CC BY
54
УДК 577.114:581.192:543.422.25
СОСТАВ ВОДОРАСТВОРИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ОДУВАНЧИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО ТАРАХАСиМ ОРПСШАЬЕ
Н.П. Тигунцева, Л.В. Каницкая, С.Н. Евстафьев
ФГБОУ ВПО Иркутский государственный технический университет, Российская Федерация, 664074, Иркутск, ул. Лермонтова, 83 . [email protected]
Приведены результаты исследования выхода и состава водорастворимых продуктов, выделенных из надземной части одуванчика лекарственного путем последовательной обработки водой и ок-салатом аммония в кислой среде, методами ГХ-МС, ИК- и ЯМР 13С-спектроскопии. Табл. 5. Библиогр. 9 назв.
Ключевые слова: одуванчик лекарственный, водорастворимые соединения, моносахариды, пектиновые полисахариды, химический состав.
ВВЕДЕНИЕ
Экстрактивные вещества растений находят широкое применение в пищевой и химической промышленности, медицине и сельском хозяйстве. В последние десятилетия большое внимание уделяется выяснению химического состава и структуры пектиновых веществ, что связано с их специфическими техническими свойствами и высокой физиологической активностью. В частности пектины обладают имму-номодулирующим, противовоспалительным действием, способны выводить из организма тяжелые металлы, биогенные токсины, анаболики, ксенобиотики, продукты метаболизма и биологически вредные вещества, способные накапливаться в организме: холестерин, липи-ды, желчные кислоты, мочевину. Показано, что биологические функции этих природных биополимеров и степень их биологической активности зависит от вида растения и периода его вегетации. В связи с этим многие исследователи обратились к изучению пектиновых веществ из широко распространенных дикорастущих растений непищевого назначения [1].
Цель настоящей работы заключалась в определении химического состава низкомолекулярных водорастворимых соединений и пектиновых полисахаридов из надземной части одуванчика лекарственного Taraxacum о1Т1с1па!е -широко распространенного растения, являющегося богатым источником множества функ-
циональных ингредиентов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали воздушно-сухие, измельченные до крупност и 1-5 мм, образцы надземной части одуванчика лекарственного, собранного в июне 2011 г. до цветения в Иркутском районе.
Для выделения водорастворимых веществ использована 2-х стадийная обработка. На первой стадии образец одуванчика трехкратно экстрагировали свежими порциями дистиллированной воды при 70 оС. Гидромодуль 1 : 10, продолжительность каждой обработки 2 часа. Водные извлечения объединяли, концентрировали под вакуумом до 1/20 от первоначального объема. Из полученного концентрата обработкой этанолом при комнатной температуре [2] осаждали пектиновые полисахариды (ПС-1). Осадок отфильтровывали, промывали этанолом и диэтиловым эфиром, высушивали при 60 оС. Из фильтрата после отгонки этанола и выпаривания на водяной бане получали низкомолекулярные водорастворимые соединения (НВР-1).
На второй стадии остаток после экстракции водой трижды обрабатывали подкисленной (рН = 4) смесью 0,5%-ного водного раствора окса-лата аммония и 0,25%-ного водного раствора щавелевой кислоты в соотношении 1 : 1 при 70 оС в течение 3 ч при постоянном перемешивании [3].
Экстракты после фильтрования объединяли и концентрировали до 1/20 от первоначального объема. Из концентрата выше описанным методом выделяли пектиновые полисахариды (ПС-2) и низкомолекулярные водорастворимые соединения (НВР-2).
Кислотный гидролиз пектиновых полисахаридов и низкомолекулярных водорастворимых соединений осуществляли 2 М раствором трифторуксусной кислоты [3].
Качественный и количественный состав моносахаридов определяли на хроматографе 7820 А с селективным масс-спектрометрическим детектором НР 5975 фирмы «Agilent Technologies». Энергия ионизации - 70 эВ. Температура сепаратора - 280 оС, ионного источника - 230 оС. Кварцевая колонка 30000*0,25 мм со стационарной фазой (95% диметил - 5% дифенилпо-лисилоксан). Условия анализа: 3 мин изотермы при 125 оС с последующим подъемом температуры до 250 оС со скоростью 6 градусов в минуту с выдержкой в течение 10 мин при 250 оС. В качестве внутреннего стандарта использовали ксилит. Анализировали образцы после силили-рования смесью триметилхлорсилана и гекса-метилдисилазана в среде пиридина [4].
Идентификацию компонентов осуществляли с использованием библиотеки масс-спектров «NIST05».
ИК-спектры регистрировали в таблетках KBr с концентрацией вещества 1% в диапазоне волновых чисел 4000-400 см-1 на спектрофотометре <^ресо1^-75 IR».
Количественный спектр ЯМР 13С регистрировали на спектрометре ЯМР VXR-500S фирмы «Varian» с рабочей частотой 125,7 МГц с шумовой развязкой от протонов и шириной спектров 20-30 кГц после 5000 прохождений. Шумовая развязка выключалась во время релаксационной задержки, которая составляет 10 с, ширина импульса 90 о, параметр ушире-ния линий при экспоненциальном умножении равнялся 10 Гц. Для регистрации спектра использовали раствор пектиновых веществ в
D2O. Концентрация составляла 20% масс. Спектры регистрировали при температуре 25 оС. Расчеты содержания углеводов, функциональных групп и элементного состава по спектру ЯМР осуществляли, используя фраг-ментный анализ [5], максимальная погрешность составляет 7,5%.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В результате 2-х стадийной обработки в растворимое состояние было переведено 63,5% а.с.м. надземной части одуванчика (табл. 1). Наибольший выход водорастворимых веществ получен на первой стадии (41,5%). При этом около 90% выделенных веществ представлено во фракции НВР-1.
Выход водорастворимых веществ после гидролиза оксалатом аммония составил 22% на а.с.м. надземной части. При этом доля низкомолекулярных продуктов (НВР-2) не превышает 60%.
Моносахариды фракции НВР-1 с содержанием 16,5% на фракцию представлены ксилозой, галактозой, фруктозой и глюкозой, на долю которой приходится 84% от общего содержания моносахаридов (табл. 2). После кислотного гидролиза содержание моносахаридов во фракции возрастает до 39,4%, прежде всего, за счет выделения глюкозы. В полученном гидролиза-те обнаружены также арабиноза и в незначительных количествах - манноза.
Моносахариды фракции НВР-2 менее представительны - 5,8% на фракцию, при этом около 70% приходится на ксилозу. После гидролиза их содержание возрастает до 13,9%, как и для фракции НВР-1, за счет образования, прежде всего, глюкозы и арабинозы.
Наряду с моносахаридами в составе фракций методом ГХ-МС идентифицированы одно-и двухосновные кислоты, в том числе, амино- и гидроксикислоты (табл. 3).
Наряду с нейтральными моносахаридами в заметных количествах во фракциях НВР-1 и НВР-2 присутствуют гидроксикислоты с со-
Таблица 1
Выход водорастворимых продуктов из надземной части одуванчика, в % на а.с.м._
Продукты 1-я стадия 2-я стадия
Низкомолекулярные водорастворимые продукты 37,4 12,9
Пектиновые полисахариды 4,1 9,1
Таблица 2
Состав моносахаридов низкомолекулярных водорастворимых продуктов, %*_
Продукты Моносахариды
Ara Xyl Glc Gal Man Fru
НВР-1:
исходные гидролизат 4,7 0,3 1,6 13,9 29,8 0,4 1,5 0,2 1,9 1,6
НВР-2:
исходные 0,2 4,0 1,3 - - 0,3
гидролизат 4,6 0,7 4,7 1,9 следы 0,2
Примечание: * на а.с.м. исходных низкомолекулярных водорастворимых соединений.
Таблица 3
Состав фракций низкомолекулярных водорастворимых продуктов, % отн._
Соединения НВР-1 НВР-2
исходная гидролизат исходная гидролизат
Аминокислоты: 10,6 4,8 4,2 4,9
L-валин 0,7 0,4 0,5 0,7
L-пролин 5,1 4,2 0,6 2,0
серин 0,2 0,2 0,3 0,3
5-оксо- L-пролин 4,6 - 2,8 -
аспарагиновая - - - 1,9
Гидроксикислоты: 37,7 38,5 38,3 19,9
3-оксимасляная - - 3,3 -
глицериновая 11,6 11,1 3,9 3,2
яблочная 18,8 17,6 10,4 5,5
винная 6,3 9,6 20,7 11,2
2,3,4-триоксимасляная 1,0 0,2 - -
Кислоты: 6,2 1,6 4,5 1,2
щавелевая - 0,1 0,7 -
молоновая 0,2 0,1 0,3 0,1
малеиновая - - 0,4 0,4
янтарная 0,9 0,6 1,3 0,5
л-оксифенилуксусная 0,8 0,44 0,5 0,3
3,4-диоксифенилпропеновая 4,4 0,1 1,3 -
держанием от 19,9 до 38,5% на фракцию. В их составе выделяются содержанием яблочная и винная кислоты. На долю аминокислот приходится от 4,2 до 10,6% отн.
Суммарный выход пектиновых полисахаридов составил 13,2% на а.с.м. надземной части одуванчика. По внешнему виду пектиновые полисахариды водной экстракции представляют собой аморфный порошок серо-коричневого цвета, а пектиновые полисахариды второй ступени - порошок кремового цвета. Фракцию пС-1 отличает высокая зольность, а фракцию ПС-2 - большие степени насыщенности и окисленности структурных фрагментов (табл. 4).
Данные исследования моносахаридного состава гидролизатов фракций ПС-1 и ПС-2 свидетельствуют об их деструкции при кислотной
обработке. При этом полисахариды фракции ПС-2 подвергаются расщеплению в большей степени, чем фракции ПС-1, что, вероятно, вызвано различиями в их строении (табл. 4).
Установлено, что в качественном составе нейтральных моносахаридов гидролизатов различий нет. Все обнаруженные моносахариды являются распространенными компонентами многих растительных полисахаридов. Присутствие заметных количеств глюкозы в гидро-лизатах фракций ПС-1 и ПС-2 вызвано, скорее всего, присутствием в полисахаридах глюкана, нежели сопутствующего крахмала, так как проба с йодом дала отрицательный результат.
В полисахаридах фракции ПС-2 основными нейтральными моносахаридами являются остатки арабинозы и рамнозы. Относительно высокое содержание рамнозы может указывать
Таблица4
Характеристика пектиновых полисахаридов фракций ПС-1 и ПС-2
Наименование Пектиновые полисахариды
ПС-1 ПС-2
Влажность, в % на а.с.м.: 7,6 9,5
Зольность, в % на а.с.м.: 38,3 7,2
Элементный состав, в % на органическую массу: Углерод Водород Азот 40,7 5,7 2,7 35,6 6,5 2,9
Кислород (по разности) (Н/С)ат (О/С)ат 50,9 1,68 0,94 55,0 2,19 1,16
Моносахаридный состав гидролизатов,
в % на а.с.м. полисахаридов: 19,6 39,1
Арабиноза 2,9 17,8
Ксилоза 2,8 4,0
Манноза 0,1 0,1
Глюкоза 6,3 4,4
Галактоза 2,7 3,1
Рамноза 4,8 9,7
на большую разветвленность полисахаридов этой фракции. По мнению ряда исследователей [6], присутствие рамнозы в гидролизатах свидетельствует также о наличии в исследуемых полисахаридах легкогидролизуемых в кислой среде связей между остатками галактуро-новой кислоты и рамнозы.
Галактуроновая кислота обнаружена в гидролизатах исследуемых фракций в количестве 10-15% на а.с.м. Ее присутствие указывает на кислый характер исследуемых полисахаридов и на принадлежность их к классу пектиновых веществ. Относительно низкое содержание галактуроновой кислоты в гидролизатах по данным анализа методом ГХ-МС может быть обусловлено, вероятно, тем, что в использованных условиях кислотного гидролиза устойчивые гликозидные связи между остатками галактуроновой кислоты гидролизуются частично. По данным ЯМР 13С содержание галактуроновой кислоты в исследуемых полисахаридах значительно выше.
О наличии остатков галактуроновой кислоты в полисахаридах фракций ПС-1 и ПС-2 свидетельствуют также результаты исследования методом ИК-спектроскопии. Полученные ИК-спектры фракций содержат характерные для пектиновых веществ полосы поглощения: широкая полоса поглощения с максимумом при 3360 см-1, полосы поглощения при 1300, 1090 и 830 см-1 обусловлены валентными и деформационными колебаниями гидроксильных групп пиранозных колец; поглощение при 1570 см-1 вызвано валентными колебаниями в группах RCOO-. Полоса поглощения при 1180 см-1 свидетельствует о наличии простых эфирных связей в пиранозных кольцах.
Спектры ЯМР 13С фракции ПС-2 содержат шесть уширенных сигналов (С1 102,2; C2 69,5; C3 70,0; C4 79,1; C5 73,1; C6 175,6 м.д.) (табл. 5), которые аналогичны соответствующим сигналам в спектрах а-1,4-Э-галактопиранозилуронана [7], пектиновых полисахаридов абрикоса и плодов томата [8].
Результаты анализа спектров ЯМР 13С фракции указывают на наличие в полисахаридах не только а-1,4-связанных остатков D-галактопира-нозилуроновой кислоты, но и на заметное содержание а^-арабинофуранозы и а^-рамнопи-ранозы, что согласуется с данными, полученными при анализе гидролизатов методом ГХ-МС.
13
Среди других сигналов в спектре ЯМР С следует отметить сигнал сложноэфирных ме-тильных групп: СООМе при 55,9 м.д. и сигнал С6-атома метоксилированной галактуроновой кислоты при 173,1 м.д. Они подтверждают наличие частично метоксилированных карбоксильных групп остатков галактуроновой кислоты. В спектре имеются также сигналы очень низкой интенсивности соответствующие резонансу карбонильных групп и атомов углерода ароматических фрагментов.
По данным количественной спектроскопии ЯМР 13С основным компонентом макромолекулы полисахарида фракции ПС-2 является D-галактуроновая кислота, содержание которой составляет 67,7% масс. Небольшая ее часть присутствует в виде метиловых эфиров. Степень метилирования низкая - 0,23 и сходна с таковой для пектина томатов. В структуре макромолекулы пектинового полисахарида ПС-2 содержится 3,5% масс. ацетильных групп.
ВЫВОДЫ
1. Последовательной обработкой надземной части одуванчика водой и оксалатом аммония в кислой среде выделено 63,5% водорастворимых соединений.
2. Методом ГХ-МС установлено, что в состав низкомолекулярных водорастворимых соединений входят моносахариды, аминокислоты, гидроксикислоты, двухосновные жирные кислоты и полисахариды, при кислотном гидролизе которых выделяется значительное количество глюкозы и арабинозы.
3. Суммарный выход пектиновых полисахаридов надземной части одуванчика составил 13,2% на а.с.м., что может иметь практическое значение.
4. Установлено, что полисахариды фракций ПС-1 и ПС-2 относятся к пектиновым веществам. Их углеводные цепи построены из остатков га-лактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов: арабинозы, рамнозы, глюкозы, ксилозы, галактозы и маннозы.
5. Методом количественной спектроскопии ЯМР 13С доказано, что углеводные цепи пектиновых полисахаридов, выделенных при обработке оксалатом аммония, состоят на 67,7% масс. из а-1,4-связанных остатков D-галактуроновой кислоты с низкой степенью метилирования.
Остаток C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O-CH3
a-L-Araf-(1^ 110,5 82,5 78,0 83,2 63,0 - -
^2 -a-L-Araf-(1^ 108,2 85,1 77,8 85,5 63,7 - -
^4-a-GalAp-(1^ 102,2 69,5 70,0 79.1 73.1 175,6 -
^4-a-GalAp-(1^ 100,8 70,0 80,2 83.0 72,5 173,1 55,9
2,4)-a-L-Rhap-(1^ 99,6 * * * 68,0 18,9 -
Примечание: * сигналы низкой интенсивности перекрыты более интенсивными уширенными сигналами.
Таблица 5
Отнесение химических сдвигов (5, м.д. от ГМДС) сигналов в спектре ЯМР 13С фракции ПС-2 [1]
1. Пектиновые вещества растений Европейского Севера России / Оводов Ю.С. [и др.] // Екатеринбург : Изд-во УрО РАН, 2009. 110 с.
2. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопро-дуктов : учеб. пособие / Л.В. Донченко. М. : ДеЛи, 2000. 251 с.
3. Иванова Н.В., Попова О.В., Бабкин В.А. Изучение влияния различных факторов на выход и некоторые характеристики пектиновых веществ коры лиственницы // Химия растительного сырья. 2003. № 4. С. 43-46.
4. Оводов Ю.С. Газожидкостная хроматография углеводов. Обзор. Владивосток: Изд-во АН СССР, 1970. 70 с.
5. Калабин Г.А., Каницкая Л.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органи-
1ЕСКИЙ СПИСОК
ческого сырья и продуктов его переработки / М. : Химия, 2000. 408 с.
6. An Hypothesis: The Same Six Polysaccharides are Components of the Primary Cell Walls of all higher Plants / Albersheim P., Darvill A.G., O'Neill M.A., Schols H.A., Vo-ragen A.G.J. // Pectins and Pectinases: Proceedings of an International Symposium. Wageningen, Nertherlands, 1996. P. 47-55.
7. Odonmazig P., Badga D., Ebringerova' A., Alföldi J. Structures of pectic polysaccharides isolated from the Siberian apricot (Armaniaca siberica Lam.) // Carbohydr. Res. 1992. Vol. 226. P. 353-358.
1 ?
8. Pressey R., Himmelsbach D.S. C-NMR spectrum of a galactose-rich polysaccharide from tomato fruit // Carbohydr. Res. 1984. Vol. 127. P. 356-359.
