Цитогематомологические исследования красноперки (scarginius erythrophthalmus L. , 1758) при воздействии нитрита натрия и сырой нефти Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

БИОЛОГИЯ

УДК 591.8:591.41

ЦИТОГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРАСНОПЕРКИ (SCARDINIUS ERYTHROPHTHALMUS L., 1758) ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НИТРИТА НАТРИЯ И СЫРОЙ НЕФТИ

© 2009 г. Н.М. Абдуллаева, А.Р. Исуев, М.М. Габибов

Дагестанский государственный университет, Dagestan State University,

367001, Махачкала, ул. Гаджиева, 43а, 367001, Makhachkala, Gadjieva St., 43a,

bio@doc.dgu.ru bio@doc.dgu.ru

Исследуется влияние нефти и нитрита натрия на систему крови красноперок (Sсardinius erythrophthalmus). Показано понижение содержания гемоглобина, лейкоцитов и повышение числа микроядер в эритроцитах при действии обоих видов токсикантов.

Ключевые слова: цитогематологическое исследование, гемоглобин, лейкоциты, микроядера в эритроцитах.

The clause is devoted to research of influence by oil and nitrites on blood system of Sсardinius erythrophthalmus. The downturn of the maintenance of hemoglobin, leukocytes and increase the number of micronucleus in erythrocid cells at action of both kind pollutions is shown.

Keywords: сytogematological research, hemoglobin, leukocytes, micronucleus in erythrocid.

Нами исследовано воздействие нефти и нитрита натрия на гематологические изменения крови и частоту встречаемости генетически аберрантных клеток в периферической крови красноперки.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили двухгодовики красноперки Sсardinius erythrophthalmus массой 150 -220 г, отловленные в южной части Аграханского залива Каспийского моря. По токсикорезистентности красноперка относится к среднеустойчивым видам [1].

Постановка эксперимента. Рыбы были перевезены в специальных емкостях с кислородом из Аграханского залива Каспийского моря и помещены в аквариумы с речной водой, взятой из канала им. Октябрьской революции (г. Махачкала).

Опыты проводили в мае - июне 2006 г. в аквариумах объемом 200 л при постоянных аэрации и температуре. В течение 2 недель рыбы проходили адаптацию в условиях аквариума. Использовали нефть сырую - товарную Махачкалинскую. Ее состав: вода - 0,45 %, максимальные примеси - 0,025, парафины - 4,42 %; плотность при 20 °С -828,9 кг/м3, при 15 °С - 832,4 кг/м3; выход фракций до 200 °С - 34 %.

Красноперок распределили на 3 группы по 20 особей; у каждой группы - свой аквариум:

1. Вода без токсикантов (контроль).

2. В аквариумы добавляли раствор нитрита натрия из расчета 8 мг/ дм3; ПДК = 0,1 мг/дм3.

3. В аквариумы добавляли сырую нефть из расчета 0,5 мг/ дм3; ПДК = 0,05 мг/ дм3 для пресных водоемов [2].

В аквариумах создавались условия постоянного температурного (1 = 19 °С) и газового режимов. Гематологические анализы проводили на 5 и 10-й дни эксперимента по следующим показателям: цитогенетиче-ский анализ эритроцитов, определение числа лейкоцитов, гемоглобина, подсчет лейкоцитарной формулы. Кровь брали прокалыванием из хвостовой вены. Гемоглобин определяли в образцах крови гемоглобинциа-нидным методом; колориметрически [3, 4]. Количество лейкоцитов высчитывали в мазке крови относительно 1000 клеток эритроцитов. Лейкоцитарную формулу рассчитывали на 200 клеток лейкоцитов.

Метод учета микроядер. При проведении микроядерного теста были использованы мазки крови красноперок.

Для приготовления препаратов микроядер проводили кислотный гидролиз в 5 н соляной кислоте при температуре 37 °С в течение 12 мин. После гидролиза препараты отмывали в дистиллированной воде в течение 1-2 мин, окрашивали в реактиве Шиффа - 1 ч при комнатной температуре. Далее отмывали в двух сменах свежеприготовленной сернистой воды по 10 мин в каждой, а затем в проточной воде - в течение 5 мин. Обезвоживание проводили в серии спиртов восходящей концентрации (30, 50, 70, 96 и 100°) и после просветления в двух сменах ксилола по 5 мин в каждой. После этого препараты заключали в бальзам.

Окрашенные таким образом препараты подвергались цитогенетическому анализу. Мазки просматривались под микроскопом (увеличение 1000, микроскоп «Оптон»), от 100 до 1000 клеток в каждом препарате [5].

Вариационно-статистическая обработка материала. Статистическую обработку результатов прово-

дили по критерию t - Стьюдента с использованием программ «Ехсе1»и «Stadia» [6].

Результаты и их обсуждение

Итоги подсчетов частоты встречаемости клеток с микроядрами в эритроцитах крови контрольных и подвергшихся действию нитрита натрия и нефти двухго-

довиков красноперки приведены в табл. 1 и на рис. 1, 2. На 5-й день эксперимента число клеток со следами хромосомных поломок у всех изученных особей достоверно увеличивалось: при отравлении нитритом - в 4 раза, при интоксикации сырой нефтью - 3,5 раза (по сравнению с контролем). В контроле число клеток со следами хромосомных повреждений находилось в пределах спонтанного митогенеза.

Таблица 1

Цитогенетические изменения в эритроидных клетках крови красноперок в подостром эксперименте воздействия нитрита натрия и сырой нефти, % (М±т; п=10)

Дни экспозиции Количество клеток с микроядрами Количество двуядерных клеток

5-й 0,267±0,033 6,8±0,07

Нитрит натрия р<0,001 р<0,001

10-й 0,209±0,048 р<0,001 5,7±0,03 р<0,001

5-й 0,233±0,033 7,1±0,4

Нефть р<0,001 р<0,001

10-й 0,201±0,033 р<0,001 6,8±0,06 р<0,02

Контроль 0,067±0,003 2,0 ±0,03

%

Нитрит натрия

□ 5-й день

Нефь

О 10-й день

Рис. 1. Динамика частот встречаемости эритроидных клеток с микроядрами при воздействии нитрита натрия и сырой нефти, % (по отношению к контролю)

% 300 -,

Нитрит на*фки

□ 5-й день

Нефть

П 10-й день

Рис. 2. Динамика частот встречаемости двуядерных клеток при воздействии нитрита натрия и сырой нефти, % (по отношению к контролю)

На 10-й день опыта число микроядер в эритроцитах красноперки несколько снизилось по сравнению с 5-ми сут и составило при интоксикации нитритом натрия -0,209 ±0,048 %; сырой нефтью - 0,201±0,033 %.

Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности клеток крови красноперки к действию нефти и нитритов. Статистический анализ показал, что как на 5-й, так и на 10-й дни эксперимента число генетически аномальных эритроидных клеток значительно возрастало при воздействии нитрита натрия и нефти по сравнению с контролем.

На окрашенных по Фельгену препаратах крови наряду с микроядерными эритроцитами встречались и двуядерные клетки (табл. 1). Их количество по сравнению с микроядрами на порядок превышало уровень контроля (2,0±0,03 %). При интоксикации нитритом натрия на 5-е сут опыта число двуядерных клеток возрастало в 3,4 раза, при действии сырой нефти - в 3,5, на 10-й день - в 2,85 и 3,4 раза соответственно по сравнению с контролем.

Известно, что выход микроядер зависит от величины пролиферативного пула клеток, ответивших на митогенный стимул [7, 8].

Наши исследования показали, что нефть и нитриты можно рассматривать как митогенные стимуляторы. В использованных нами концентрациях эти вещества обладают почти одинаковой митогенной активностью. Колебания уровней спонтанного и индуцированного митогенеза могут отражать изменения степени загрязненности окружающей водной среды химическими токсикантами.

Проведенные исследования подтверждают результаты ряда работ по цитотоксической чувствительности клеток крови рыб к действию поллютантов [9].

Несмотря на то, что при выбранных условиях эксперимента нефть и нитрит натрия вызывали статистически значимое увеличение числа микроядер эритро-

350

300

250

200

50

0

250 -

200 -

50

0

идных клеток, в крови красноперки была выявлена кластогенная активность. Вероятно, это связано либо с условиями модельного эксперимента, либо с сильным цитотоксическим эффектом токсикантов, приводящих к массовой гибели клеток, в результате которой и происходит искусственное занижение клеток со следами хромосомных аномалий [10].

Вполне возможно, что в условиях модельного эксперимента происходят изменения экспрессии некоторых генов, которые передаются эпигенетическим путем. Так, незначительное количество генетически аберрантных клеток в крови рыб, подвергшихся интоксикации, могут отражать эффективность работы детоксикационных и репаративных систем, или же, наоборот, ингибирование активности весьма чувствительных ферментов, ответственных за превращение промутагенов в реакционно-способные метаболиты, поражают ДНК и хромосомы эукариотической клетки [5].

При исследовании показателей красной крови красноперки при воздействии нитритов и нефти наблюдалось снижение содержания гемоглобина в крови (табл. 2), при этом уже на 5-е сут количество гемоглобина снижалось относительно контроля на 31,8 и 30 % соответственно. На 10-й день воздействия нитритов происходило дальнейшее снижение гемоглобина относительно 5-го дня и контроля на - 36,1 и 55,2 %; нефти - на 33,3 и 52,6 % соответственно.

Это свидетельствует о том, что данные токсиканты обладают хроноконцентрационным действием. Незначительное понижение концентрации гемоглобина на 5-е сут воздействия токсикантов, вероятно, является следствием адаптивных возможностей организма вследствие активации его защитных свойств. Можно предположить, что снижение содержания гемоглобина в крови красноперок может быть следствием напряженного кислородного стресса, возникающего в условиях интоксикации нефтью и нитритами [11].

Значительные изменения отмечены нами и в содержании элементов белой крови рыб при их интоксикации нитритом натрия и сырой нефтью (табл. 2). Наиболее значимые изменения в содержании лейкоцитов отмечены на 10-й нитритной интоксикации. На этом этапе их количество снизилось на 43,3 %, тогда как на 5-й день -31,6 % относительно контроля. На 5-й день воздействия нефти уровень лейкоцитов снижался на 20,5 %, на 10-й -на 33,6 % по отношению к контролю.

Из полученных данных вытекает, что кровяные клетки рыб могут быть использованы как удобные тест-системы для выявления цито- и генотоксических веществ, а также в цитогенетическом мониторинге водной среды, так как колебания уровня спонтанного и индуцированного митогенеза могут отражать изменения степени загрязненности водной среды различными генотоксикантами.

Результаты гематологических показателей крови представлены в табл. 2 и на рис. 2. Наши наблюдения показали, что независимо от вида токсиканта признаки интоксикации проявлялись уже на 3 -е сут экспозиции, что проявлялось в дискоординации движений, подавлении двигательной активности и плавательной способности, урежении частоты сердечных сокращений, побледнении кожного покрова.

2

Лейкоциты красноперки представлены тремя типами клеток: лимфоцитами, нейтрофилами и моноцитами (табл. 2). Полученные данные показывают, что кровь красноперки, так же как и других представителей семейства карповых, имеет лимфоцитарный профиль. По литературным данным доля лимфоцитов карповых колеблется в пределах от 75-100 % [12]. Большую часть их составляют малые лимфоциты. На 5-е сут воздействия нефти и нитритов количество лимфоцитов существенно не отличалось от контроля, на 10-й день интоксикации нитритами их содержание снижалось относительно контроля на 21,5 %, нефтью - на 11,7 %. На начальных этапах интоксикации на (5-е сут) происходило повышение числа моноцитов в среде с нитритом натрия в 2,8 раза по сравнению с контролем. К концу эксперимента (10-е сут) их количество резко снизилось (в 11 раз) по сравнению с контролем. На 5-е сут действия сырой нефти уровень моноцитов увеличен в 3,6 раза, на 10-е - на 9,1 % по сравнению с контролем.

Нейтрофилы представлены клетками разной степени дифференцировки: юные, палочкоядерные и сегментоядерные [13]. Количество нейтрофилов у двухлеток красноперки менялось в зависимости от условий содержания. Так, на 5-й день воздействия нитрита натрия и сырой нефти наблюдалось увеличение содержания нейтрофилов в 2,5 раза по сравнению с контролем. На 10-е сут воздействия нефти происхо-

Таблица

Содержание гемоглобина, г/л, лейкоцитов, тыс./мл, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, %, в крови красноперки при воздействии нитрита натрия и нефти на (М±т; п=10)

Дни экспозиции Гемоглобин Лейкоциты Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты

5-й 26,0 ± 0,6 41,3 ± 2,3 4,0 ± 0,1 92,0 ± 1,3 3,1 ± 0,2

Нитрит натрия р< 0,01 р< 0,05 р< 0,001 Р > 0,6 р< 0,001

10-й 16,0 ± 0,1 34,2 ± 1,1 1,0 ± 0,1 70,4 ± 2,1 0,1 ± 0,04

р< 0,02 р< 0,01 р< 0,05 Р > 0,2 р< 0,001

5-й 27,0 ± 0,02 48,0 ± 2,5 4,0 ± 0,1 91,3 ± 1,7 4,0 ± 0,01

Нефть р < 0,01 р< 0,001 р< 0,001 Р > 0,7 р > 0,01

10-й 18,0 ± 0,7 40,1 ± 1,7 2,0 ± 0,1 79,2 ± 1,8 1,2 ± 0,02

р< 0,001 р< 0,02 р< 0,001 Р > 0,4 Р > 0,5

Контроль 38,0 ± 0,8 60,4 ± 3,7 1,6 ± 0,4 89,7 ± 2,8 1,1 ± 0,2

дило увеличение количества нейтрофилов на 25 % и снижение на 37,5 % при воздействии нитрита натрия.

Можно предположить, что увеличение параметров периферической крови (гемоглобин, лейкоцитарная формула) красноперок при интоксикации нефтью и нитритом натрия связаны с защитными свойствами крови, которые обеспечивают жидкостный (выработку антител) и клеточный иммунитет (фагоцитоз). Изменения показателей крови наиболее тонко отражают реакцию кроветворных органов на воздействие различных факторов среды на организм рыб.

Литература

1. ЛукьяненкоВ.И. Общая токсикология. М., 1983. 289 с.

2. Курбанова И.К., Исуев А.Р., Габибов М.М. Влияние неф-

тяного загрязнения водной среды на некоторые показатели белкового обмена кутума и бычка-кругляка // Вопросы ихтиологии. 2004. Т. 44, № 5. С. 700 - 708.

3. Аленичев С.В., Рыжков Л.П. Цитоморфологический

состав крови и динамика гематологических показателей окуня Онежского озера в условиях техногенного загрязнения // Вопросы ихтиологии. 2000. Т. 40, № 1. С. 91-96.

4. Коржуев П.А. Гемоглобин. М., 1964. С. 205-232.

5. Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга. М.,

1985. 158 с.

6. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 352 с.

7. Кокуричева М.П. О токсичности минеральных удобре-

ний для рыб // Актуальные вопросы патологоанатоми-ческой диагностики болезней животных: материалы 8 Всес. конф. по патол. анатомии животных. Витебск, 15-17 сент. Л., 1982. С. 124-127.

8. Луговская С.А. Лабораторная гематология. М., 2001. С.

2-3.

9. Чувствительность хромосом кроветворных клеток личи-

нок Хепо 1аеу18 к действию химического мутагена фот-рина / С.Т. Захидов [и др.] // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 1. С. 107-111.

10. Кудрявцев А.А. Гематология животных и рыб. М., 1969.

320 с.

11. Захидов С.Т., Карпюк М.И., Галиченков В.А. Цитогнене-

тический мониторинг волжского бассейна. Уровни хромосомных мутаций в половых и соматических клетках самцов стерляди // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 1. С. 102-106.

12. Житенева Л.Д. Экологические закономерности ихтио-

гематологии. Ростов н/Д, 1999. 54 с.

13. ИвановаН.Т. Атлас клеток крови рыб. М., 1983. 84 с.

Поступила в редакцию_16 января 2008 г.