CC BY
12
УДК 66.08.001.5
СОРБЦИЯ КАТАЛАЗЫ НА КАРБОКСИЛЬНЫХ КАТИОНИТАХ
i
Г.А. Бектенова, Е.А. Бектуров
Институт химических наук им.А.Б.Бектурова
ЖумыстарНбагымына P.vitale сорбция каталозаны? твуелдыт мен iiUKi ерпйнде концентрациясы жене ферменттщ карбоксиметил-целлюлозана (КМ-ц), жене синтетикалъщ карбоксильЫ катиониттердщ КБ-4П-2 оган цоса полимел1 гидрогельдердег1 ионогенл1 карбоксильд1 топтардыц к;урандасы туралы зерттелтЫ.
В настоящей работе исследовалась зависимость сорбции каталазы P.vitale от времени рН и концентрации внешнего раствора и фермента на карбоксеметил-целлюлозе (КМ-ц), синтетических карбоксильных катионитах КБ-4П-2 и биосорб Т-12 (биокарб) и полимерных гидрогелях, содержащих ионогенные карбоксильные группы.
In the given work the dependence of a sorption ofcatalase P. vitale on time pH and concentration of choronomic solution and enzyme on carboxymethyl cellulose. (KM - if), synthetic carboxylic kationites КБ-4П-2 and biosorps T-12 (biocarbs) and polymer hydrogels keeping ionogenic carboxylic groups was studied.
При теоретическом рассмотрении сорбционного равновесия белка между ионитом и внешним раствором [1] было показано, что максимумы сорбции на слабокислотных и слабоосновных ионитах, в отличие от сильнокислотных и сильноосновных, находятся в области рН, где белок полностью сохраняет свою нативную конформацию. Поэтому данные иониты представляют наибольший интерес для ионообменной
очистки и иммобилизации ферментов. В связи с этим нам представлялось интересным провести сравнительное изучение сорбционного поведения белков на различных слабокислотных карбоксильных катионитах с гидрофильной матрицей. С этой целью в настоящей работе исследовалась зависимость сорбции каталазы P.vitale от времени, рН и концентраций внешнего раствора и фермента на карбоксиметил-целлю-
лозе (КМ-ц), синтетических карбоксильных катионитах КБ-4П-2 и био-сорб Т-12 (биокарб) и полимерных гидрогелях, содержащих ионоген-ные карбоксильные группы [2]. Кар-боксиметил-целлюлоза имеет гидрофильную полисахаридную матрицу, гидрофильность же остальных геле-вых сорбентов достигается за счет частой «посадки» ионогенных карбоксильных групп. Полученные экспериментальные результаты представлены на рисунках 1-4.
Как видно из рисунка 1, максимумы сорбции каталазы на карбоксильных катионитах находятся при рН 4,0 для КМ-целлюлозы, при рН 4,5 для катионита КБ-4П-2 и при рН 4,0-5,0 для биосорбаТ-12, что согласуется с константами ионизации карбоксильных ионогенных групп. Расширение максимума сорбции и десорбции на биосорбе может быть вызвано тем, что сорбция идет более чем по одному типу участков связывания или изменением состояния ионита при изменении рН. Очень характерная в этом отношении зависимость была получена для каталазы Asp. niger при сорбции на катионите КБ-4П-2 (рисунок 2). Здесь имеются два максимума сорбции при рН 4,5 и 5,5. Появление второго максимума сорбции при рН 5,5, вероятно, связано с конформационным изменением матрицы ионита (цепей поли-
метакриловой кислоты) при этом рН /31, когда ионит становится более проницаемым для сорбата, и в результате экспериментально достигаемый уровень сорбции повышается.
Во всех случаях, представленных на рисунках 1,2, кажущееся увеличение сорбции при уменьшении рН связано с инактивацией фермента в кислой области рН (рН<4,0). С помощью контрольных опытов было показано, что при рН>4,0 инактивация фермента практически отсутствует. Следовательно, некоторое несоответствие между сорбцион-ными и десорбционными кривыми объясняется необратимостью процесса.
Изучение зависимости сорбции каталазы от концентрации фонового буферного раствора (рисунок 3) показало, что полученные экспериментальные зависимости согласуются с теоретически предсказываемыми, из которых следует, что с увеличением концентрации буферного раствора коэффициент распределения белка между ионитом и внешним раствором должен уменьшаться. Следует отметить также, что при сорбции каталазы на биосорбе Т-12 в динамических условиях удалось достигнуть значительного концентрирования ферментного раствора: в самой активной фракции каталазная активность была в 100 раз выше исходной.
Рисунок 1.
Зависимость сорбции (I) и десорбции (2) каталазы P.vitale на биосорбе Т-12 (а), КБ-4П-2 (б) и КМ-целлюлозе (в) от рН 0,1 М фосфатного буфера при 25°С рН десорбции 7,00-7,50. Начальная концентрация фермента (ЬСАисх.) 173 Е/мл, 150 Е/мл и 129 Е/мл соответственно.
Рисунок 2.
Зависимость сорбции (I) и десорбции (2) каталазы Азр.г^ег на карбоксильном катионите КБ-4П-2 от рН 0,1 М фосфатного буфера К = 15 Е/мл, рН десорбции 7,40. 1 г, размер зерен 0,2-0,3 мм.
» Рисунок 3.
Зависимость сорбции (1,2,3) и десорбции (4,5,6) каталазы P.vitale на карбоксильных катеонитах от концентрации фосфатного буферного раствора 1,4 - КМ-целлюлоза (рН сорбции 4,00; КАпсх -135 Е/мл), 2,5 - КБ-4П-2 (рН сорбции 4,50; КА1|сх = 188 Е/мл) и 3,6 - биосорб T-I2 (рН сорбции 4,50; КАпсх-172 Е/мл). Навеска сорбента 1 г; объем раствора 50 мл; рН десорбции 7,00-7,50; температура 25°С.
Рисунок 4.
Изотермы сорбции каталазы Р.ука1е на карбоксильных катиони-тах из 0,1 М фосфатного буферного раствора при 25 °С
1. биосорб Т-12; рН сорбции 4,50; 2. КБ-4П-2; рН сорбции 4,50; 3. КМ-целлюлоза; рН сорбции 4,00.
M-rfegjz
4со ¿а? /-а»?
Сорбционные емкости карбоксильных катионитов, полученные из изотерм сорбции (рисунок 4), сильно различаются. Для КМ-целлюлозыколичесгво сорбированного фермента в состоянии, близком к насыщению, составляет 5000Е/г сорбента, для КБ4П-2 - около 24000 Е/г, для биосорба - около 88000 Шг, что в пересчете на вес чистого фермента равно 0,125 мг/г, 0,6 мг/г и 2,3 мг/г сорбента соответственно. Полученная отнооттельновысокая емкость сорбциинабиосорбеподтвер>клаегданные Г.В.Самсонова с сотрудниками о преиму-
/а? ¿со MP м.ед/тл
ществах макропористых ионитов /4-6/.
Таким образом, полученные экспериментальные данные по зависимости сорбции каталазы P.vitale на карбоксильных катеонитах от времени, рН, концентрации буферного раствора и фермента показали, что лучшими сорбционными характеристиками обладает синтетический карбоксильный катионит биосорб Т-12 (биокарб), специально синтезированный для сорбции белков, который может с успехом использоваться для хроматографии белков и ферментов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. // Деп. В КазгосИН-ТИ, 9.03.2000, № 8762-КаОО.
2.БекгеноваГ.А.//Изв. МОНРК, HAH PK. Сер. хим. -2001, № 3. -С.82-90.
3. Либинсон Г.С. Физико-химические свойства карбоксильных катионитов.-М.: Наука, 1969.-112 с.
4. Дмитренко П.В., Островский Д.И., Самсонов Г.В. // 2 Всес. симп. по
термодинамике ионного обмена. - Тезисы докл.-Минск, 1975.-С.4243.
5. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционные и хроматографичес-кие методы физико-химической биотехнологии. -Л.: Наука, 1986. - 230 с.
6.SamsonovG.V,KuznetsovaN.P.// InPolydectrolytes,Hydrops, Chromatographic Materials. - Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag, 1992.-Vol.104.-P.149.
