Состояние мембран эритроцитов периферической крови рыб при воздействии тяжелых металлов и сырой нефти Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

БИОЛОГИЯ

УДК 597 5543; 574 24; 591.133.11

СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ РЫБ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И СЫРОЙ НЕФТИ

© 2011 г. Н.М. Абдуллаева, М.М. Габибов

Дагестанский государственный университет, Dagestan State University,

ул. Гаджиева, 43а, Махачкала, 367025, Gadjiev St., 43a, Makhachkala, 367025,

[email protected] [email protected]

Изучено влияние ацетата свинца (5 ПДК), хлорида кадмия (20 ПДК) и сырой нефти (10 ПДК) на состояние эритроцитарных мембран сеголеток карпа в аквариальных условиях. Показано, что воздействие тяжелых металлов и сырой нефти вызывает деструктивные процессы в мембранах эритроцитов, приводящие к их преждевременному старению.

Ключевые слова: эритроцит, мембрана, проницаемость, тяжелые металлы, рыба, нефть, загрязнение.

The article is dedicated to the study of the heavy metals — lead acetate (5 maximum allowable concentration), cadmium chloride (20 maximum allowable concentration) and crude oil (10 maximum allowable concentration) on the state of red cell membranes of peripherial blood of Cyprinus carpio L. It is shown, that heavy metals and crude oil induce destructive processes in red cell membranes which lead to their premature aging.

Keywords: red cell, membrane, permeability, heavy metals, fish, oil, pollution.

Сведения об изменении состава крови рыб при воздействии солей тяжелых металлов в настоящее время слабо освещены. Знание о влиянии тяжелых металлов и сырой нефти на состояние мембран эритроцитов позволит понять причины дестабилизации гомеостатических механизмов, ведущих в конечном итоге к снижению адаптационных способностей карповых к токсическим факторам.

Цель работы - исследование кислотной устойчивости эритроцитов периферической крови рыб при хроническом воздействии тяжелых металлов и сырой нефти.

Материал и методика

Основной объект исследования - сеголетки (5^6 мес., массой 100^150 г) обоего пола карпа (Cyprinus carpio L.), отловленные из прудов Ши-рокольского рыбокомбината Республики Дагестан в осеннее время (ноябрь 2004-^2008 гг.) перед их переброской в зимовальные пруды.

Широкольский рыбоводный комбинат представляет собой крупное хозяйство по разведению и выращиванию молоди, кормлению и отлову многих видов промысловых рыб. Пруды этого комбината занимают территорию около 2,5 тыс. га и имеют глубину до 2 м. Вода в пруды поступает из р. Терек.

Карп является широко распространенным объектом прудовой культуры России. Пресноводная рыба встречается в солоноватых водах Каспия, где образует полупроходные формы. В водоемах Дагестана сазан представлен как полупроходной, так и жилой (камышовой и прудовой) формами.

Другим объектом исследования явились двухлетки красноперки массой 15,5 г, отловленные в южной части Аграханского залива. Красноперка - туводная рыба, но в пределах водоемов совершает сезонные миграции. Относится к отряду карпообразных, семейству карповых, роду красноперки, виду красноперка (Scardinius erythrophthalmus L.). Самки красноперок крупнее самцов.

Выбор объекта исследования связан с его доступностью и с тем, что карповые хорошо переносят смену среды обитания, отличаются выносливостью к холоду и другим неблагоприятным условиям окружающей среды. С другой стороны, влияние токсикантов на молодь может иметь более глубокие последствия, чем на старых рыб [1].

Карповые были перевезены в специальных мешочках с кислородом из Аграханского залива и с. Юрковка Тарумовского района Республики Дагестан в г. Махачкалу.

Постановка эксперимента

Эксперименты проводились в аквариумах объемом 250 л. В каждом содержались по 15^20 рыб. Были созданы условия постоянного температурного и газового режима. Постоянную аэрацию аквариумов поддерживали с помощью специальных аэраторов. В течение одного месяца рыбы проходили адаптацию в условиях аквариума, часть рыб погибала. В эксперименте использовались выжившие рыбы. Нами испытано влияние ацетата свинца в концентрации 0,5 мг/л (ПДК для рыбохозяйственных водоемов - 0,1 мг/л) [2]; хлорида кадмия в концентрации 1,0 мг/л (ПДК для рыбохозяйственных водоемов - 0,05 мг/л); сырой

нефти в концентрации 0,5 мг/л (10 ПДК) [3]. Использовали нефть сырую - товарную Махачкалинскую. Контрольную группу рыб содержали в воде без добавления токсиканта. На 5, 15, 30, 40-й дни эксперимента проводили анализ кислотной резистентности эритроцитов периферической крови, которую брали прокалыванием из хвостовой вены.

Метод кислотных эритрограмм основан на фотоэлектрической регистрации кинетики гемолиза. Скорость этого процесса весьма чувствительна к условиям протекания реакции, поэтому для получения достоверных, воспроизводимых данных требуется высокая степень стабилизации температуры, концентрации эритроцитов и гемолитика [4].

Статистическую обработку результатов проводили по критерию Стьюдента с использованием интегрированного пакета статистической обработки информации STATG RAPH ICS [5].

Результаты и обсуждение

Метод кислотных эритрограмм позволяет группировать морфологически однородные эритроциты по их возрастному составу. Вместе с тем распределение эритроцитов по стойкости зависит от химического состояния их мембран.

Известно, что стойкость эритроцита в сосудистом русле уменьшается с возрастом. Наиболее молодые обладают наибольшей стойкостью и занимают на эритрограмме правое положение. Циркулируя в русле крови, они созревают и в дальнейшем стареют. Эти

процессы сопровождаются постоянным снижением их стойкости, что на эритрограмме отражается смещением влево. К концу жизни эритроцита его стойкость снижается до минимального значения. Он покидает сосудистое русло [6]. Таким образом, стойкость эрит-роцитарных мембран является важнейшей величиной, связанной с физиологическим состоянием и возрастом эритроцитов.

На рис. 1-3 эритрограмма контрольных сеголеток карпа и двухлеток красноперки одновершинна, и ее максимум (пик) приходится на 0,6 мин. В этой точке гемолизу подвергается около 27,15 % эритроцитов. Продолжительность эритрограммы контрольных рыб составила 1,8 мин. Размах основания пика - 0,4 мин. За это время гемолизу подвергается 63,56 % эритроцитов. Одновершинность эритрограммы указывает на относительную однородность популяции, соответствующей нормобластическому типу кроветворения, растяжение правого крыла эритрограммы - на приток в кровяное русло эритроцитов с высокой кислотной резистентностью. Длительность гемолиза после наступления пика занимает 1,2 мин. Начальные участки эритрограмм контрольных рыб сопровождаются незначительными изменениями оптической плотности, которые характеризуют предгемолизные изменения эритроцитов в связи с их переходом в сферическую форму. Этот участок не связан с распадом эритроцитов. В опытных вариантах такого не наблюдалось, так как процесс распада эритроцитов начинается с 1-й мин.

Рис. 1. Устойчивость эритроцитов сеголетков карпа к кислотному гемолизу при хроническом действии ацетата свинца

Воздействие токсикантов существенно отражается на эритрограмме рыб. При этом менее значимые изменения наблюдаются при хроническом воздействии ацетата свинца (0,5 мг/л). На 5-й день эритрограмма сеголеток карпа сходна с таковой контрольных рыб

как по продолжительности гемолиза (2,0 мин), положению его пика (0,6 мин), так и по размаху (1,4 мин). Однако в отличие от контроля увеличивается число эритроцитов, подвергшихся гемолизу к 0,6 мин до 38,13 %.

Рис. 2. Устойчивость эритроцитов сеголетков карпа к кислотному гемолизу при хроническом действии хлорида кадмия

1 I з М 1.0 i

Время, мин

IJ IА 1Л I £ !

Время, мин

| -Р-ССНГрйПЬ - I Т н JiHi ]

1S М Ii I.S I

Время, мин

Рис. 3. Устойчивость эритроцитов двухлеток красноперки к действию нефти в условиях хронического опыта

По мере пролонгирования действия ацетата свинца изменения в качественном составе эритроцитов становятся более выраженными. На 15-й день экспозиции рыб в среде с ацетатом свинца наблюдается смещение пика гемолиза. За это время (0,6 мин) разрушению подвергается 33,16 % эритроцитов. Продолжительность эритрограммы занимает 2 мин, ее размах составляет 1,4 мин. При этом происходит понижение стойкости и увеличение количества разрушенных эритроцитов до 80,35 %. На 30 и 40-й дни также не отмечаются существенные сдвиги в эритро-грамме рыб. На 0,6-й мин гемолизу подвергается 30,14 % эритроцитов. Растянутость правого крыла эритрограммы, по-видимому, является следствием притока в сосудистое русло эритроцитов с высокой резистентностью и указывает на компенсаторный характер реакции кроветворной системы.

Воздействие хлорида кадмия (1 мг/л) приводит к значительному перераспределению популяций эритроцитов. Степень обнаруженных изменений зависит от времени экспозиции рыб в среде токсиканта. На 5-й день опыта основная часть эритроцитов (64,71 %) разрушается в первые 0,6 мин. Наблюдается сдвиг эритрограммы влево со смещением максимума к 0,4 мин. Продолжительность гемолиза - 2 мин, размах основного пика - 1,8 мин. На 15-й день эксперимента на пике гемолиза разрушается 23,72 % эритроцитов. Наблюдается смещение эритрограммы в правую сторону и ее размах длится 1,6 мин. На 30-й день -аналогичная растянутость эритрограммы в правую сторону. Пик гемолиза наступает на 0,4-й мин разрушение эритроцитов - 30,31 %. Длительность эритро-граммы - 1,8 мин, гемолизу подвергаются 96,89 % эритроцитов.

На 40-й день экспозиции сеголеток карпа имеет место ранний гемолиз эритроцитов, и на 1,4-й мин почти все эритроциты (99,18 %) подвергаются разрушению.

Размах основания эритрограммы составляет 1,2 мин. Имеется сдвиг влево одновершинной эритрограммы со

смещением пика до 0,4 мин, гемолизу подвергается около 20 % эритроцитов (табл. 1, рис. 2).

Таблица 1

Кислотная резистентность эритроцитов периферической крови сеголетков карпа при хроническом воздействии ионов тяжелых металлов (М±т; п=10)

Вариант опыта Время, мин

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

Контроль 0,90±0,01 1,13±0,05 27,15±3,21 23,03±5,22 14,44±5,66 13,73±2,02 11,14±2,43 7,02±1,26 7,02±1,26

Ацетат свинца, 0,5 мг/л 5 дней 1,3±0,02 0,29±0,01 38,13±0,29 26,01±0,24 15,18±0,01 9,22±0,17 7,40±0,12 2,60±0,09 1,04±0,05

15 дней 1,1±0,04 1,21±0,04 33,16±0,03 24,64±0,15 19,32±0,14 11,08±0,07 8,04±0,07 3,44±0,03 2,82±0,003

30 дней 1,50±0,03 1,67±0,03 30,41±0,42 23,15±0,58 20,18±0,01 9,51±0,47 7,21±0,15 5,73±0,06 2,01±0,15

40 дней 0,90±0,01 0,85±0,01 27,37±0,75 23,80±0,42 17,21±0,18 13,25±0,19 11,76±0,08 6,17±0,01 1,97±0,003

Хлорид кадмия, 1 мг/л 5 дней 0,42±0,03 41,9±0,06 22,37±0,02 14,01±0,09 10,66±0,033 6,81±0,08 3,08±0,07* 0,70±0,01* 0,05±0,001

15 дней 0,61±0,03 23,72±0,02 23,04±0,58 19,29±0,30 14,62±0,19 11,04±0,58 3,67±0,12* 0,30±0,02* 0,03±0,001

30 дней 0,31±0,01 30,31± 0,35 27,65±0,15 17,03±0,09 12,07±0,09 6,75±0,06 2,19±0,12 0,60±0,04* 0,31±0,001

40 дней 0,2±0,02 29,01± 0,12 28,02±0,15 16,91±0,09 12,01±0,10 11,88±0,09 1,15±0,03 0,34±0,13 0,17±0,001

* - различия недостоверны по отношению к контролю.

Изучение кислотных эритрограмм при воздействии сырой нефти нами проведено на двухлетках красноперки (табл. 2; рис. 3). Продолжительность эритрограммы - 1,8 мин. Эритрограмма одновершинна, что

указывает на однородность эритроцитарной популяции. Пик гемолиза приходится на 0,6 мин. Размах основания пика - 0,4 мин, гемолизу подвергается 63,56 % эритроцитов.

Таблица 2

Кислотная резистентность эритроцитов периферической крови двухлеток красноперки при хроническом воздействии сырой нефти (М±т; п=10)

Вариант опыта Время, мин

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

Контроль 3,12±0,01 16,33±0,05 29,01±5,50 20,31±5,1 13,94±3,6 12,96±1,5 11,88±2,00 8,16±1,22 2,12±1,8

Нефть, 5 мг/л 5 дней 0,80±0,03 39,64±6,46 23,84±5,02 18,01±0,39 110,37±0,03 5,11±0,08 4,38±0,07 2,08±0,01 0

15 дней 1,05±0,03 33,42±6,02 24,04±4,58 17,19±0,29 14,72±0,19* 8,24±0,18 3,21±0,02 1,94±0,02 0

30 дней 1,47±0,05 30,01±5,02 25,47±5,27 18,13±0,36 16,07±0,23 9,04±0,18 3,08±0,06 1,624±0,12 0

Кислотные эритрограммы рыб на различных этапах воздействия сырой нефти отражают существенные изменения в популяции эритроцитов. На 5-е сут воздействия сырой нефти выявлены изменения в сторону смещения эритрограммы в левую сторону. Наблюдается левый сдвиг одновершинной эритрограммы со смещением максимума к 0,4 мин, гемолизу подвергается около 40 % эритроцитов. Размах основания эритрограммы - 1,4 мин, гемолизу подвергается 99 % эритроцитов.

На 15-й день выявлены дальнейшие изменения в сторону смещения эритрограммы в левую сторону. Эритрограмма одновершинна со смещением максимума к 0,4 мин, гемолизу подвергается около 40 % эритроцитов. Размах основания пика - 1,2 мин, гемо-

лизу подвергалось 98 % эритроцитов. Время полного гемолиза сокращено. Уже на 1,4-й мин наступает полное разрушение всех эритроцитов. На 30-й день интоксикации сырой нефтью эритрограмма смещена влево; разрушение эритроцитов происходит с первых секунд - нет стадии, предшествующей гемолизу. Пик гемолиза приходится на 0,4-й мин. Происходит разрушение 30,01 % эритроцитов. Продолжительность эритрограммы - 1,6 мин. При этом гемолизу подвергается 98 % эритроцитов. Размах пика основания - 0,6 мин, гемолизу подвергается 89 % эритроцитов. Время полного гемолиза наступает к 1,4-й мин.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о неодинаковой чувствительности эритроцитов

к кислотному гемолизу под влиянием ионов РЬ2+, Са2+ и сырой нефти. Выявлена относительно более высокая устойчивость эритроцитов сеголеток карпа кислотному гемолизу при длительном воздействии ацетата свинца, что, по-видимому, можно связать с тем, что ионы РЪ2+ менее токсичны, нежели ионы Са2+ и сырая нефть. Под влиянием ионов са2 и сырой нефти наблюдались более значительные изменения качественного состава эрит-роцитарной популяции.

Сокращение продолжительности гемолиза, исчезновение популяций высоко- и сверхвысокочувствительных эритроцитов из кровяного русла, увеличение доли средне-, высокостойких эритроцитов при воздействии ионов РЪ2+, Са2+ и сырой нефти свидетельствуют о «старении» популяции эритроцитов, которое может явиться следствием деструктивных процессов, возникающих в эритроцитарной мембране под влиянием изученных токсикантов. Надо отметить, что использованные концентрации солей свинца, кадмия и сырой нефти остролетального эффекта не вызывали.

Одной из причин старения эритроцитов может быть окислительная модификация белков и липидов мембран эритроцитов под влиянием токсикантов [7]. Другой причиной служит поступление в кровяное русло из депо старых форм эритроцитов с низкой устойчивостью к кислотному гемолизу [6]. Уменьшение

Поступила в редакцию_

кислотной резистентности эритроцитов рыб под влиянием тяжелых металлов и сырой нефти является следствием снижения стабильности мембран эритроцитов с последующим внутрисосудистым гемолизом.

Литература

1. Руднева И.И. Эколого-физиологические особенности

антиоксидантной системы рыб и процессов перекисно-го окисления липидов // Успехи соврем. биологии. 2003. Т. 123, № 34. С. 391-400.

2. Патин С.А. Нефть и экология континентального шель-

фа. М., 2001. 247 с.

3. Перечень рыбохозяйственных нормативов: предельно

допустимых концентраций (ПДК) и ориентированно-безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды, водных объектов, имеющих рыбохо-зяйственное значение. М., 1999. 304 с.

4. Терсков И.А., Гительзон И.И. Метод кислотных эритро-

грамм // Биофизика. 1957. Т. 2, вып. 2. С. 259-266.

5. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 352 с.

6. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в он-

тогенезе человека. Новосибирск, 1987. 242 с.

7. Козлова Н.М., Слобожанина Е.И., Черницкий Е.А. Окис-

ление мембранных белков и изменение поверхностных свойств эритроцитов // Биофизика. 1998. Т. 13, вып. 3. С. 480-483.

15 ноября 2010 г.