CC BY
6УДК 612.816.7
РОЛЬ ПРОДОМЕНА BDNF В РЕГУЛЯЦИИ КВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ АЦЕТИЛХОЛИНА В МОТОРНЫХ СИНАПСАХ
DOI
Гайдуков А. Е.1, Молчанова А. И.1, Богачева П. О.1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова e-mail: gaydukov@gmail.com
Аннотация. Продомен BDNF действует как функциональный антагонист зрелого нейротрофина, оказывая преимущественно ингибирующее влияние на квантовую секрецию ацетилхолина в новообразованных в ходе посттравматической реиннервации и зрелых моторных синапсах мыши.
Ключевые слова: нервно-мышечный синапс, продомен BDNF, GIRK, p75, ROCK.
Нейротрофический фактор мозга (Вгат Derived Neurothrophic Factor (BDNF)) хорошо изучен как белковый регулятор развития и дифференцировки нейронов и синапсов, а также как регулятор си-наптической пластичности в синапсах ЦНС. Наличие как BDNF, так и его рецепторов было показано во всех трех отделах нервно-мышечных синапсов — нервных терминалях, перисинаптических Шванновских клетках и мышечных волокнах. В настоящее время BDNF считается миокином, поскольку он может высвобождаться из мышцы и действовать на нервные окончания как ретроградный мессенджер. В последнее время стало очевидно, что многочисленные синаптические эффекты BDNF не могут трактоваться однозначно без учета возможного одновременного действия его побочных продуктов созревания. Как и у других нейротрофинов, образование BDNF проходит в несколько этапов. Сначала синтезируется предшественник BDNF, который может «созревать» до BDNF вну-триклеточно — за счет протеолиза фурином или конвертазами — с образованием продомена BDNF. Предшественник BDNF может расщепляться до зрелого BDNF и его продомена и внеклеточно, в синаптической щели, за счет активности присутствующих здесь плазмина или матриксных металлопротеиназ. В мышечных волок-
нах показана экспрессия проBDNF и возможность высвобождения эндогенного BDNF из них. Таким образом, в синаптической щели могут присутствовать не только зрелый BDNF, но и его предшественник, а также — продомен BDNF. Как могут действовать в моторных синапсах эти сигнальные молекулы — вопрос, остающийся во многом не изученным. В настоящее время в моторных синапсах описаны два типа рецепторов: p75 — на которые преимущественно должен действовать продомен BDNF, и TrkB-рецепторы, на которые действует зрелый BDNF. Оба типа рецепторов при их активации способны запускать множественные сигнальные каскады с участием различных вторичных посредников и мишеней, и опосредуют, как правило, противоположные влияния на процессы в синапсах ЦНС.
Целью работы было исследовать влияние на квантовую секрецию ацетилхолина продомена BDNF в новообразованных в ходе ре-иннервации мышечных волокон и зрелых моторных синапсах.
Экспериментальным объектом служили синапсы мыш-цы-длинного разгибателя пальцев EDL) на 11 сутки после пе-редавливания малоберцового нерва и зрелые синапсы диафрагмы мыши. С использованием стандартной микроэлектродной техники регистрировали спонтанную секрецию квантов ацетилхолина в виде миниатюрных потенциалов концевой пластинки — МПКП, и вызванную синхронную секрецию квантов ацетилхолина в виде многоквантовых потенциалов концевой пластинки — ПКП — при стимуляции нерва короткими залпами импульсов (50 Гц, 1с). Данный режим стимуляции напоминает паттерн генерации ПД мотонейронами. Анализировали амплитуду, частоту и временной ход МПКП, при регистрации вызванной активности синапсов оценивали изменения амплитуды и квантового состава ПКП по ходу ритмического залпа.
В новообразованных синапсах продомен BDNF (1 нМ) не оказал влияния на частоту и временной ход МПКП, в то же время вызывая статистически значимое увеличение их амплитуды на 30%. Данный эффект предотвращался прямым ингибированием везикулярного транспорта ацетилхолина с помощью везамикола (1 мкМ), который сам по себе не оказывал воздействия на параметры МПКП. Полученные данные свидетельствуют о том, что продомен BDNF может активировать пресинаптические рецепторы и, усиливая загрузку ацетилхолина в синаптические везикулы, тем самым увеличивать размер квантов. Продомен BDNF снижал квантовый состав ПКП на протяжении всего залпа ПКП на 20%, но амплитуда ПКП не изме-
нялась по сравнению с контролем. В то же время, продомен увеличивал амплитуду МПКП, зарегистрированных до стимуляции нерва в тех же синапсах, где были зарегистрированы ПКП. По-видимому, продомен BDNF индуцирует одновременное развитие двух противоположно направленных пресинаптических эффектов (увеличение размера квантов и уменьшение квантового состава многоквантовых ПКП), что позволяет поддерживать и без того низкую амплитуду ПКП в реиннервируемых синапсах на стабильном уровне контроля. Рецепторные и сигнальные механизмы, лежащие в основе такого разнонаправленного действия продомена BDNF в моторных синапсах, требуют дальнейшего экспериментального исследования.
В зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши продомен BDNF также оказался способен влиять на синаптическую передачу, причем прямо противоположным образом по сравнению со зрелым нейротрофином. Впервые показано, что на фоне продомена угнетается спонтанная секреция ацетилхолина — быстро снижается как частота, так и амплитуда МПКП. Продомен BDNF угнетал и вызванный многоквантовый выброс ацетилхолина — на его фоне по всему ходу залпа уменьшалась как амплитуда ПКП, так и их квантовый состав. Уменьшение частоты МПКП и квантового состава ПКП под действием продомена BDNF означает, что у него имеется пре-синаптическая компонента регуляторного негативного действия в зрелых моторных синапсах.
Оставался открытым вопрос, каков механизм такого необычного тормозного действия продомена? Прежде всего, нужно было установить, на какой рецептор в моторных синапсах действует про-домен? Оказалось, что продомен полностью утрачивал способность тормозить вызванную секрецию АХ как в присутствии селективного ингибитора p75-опосредованного сигнального пути, связанного с активацией малой ГТФазы Rho (TAT-Pep5, 1 мкМ), так и ингибитора сортилина AF38469 (5 мкМ). Таким образом, мы впервые показали, что для реализации угнетающего действия продомена BDNF на секрецию ацетилхолина в зрелых моторных синапсах необходима активация рецепторного комплекса p75 и сортилина, которые и обеспечивают негативное влияние продомена на нервно-мышечную передачу. Еще одним аргументом в пользу того, что тормозное влияние продомена BDNF на секрецию ацетилхолина в зрелых моторных синапсах реализуется именно за счет активации сигнального пути связанной с активацией Rho-активируемой протеинкиназы (ROCK), служит тот факт, что ингибитор ROCK Y27632 (3 мкМ),
сам по себе не влияя на параметры синаптической передачи, эффективно предотвращает развитие тормозного действия продоме-на на вызванную секрецию медиатора.
Снижение частоты и квантового состава ПКП под действием продомена BDNF может быть обусловлено уменьшением преси-наптического входа Ca2+ в нервную терминаль за счет повышения активности пресинаптических ^-каналов. Используя селективные блокаторы, протестировали несколько типов ^-каналов ^^ SK, GIRK). и оказалось, что только блокатор G-белок активируемых калиевых каналов входящего выпрямления ^Шф — тертиапин^ (1 мкМ) — полностью предотвращает негативное влияние продомена на вызванную секрецию ацетилхолина. Необходимо отметить, что мы впервые показали функционирование этого типа калиевых каналов в моторных синапсах млекопитающих. Известно, что для активации GIRK требуется участие мета-ботропных Gi-белок-сцепленных рецепторов. Мы предположили, что в нашем случае это могут быть пуринорецепторы — А1-ре-цепторы аденозина или P2Y13-рецепторы АТФ, присутствие которых показано в моторных синапсах. Для проверки этой гипотезы использовали нервно-мышечные препараты мышей, нока-утных по гену паннексина 1 — белка, образующего полуканалы, которые обеспечивают появление в синаптической щели пуринов — АТФ и аденозина, действующих на эти пуринорецепторы. У таких нокаутных мышей секреция ацетилхолина в моторных синапсах не отличается от таковой у животных дикого типа, но активации пуринорецепторов не происходит из-за недостатка их эндогенных агонистов. Оказалось, что продомен BDNF в моторных синапсах диафрагмы, лишенных панексина 1, утрачивает свою способность тормозить вызванную секрецию ацетилхолина, что может быть связано с невозможностью повышения активности GIRK-каналов при недостатке функционирования синапти-ческих пуринорецепторов.
В заключении необходимо отметить, что в работе впервые показано, что продомен BDNF способен оказывать самостоятельное регуляторное действие на квантовую секрецию ацетилхолина в моторных синапсах мыши с разным функциональным статусом, причем — преимущественно тормозное, противоположное влиянию зрелого BDNF.
Работа поддержана грантом РНФ 22-25-00111.
ROLE OF BDNF PRODOMAIN IN THE REGULATION OF QUANTAL ACETYLCHOLINE RELEASE IN MOTOR SYNAPSES
Gaydukov A. E.1, Molchanova A. I.1, Bogacheva P. O.1
1 M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
Abstract. BDNF prodomain acts as a functional antagonist of mature neurotrophin, exerting a predominantly inhibitory effect on the quantal secretion of acetylcholine in mature and newly formed mouse motor synapses during post-traumatic muscle reinnervation.
Key words: neuromuscular synapse, BDNF prodomain, GIRK, p75, ROCK.
