние на красные клетки крови изменяет нормальную структуру их мембран, снижается содержание сиаловых кислот [ 15|. Эритроциты воспринимаются макрофагами как старые и активно фагоцитируются [12]. NO и нитриты способны активировать все стадии фагоцитоза. Они влияют на положительный хемотаксис через систему цитоскелета макрофагов, стимулируют адгезию макрофагов [14], модифицируют мембраны лизосом, повышают их проницаемость и выход лизосомальных ферментов [5,6]. При нит-ритной интоксикации наблюдается снижение активности системы АОЗ [12], происходит усиление процессов ПОЛ, повышается вязкость плазматических мембран
макрофагов и в последующем возникают функциональные перестройки, что также сопровождается активацией клеток [8].
При введении токоферола параллельно с нитритом натрия не наблюдается активации клеточных механизмов эритродиереза. Количество макрофагов, не адгези-рующих на своей поверхности эритроциты, на 7-й день эксперимента достоверно не отличается от значений ин-тактных животных. К 21-му дню этот показатель становится выше контрольного на 8,2% (р < 0,05). Число макрофагов, адгезирующих на своей поверхности 1—2 эритроцита, достоверно снижается на 22,9% (р < 0,05). ИАФА уменьшается на 30,2% (р < 0,05). При оценке завершенного фагоцитоза на 21-й день снижается количество МФ^Г.
Введение токоферола интактным животным приводит к более значительному снижению адгезионной активности макрофагов по сравнению с контролем. На 21-й день количество макрофагов, не образующих розетки, повышается на 10% (р < 0,05), а процент макрофагов, образующих розетки 1-го типа, снижается на 31,8% (р < 0,05). ИАФА уменьшается на 17,8% (р < 0,05), при оценке завершенного фагоцитоза достоверных отличий от контрольных значений не обнаружено.
Полученные результаты можно объяснить тем, что процессы ПОЛ ответственны за образование адгезионных сайтов эритроцитарных мембран [10]. Антиоксидан-ты снижают способность макрофагов связывать эритроциты, что может быть опосредовано ингибированием лектиноподобных рецепторов [11]. Кроме того, витамин Е связывается с фосфолипидами мембраны макрофага и прямо влияет на микровязкость мембраны, а также на экспрессию и функции клеточных рецепторов, уменьшает цитотоксичность за счет снижения высвобождения перекиси водорода [8].
Таким образом, нитрит натрия оказывает стимулирующее влияние на процесс эритрофагоцитоза. Этот эффект зависит от продолжительности поступления вещества в организм. ИАФА и ИЗФ повышаются. Токоферол в дозе 150 мг/кг на фоне хронической нитритной интоксикации снижает фагоцитарную активность макрофагов, защищая организм от развития анемии.
Литература
1. Бурбелло А. Т., Баскович Г. А., Доброхотова Е. Г., Слесарев В. И. // Гиг. труда. - 1991. - № 8. — С. 13-15.
2. Иванова А. С., Пахрова О. А., Назаров С. Б. // Гиг. и сан. - 2004. - № 1. - С. 58-60.
3. Кораблев М. В., Кубарт Н. М., Евец М. А., Станкевич П. Б. // Фармакологическая коррекция гипоксиче-ских состояний. — М., 1989. — С. 149—154.
4. Мясоедова Е. Е., Назаров С. Б. // Рос. физиол. журн.
- 2003. - Т. 89, № 5. - С. 613-615.
5. Покровский А. А., Тутельян В. А. Лизосомы. — М., 1976.
6. Реутов В. П., Орлов С. Н. // Физиол. человека. — 1993. - Т. 19, № 1. - С. 124-136.
7. Реутов В. П., Каюшин Л. П., Сорокина Е. Г. // Физиол. человека. - 1994. - Т. 20, № 3. - С. 165-174.
8. Шарма нов А. Т., Айдарханов Б. Б., Курмангалиев С. М. // Бюл. экспер. биол. - 1986. - Т. 101, № 6.
- С. 723-725.
9. Шугалей И. В., Целинский И. В., Львов С. Н. и др. // Укр. биохим. журн. — 1994. — Т. 66, № 2. — С. 98
- 103.
10. Верри М., Ochiai Н., Kikugawa К. // Biochim. Biophys. Acta. - 1987. - N 2. - P. 244-253.
11. Верри M., Watanabe /., Yokota A. et. al. // Biol. Pharm. Bull. - 2001. - Vol. 24, N 5. - P. 575-578.
12. Bratosin D., MaurlerJ., TisslerJ. P. et al. // Biochimie. - 1998. - Vol.80, N 2. - P. 173-195.
13. Crow С. K. //Toxicol. Lett. - 1984. - Vol. 23, N 1. — P. 109-114.
14. Ke X., Terashima M., Nariai Y. et al. // Biochim. Biophy. Acta. - 2001. - P. 101-113.
15. Kunimoto M., Tsubone H., Tsujii N. et al. // Toxicol. Ap-pli. Pharmacol. - 1984. - Vol. 74, N 1. - P. 10-16.
16. Mantovani B. // Exp. Cell. Res. - 1987. - Vol. 173, N 1. - P. 282-286.
17. Matthew B. G., Grisham D. J., Wink D. A. // Am. J. Physiol. - 1999. - Vol. 276. - P. G315-G321.
18. Roth A. C., Herkert G. F., Bercz J. P., Smith M. K. // Fundam. Appl. Toxicol. - 1987. - Vol. 9, N 4. -P. 668-677.
19. Rumbeiha W. K., Oehme F. W. //Vet. Hum. Toxicol. -1992. - Vol. 34, N 2. - P. 120-122.
Поступила 10.08.05
Summary. The effect of tocopherol in a dose of 150 mg/kg on the activity of erythrophagocyiosis was studied in vitro during long-term nitrite intoxication. With sodium nitrite intake, activation of the cellular mechanisms of erythrodieresis was observed in all periods of an experiment, which caused blood cell changes. Administration of tocopherol in the presence of nitrite intoxication was found to reduce the phagocytic activity of macrophages, which prevented the development of anemia.
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2006 УДК 614.77:615.9171-074
П. Е. Шкодич, С. А. Демидова, Е. Ю. Максимова, А. А. Масленников
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В ПОЧВЕ
НИИ гигиены, токсикологии и профпатологии Федерального медико-биологического агентства, Волгоград
В XXI век человечество вступило с множеством нерешенных экологических проблем. Среди них важнейшей является проблема уничтожения химического оружия.
Подписание Российской Федерацией в январе 1993г. Конвенции о запрещении разработки, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении определило обязательства Росси перед международным сообществом.
Для выполнения этих обязательств необходимо решить основные задачи — уничтожить запасы химического оружия в количестве 40 тыс. т отравляющих веществ (ОВ) до 2012 г. и обеспечить безопасность этого процесса для персонала объектов, населения и окружающей среды. Особенно актуальна данная проблема при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) нервно-паралитического действия (зарин, зоман и Ух), масса которых составляет 32,3 тыс. т.
Цель данного исследования — экспериментальное обоснование предельно допустимых концентраций (ПДК) зарина, зомана и Ух в почве.
Необходимо отметить, что вследствие своей чрезвычайно сложной организации почва является не только аккумулятором экзогенных загрязнений, но и может способствовать их миграции в воздух и подземные воды. Кроме того, растения, произрастающие на загрязненной почве, могут сорбировать и накапливать экзогенные химические вещества. Проникая в растения через корни, токсиканты тормозят или ускоряют их рост, воздействуют на плодоношение, накапливаются в отдельных частях. При употреблении в пищу такие растения могут быть источником токсического воздействия на животных и людей.
В работе использованы стандартные образцы зарина (о-изопропилметилфторфосфонат), зомана (о-[ 1,2,2-триметилпропил]метилфторфосфонат) и Ух (о-изобу-тил-р-N-диэтилами ноэтилметилтиофосфонат) с массовой долей основного вещества 99,7; 96,7 и 91,2% соответственно.
Физико-химические свойства изучаемых ФОВ представлены в табл. 1 [1].
Экспериментальное обоснование гигиенических нормативов оцениваемых веществ проводили в соответствии с действующими Методическими рекомендациями [7], а также подходами к нормированию химических веществ в почве, изложенными в монографии Е. И. Гончарука и Г. И. Сидоренко [2].
Во всех экспериментах, за исключением изучения воздействия ФОВ на общесанитарный режим почвы, использовали модельный почвенный эталон (МПЭ) — предварительно подготовленный карьерный среднемел-козернистый песок, отобранный с глубины не менее 3 м от поверхности почвы [2, 7].
Параметры воздействия изучаемых веществ на самоочищающую способность почвы и ее микробоценоз устанавливали на модельных образцах — смеси МПЭ и лесного чернозема, моделирующего состав почв из районов размещения объектов уничтожения химического оружия.
При формировании смеси содержание почвенного углерода, пригодного для питания микроорганизмов, не превышало 0,5%. Микробоценоз модельных образцов был максимально приближен к таковым в районах размещения объектов уничтожения химического оружия. Таким образом, при соотношении МПЭ и модельной