CC BY
7УДК 612.816.7
СОПРЯЖЕНИЕ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ МЕТАБОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ GIRK ПРИ РЕГУЛЯЦИИ КВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРА ПРОДОМЕНОМ BDNF В МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ
DOI
Гайдуков А. Е.1, Молчанова А. И.1
1 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова gaydukovae@my.msu.ru
Аннотация. Эндогенная активация пресинаптических аденозиновых А1-рецепторов, но не P2Y13-рецепторов или M2-холинорецепторов, необходима для стимуляции каналов GIRK под действием продомена BDNF в моторных синапсах, приводя к комплексному торможению квантовой секреции ацетилхолина.
Ключевые слова: нервно-мышечный синапс, продомен BDNF, GIRK, паннексин, aденозин.
Нейротрофин мозга (BDNF) — хорошо известный регулятор нейрогенеза модулятор передачи сигнала в синапсах ЦНС. Присутствие зрелого BDNF и мембранных рецепторов (TrkB и p75), действуя на которые, нейротрофин может запускать комплекс сигнальных путей, было выявлено во всех компонентах моторных синапсов млекопитающих — нервном окончании, постсинаптической мембране мышечных волокон и перисинаптических Шванновских клетках [1]. В настоящее время BDNF рассматривается как один из представителей разнообразного по составу семейства миокинов, который способен высвобождаться из мышечных волокон и функционировать как ретроградный мессенджер [2]. При этом трактовка синаптических модуляторных воздействий BDNF in vivo требует учета возможного одновременного действия побочного продукта его созревания из проBDNF — продомена BDNF, чья сигнальная роль которого только начала изучаться в моторных синапсах. В ЦНС продомен BDNF может играть независимую регуляторную
роль, влияя на проявления долговременной синаптической пластичности [3]. Недавно мы установили, что продомен БОМБ оказывает на синаптическую передачу в моторных синапсах действие, полностью противоположное эффектам зрелого нейротрофина — снижает частоту одноквантовых миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) и уменьшает амплитуду постсинапти-ческих потенциалов, как миниатюрных, так и многоквантовых ПКП, возникающих в результате быстрой синхронной секреции квантов ацетилхолина при приходе пресинаптического ПД. Снижение амплитуды многоквантовых ПКП под действием продомена БЭМБ реализуется не только за счет уменьшения амплитуд отдельных квантов в составе вызванных ПКП, но и за счет понижения их квантового состава [4]. Негативное влияние на частоту МПКП и квантовый состав ПКП, во-первых, свидетельствует о наличии пресинаптической компоненте у тормозного действия продомена БОМБ на квантовую секрецию ацетилхолина, а, во-вторых, могло быть связано с уменьшением пресинаптического входа ионов Са2+ за счет возрастания активности пресинаптических К+-каналов. Мы установили, что тормозное действие продомена БЭМБ в наномо-лярной концентрации реализуется за счет активации им рецептор-ного комплекса р75/сортилин и запуска КЪо-киназного сигнального каскада, направленного на стимулирование (за счет активности ри-анодиновых рецепторов пресинаптических Са2+-депо) Са ^-активируемых К+-каналов низкой проводимости (8К) и О-белок сцепленных калиевых каналов входящего выпрямления (ОШК) [4]. ОШК требуют дуальной активации — за счет их взаимодействия с мембранным фосфолипидом Р1Р2 (на увеличение его уровня, вероятно, направлен запускаемый продоменом БЭМБ КЪо-киназный сигнальный путь) и Ру-субъединицами О.-белков [5]. В моторных синапсах млекопитающих наличествует целый ансамбль пресинаптических метаботропных рецепторов, сопряженных с О.-белками. К числу наиболее вероятных кандидатов можно отнести мускариновые М2-холинорецепторы, аденозиновые А^рецепторы и Р2У13-пури-норецепторы. Необходимо было установить, какие именно из них вовлечены в реализацию негативного действия продомена БЭМБ на нервно-мышечную передачу?
Объектом исследования были нервно-мышечные препараты диафрагмы взрослых мышей линии С57/Б16 обоих полов. Регистрацию спонтанной секреции квантов ацетилхолина (МПКП) и быстрой синхронной многоквантовой секреции (ПКП) проводили
с помощью внутриклеточных микроэлектродов. Перед регистрацией вызванной активности (при стимуляции нерва с частотой 50 Гц в течение 1 с стимулами длительностью 0.08—0.1 мс) для предотвращения сокращения мышечных волокон их частично рассекали. Данный паттерн стимуляции (короткие высокочастотные залпы) использовали, потому что это напоминает паттерн разрядки мотонейронов, иннервирующих дыхательную мускулатуру, и квантовая секреция в данном случае проявляет характерные компоненты кратковременной синаптической пластичности. Регистрацию си-наптической активность проводили с использованием усилителя Neuroprobe Amplifier Model 1600 (A-M Systems) и аналого-цифровой преобразователя Е-154 (L—Card) с интерфейсом PowerGraph 6.0. Для анализа данных использовали программное обеспечение MiniAnalysis (Synaptosoft), последующую статистическую обработку проводили в GraphPad Prism 8. В каждой серии экспериментов использовали не менее трех нервно-мышечных препаратов. В контроле регистрировали активность не менее 5 разных синапсов. Затем в перфузионный раствор добавляли определенные фармакологические препараты и регистрировали активность разных синапсов на протяжении 40—60 мин. Анализировали изменения мембранного потенциала мышечных волокон, амплитудно-временные характеристики МПКП и ПКП. Проводили расчёт квантового состава ПКП с использованием корректировки амплитуд ПКП на нелинейную суммацию. Нормальность распределения значений параметров в выборках оценивали с использованием критерия Д'Агости-но-Пирсона. Применяли t-критерий Стьюдента при сравнении нормально распределенных величин параметров МПКП и ПКП, в ином случае — критерий Манна-Уитни. Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тюки использовали при сравнении изменений амплитуд и квантового состава ПКП в коротких залпах. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего, уровень значимости p = 0.05.
Сначала мы проверяли возможную роль активности мускари-новых M2-холинорецепторов в качестве коактиватора GIRK при действии продомена BDNF. Ингибитор M2-холинорецепторов ме-токтрамин (0.1 мкМ) вызывал равномерное увеличение амплитуд и квантового состава каждого ПКП в коротком высокочастотном залпе по сравнению с контролем, не оказывая влияния на амплитудно-временные характеристики МПКП. Данные изменения могли свидетельствовать о вовлечении в регуляцию выброса квантов
ацетилхолина Са2+-каналов Ь-типа [6]. Действительно, метоктра-мин-индуцированное усиление вызванного выброса ацетилхолина полностью предотвращалось под действием нитрендипина (1 мкМ) -блокатора этого типа Са2+-каналов, который сам по себе не влияет на амплитуду и квантовый состав ПКП в залпах. При этом в присутствии метоктрамина и нитрендипина продомен БЭМБ полностью сохранил способность угнетать квантовую секрецию ацетилхолина.
Совокупность полученных данных свидетельствует, во-первых, о том, что мускариновые М2-холинорецепторы вовлечены в негативную регуляцию активности пресинаптических Са 2+-каналов Ь-типа, обеспечивая их «замаскированное» состояние в нормальных условиях работы моторных синапсов, а во-вторых, М2-холино-рецепторы не сопряжены с ОШК и не участвуют в их ч стимулировании под действием продомена БЭМБ.
Ранее мы показали, что тормозное влияние на вызванный выброс ацетилхолина со стороны пуринорецепторов (А1 и Р2У13) требует функционирования каналов, образованных паннексином 1 (паннексонов), в качестве дополнительному к везикулярному источника синаптической АТФ [7]. Кроме того, в моторных синапсах мышей, нокаутных по гену паннексина1, и имеющих нормальные характеристики квантовой секреции АХ [8], продомен БЭМБ утрачивал способность ее угнетать [4]. Недавно мы выявили, что фармакологическое блокирование паннексонов пробенецидом (1 мМ) не приводит к изменениям параметров вызванной многоквантовой секреции ацетилхолина в моторных синапсах мышей дикого типа [8]. Однако, как и в нервно-мышечных синапсах мышей, нокаутных по гену пан-нексина1, при заблокированных пробенецидом паннексонах в моторных синапсах мышей дикого типа продомен БЭМБ полностью утрачивал способность уменьшать амплитуды МПКП и ПКП и снижать квантовый состав ПКП в коротких ритмических залпах.
Эти данные говорят о том, что для вовлечения ОШК в регуляцию квантовой секреции ацетилхолина в моторных синапсах под действием продомена БЭМБ необходимо адекватное функционирование компонентов пуринергической модулирующей системы. Нам оставалось выяснить, эндогенная активация каких пуринорецепторов — Р2У13 или А1 — в условиях залповой активности моторных синапсов будет обеспечивать ОШК-опосредованное тормозного действия продомена БЭМБ? Нами было установлено ранее, что ин-гибирование Р2У13-рецепторов МИ82211 (10 мкМ) приводит к равномерному увеличению амплитуд ПКП по всему ходу коротких
залпов — за счет возрастания квантового состава ПКП [6]. В ходе текущего исследования мы установили, что активность P2Y13-ре-цепторов, как и мускариновых M2-холинорецепторов, направлена на предотвращение вовлечения в регуляцию квантовой секреции АХ Ca2+-каналов L-типа — потенцирующее действие MRS2211 в отношении вызванного выброса ацетилхолина предотвращалось нитрендипином. Однако продомен BDNF при ингибировании P2Y13-рецепторов MRS2211 и заблокированных нитрендипином Ca2+-каналах L-типа эффективно проявлял свое тормозное влияние на квантовую секрецию АХ — угнетал как амплитуду постсинапти-ческих потенциалов, так и квантовый состав ПКП. Таким образом, мы убедились, что, несмотря на присутствие в моторных синапсах мыши P2Y13-рецепторов, их активность и физиологическую значимость как негативных регуляторов выброса ацетилхолина, они не сопряжены с активацией GIRK и комплексным торможением секреции ацетилхолина под влиянием продомена BDNF.
Уже известно, что А^рецепторы, благодаря их активации эндогенным аденозином, тормозят квантовую секрецию АХ и препятствуют вовлечению Ca 2+-каналов L-типа [6,7]. В данной работе негативное действие продомена BDNF в отношении квантовой секреции АХ полностью предотвращалось при блокировании А1-рецепторов DPCPX (100 нМ) в присутствии нитрендипина (1 мкМ) — значения амплитуд МПКП и ПКП и квантового состава ПКП в коротких залпах статистически значимо не отличались от таковых в контроле.
Таким образом, проведенные нами исследования впервые показали, что эндогенная активация именно пресинаптических аде-нозиновых A1-рецепторов, давно известных в качестве тормозящих нервно-мышечную передачу в моторных синапсах млекопитающих, необходима для реализации комплексного механизма угнетения квантовой секреции ацетилхолина под действием продомена BNDF. Предотвращение активации только этих пуринорецепто-ров — за счет их прямого ингибирования или непрямого снижения их активности (за счет фармакологического или генетического «выключения» паннексинового источника синаптических пуринов) — устраняет негативное влияние продомена BDNF на параметры квантовой секреции ацетилхолина в моторных синапсах мыши.
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта 22—25—00111.
Список литературы
1. Garcia N, Tomas M, Santafe MM, Lanuza MA, Besalduch N, Tomas J. Localization of brain-derived neurotrophic factor, neuro-trophin-4, tropomyosin-related kinase b receptor, and p75 NTR receptor by high-resolution immunohistochemistry on the adult mouse neuromuscular junction. J. Peripher. Nerv. Syst. 2010;15 (1):40—49.
2. Gaydukov A, Bogacheva P, Tarasova E, Molchanova A, Miteva A, Pravdivceva E, Balezina O. Regulation of Acetylcholine Quantal Release by Coupled Thrombin/BDNF Signaling in Mouse Motor Synapses. Cells. 2019;8 (7):762.
3. Kojima M, Matsui K, Mizui T. BDNF pro-peptide: physiological mechanisms and implications for depression. Cell Tissue Res. 2019;377 (1):73—79.
4. Bogacheva PO, Molchanova AI, Pravdivceva ES, Miteva AS, Balezina OP, Gaydukov AE. ProBDNF and Brain-Derived Neurotrophic Factor Prodomain Differently Modulate Acetylcholine Release in Regenerating and Mature Mouse Motor Synapses. Front. Cell. Neurosci. 2022;16:866802.
5. Luo H, Marron Fernandez de Velasco E, Wickman K. Neuronal G protein-gated K+ channels. Am J Physiol Cell Physiol. 2022; 323 (2): 439—460.
6. Tarasova E, Miteva A, Gaidukov A, Balezina O. The role of adenosine receptors and L-type calcium channels in the regulation of the mediator secretion in mouse motor synapses. Biochem. Moscow Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2015;15:318—328.
7. Miteva AS, Gaydukov AE, Shestopalov VI, Balezina OP. The role of pannexin 1 in the purinergic regulation of synaptic transmission in mouse motor synapses. Biochem. Moscow Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2017;11:311—320.
8. Miteva AS, Gaydukov AE, Balezina OP. Acetylcholine release in mouse motor synapses. Changes of purinergic regulation under conditions of pharmacological blockade of pannexin 1 and its genetic knockout. Biochem. Moscow Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2021;15:378—386.
COUPLING OF PRESYNAPTIC METABOTROPIC RECEPTORS AND GIRK POTASSIUM CHANNELS DURING REGULATION OF QUANTAL NEUROTRANSMITTER RELEASE BY BDNF PRODOMAIN IN MOUSE MOTOR SYNAPSES
Gaydukov A. E.1, Molchanova A. 1.1
1 M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
Abstract: Endogenous activation of presynaptic adenosine A1 receptors, but not P2Y13 receptors or M2 cholinergic receptors, is necessary for stimulation of GIRK channels under the action of the BDNF prodomain in motor synapses, leading to complex inhibition of acetylcholine quantal release.
Key words: neuromuscular junction, BDNF prodomain, GIRK, pannexin, adenosine.
