CC BY
27
УДК 612.816
CaMKII участвует в вызванном холином торможении секреции ацетилхолина в моторных синапсах мыши
А. Е. Гайдуков*, О. П. Балезина
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
*E-mail: gaydukov@gmail.com
Поступило в редакцию 07.07.2016
Принято к печати 03.10.2017
РЕФЕРАТ Исследовали участие кальций-зависимых ферментов - протеинкиназы С (РКС) и кальций/ кальмодулин-зависимой протеинкиназы типа II (СаМКП) - в каскаде реакций, запускаемых воздействием на пресинаптические никотиновые холинорецепторы альфа7-типа экзогенного холина, вызывающего подавление вызванного выброса ацетилхолина (АХ) в моторных синапсах мыши. В присутствии блокатора РКС хелеритрина вызванная секреция АХ не изменялась, и сохранялась способность холина тормозить вызванный выброс АХ. Блокатор СаМКП К^62 не влиял на активность синапсов, но полностью предотвращал торможение секреции АХ, вызванное холином.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа типа II, нервно-мышечный синапс, никотиновые холинорецепторы альфа7-типа, холин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АХ - ацетилхолин; альфа7-нХР - никотиновые холинорецепторы альфа7-типа; МПКП - миниатюрные потенциалы концевой пластинки; ПКП - потенциалы концевой пластинки; РКС -протеинкиназа С; СаМКП - кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа типа II.
ВВЕДЕНИЕ
Холин образуется в холинергических синапсах в результате гидролиза медиатора ацетилхолина (АХ) с помощью фермента ацетилхолинэстеразы. Наряду с обратным захватом в нервную терминаль для восполнения там синтеза АХ, холин играет важную роль в ауторегуляции секреции АХ по механизму обратной связи. Этот механизм реализуется благодаря способности холина избирательно активировать пресинаптические никотиновые холинорецепторы альфа7-типа (альфа7-нХР) [1]. Эти рецепторы широко представлены в центральных и периферических синапсах и известны не только своей способностью пропускать внутрь ионы натрия и кальция при активации холином и другими агонистами, деполяризуя мембрану, но и запускать разнообразные внутриклеточные каскады с участием ферментов и каналов [2]. Кроме того, недавно в молекуле альфа7-нХР нашли аминокислотный кластер, обеспечивающий их функциональное взаимодействие с G-белками. Это расширяет возможность работы альфа7-нХР не только как быстро десенситизируемых ионотропных рецепторов, но и как особых метаботропных рецепторов, осуществляющих длительную сигнализацию, приводящую к долговременным эффектам [3]. Таким образом, неоднозначность последствий активации пре-
синаптических альфа7-нХР в разных типах синапсов представляет малоизученную и актуальную проблему. Недавно мы установили, что в нервно-мышечных синапсах мыши холин (0.1 мМ) подавляет вызванный выброс АХ, и этот тормозной эффект сопровождается Са2+-зависимым выбросом депонированного Са2+ через рианодиновые рецепторы и далее - активацией Са2+-активируемых калиевых каналов SK-типа терминалей, что и приводит к торможению секреции АХ [4]. При этом оставалось не ясным, может ли в данном каскаде участвовать активность Са2+-зависимых ферментов, таких, как протеинкиназа С (PKC) и/или кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа типа II (CaMKII). В связи с этим целью данной работы было тестирование изменений секреции АХ в моторных синапсах мыши, вызываемых холином в сочетании с действием блокаторов каль-модулина и Са2+-зависимых ферментов - СаМКП и PKC.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы (m. diaphragma - n. phrenicus) взрослых (P30) самцов мышей 129/Sv, полученных из Института нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАН,
116 | ACTA NATURAE | ТОМ 9 № 4 (35) 2017
Москва, Россия. Всего было использовано 16 животных. Мышей умерщвляли посредством быстрого обезглавливания. Животных содержали в соответствии с Директивой 86/609/EEC по обращению человека с лабораторными животными, протокол был одобрен комиссией по биоэтике биологического факультета МГУ. Все эксперименты проводили при комнатной температуре 20-22°С. Использовали стандартный, ранее описанный нами протокол приготовления рассеченного нервно-мышечного препарата левой полудиафрагмы с диафрагмальным нервом [4]. Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и вызванные раздражением диафрагмального нерва многоквантовые потенциалы концевой пластинки (ПКП) регистрировали с помощью внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, заполненных 2.5 М KCl (сопротивление кончика микроэлектрода 15-20 МОм). Регистрации ПКП в каждом синапсе предшествовала регистрация МПКП в течение 100 с, затем стимулировали диафрагмальный нерв в режиме короткого ритмического залпа (50 стимулов длительностью 0.1 мс с частотой 50 Гц). Сигналы регистрировали с использованием усилителя Neuroprobe Amplifier Model 1600 (A-M Systems), сигналы на жесткий диск компьютера записывали с помощью аналого-цифрового преобразователя Е-154 с интерфейсом PowerGraph (L-Card). Данные затем обрабатывали в программе MiniAnalysis (Synaptosoft). В контроле регистрировали МПКП и ПКП от пяти и более разных синапсов, после чего в перфузионный раствор в определенном порядке добавляли исследуемые вещества, далее регистрировали активность разных синапсов на протяжении 1-1.5 ч. В каждой серии экспериментов использовали не менее трех нервно-мышечных препаратов. В работе использовали холин, хелери-трин (Sigma, США), W-7, KN-62 (Enzo Life Sciences, США). Оценивали амплитуду, временной ход МПКП и ПКП, частоту МПКП и квантовый состав ПКП (его рассчитывали как отношение средней корректированной на нелинейную суммацию амплитуды ПКП [5] к средней амплитуде МПКП). Статистическую значимость различий между выборками оценивали по t-критерию Стьюдента и критерию Манна-Уитни. Уровень значимости отличий между двумя выборками составлял 0.05 (n - количество исследованных синапсов).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пресинаптическое действие холина, как и в предыдущей нашей работе [4], изучали при его концентрации 100 мкМ, близкой к имеющейся в синаптической щели при расщеплении АХ и незначительно превышающей EC50 для активации альфа7-нХР [6].
Холин не вызывал значимых изменений мембранного потенциала мышечных волокон, а также частоты генерации спонтанных МПКП. Средняя амплитуда МПКП на фоне действия холина (1.08 ± 0.09 мВ (п = 17)) также не изменялась значимо по сравнению с контролем (1.05 ± 0.08 мВ (п = 15), р > 0.05). При запуске коротких ритмических залпов (50 Гц,
1 с) наблюдали характерные изменения амплитуды и квантового состава ПКП по ходу залпа. Вслед за кратковременным облегчением передачи развивалась депрессия в виде снижения амплитуды ПКП по сравнению с первым в залпе, после чего амплитуда ПКП (и квантовый состав) устанавливается на постоянном сниженном уровне по сравнению с первым ПКП (рис. 1). При перерыве между залпами порядка
2 мин и более картина повторных залпов в отдельном синапсе или других тестируемых синапсах устойчиво воспроизводилась. Аппликация холина приводила к снижению амплитуды ПКП в залпе за счет снижения их квантового состава. Значения квантового состава ПКП под действием холина статистически значимо снижались по всему ходу залпа по сравнению с контролем до 64-71% (р < 0.05). При этом рисунок залпа в целом остался неизменным (рис. 1). Уменьшение амплитуды и квантового состава ПКП наблюдалось, начиная с 15-20 мин от начала воздействия холина, и сохранялось на сниженном уровне на протяжении всего времени аппликации холина (в течение 45-60 мин).
Эффекты блокатора РКС хелеритрина
Аппликация на мышцу блокатора РКС хелеритрина (4 мкМ) в течение 30-40 мин не вызывала значимых изменений характера залповой синаптической активности - ни квантовый состав ПКП по ходу залпа, ни сам рисунок залпа (начальное облегчение, последующая депрессия, фаза «плато») достоверно не изменялись под действием хелеритрина (р > 0.05). Более того, хелеритрин никак не повлиял и на тормозные эффекты холина в отношении квантового состава ПКП при залповой активности синапсов (рис. 2А). Отсюда следует, что и Са2+-сигналы, поступающие в терминаль при активации холином альфа7-нХР с последующим выбросом депонированного кальция, и возможная метаботропная сигнализация альфа7-нХР с участием Gq-белка, как показано на других объектах [3], не способны активировать РКС и вовлечь ее в торможение секреции АХ в моторных синапсах. Это согласуется с нашими и опубликованными данными, где показано, что в моторных терминалях активация РКС может запускаться входом кальция в терминаль через другие Са2+-входы, в частности, при работе Са2+-каналов L-типа, и соучаствовать в облегчении секреции АХ [7].
А
10 мВ
—и
5 мс ПКП
С С
с
о
с
>5 .о
40 35 30 25 20 15 10 5 0
1 3 5 7 9 1113151719 212325272931333537394143454749 Номер ПКП в залпе
Рис. 1. Тормозное влияние экзогенного холина (100 мкМ) на вызванную секрецию АХ при ритмической активности синапсов с частотой 50 Гц (1 с). А - усредненные записи первых ПКП (ПКП1) и последних ПКП (ПКП50) в залпах - в контроле (черный) и в присутствии холина (красный). Б - изменение квантового состава ПКП по ходу короткого ритмического залпа ПКП в контроле и в присутствии холина. По оси ординат -квантовый состав ПКП, по оси абсцисс - порядковый номер ПКП в коротком залпе. * р < 0.05 по сравнению с контролем
А
П К П
с о с й ы в о т н а
Контроль Хелеритрин Хелеритрин + холин
55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
1 3 5 7 9 1113151719212325272931333537394143454749
П К П в а т с о с й ы в о т н а
40 35 30 25 20 15 10 5
Номер ПКП в залпе
г%
0
Контроль - ^-7
W-7 + холин
-г^шттт^т-'
•«••••••••а
1 3 5 7 9 1113151719212325272931333537394143454749 Номер ПКП в залпе
Рис. 2. Изменение квантового состава ПКП по ходу короткого ритмического залпа ПКП при ритмической активности синапсов с частотой 50 Гц. А - в контроле, в присутствии 4 мкМ хелеритрина и при действии 100 мкМ холина на фоне хелеритрина. Б - в контроле (п = 17), при действии 10 мкМ W-7 (п = 15) и под действием холина (100 мкМ) на фоне W-7 (п = 18). По осям ординат - квантовый состав ПКП, по осям абсцисс - порядковый номер ПКП в коротком залпе. * р < 0.05 по сравнению с контролем
Б
Б
Эффекты блокатора кальмодулина W-7
Следующим шагом работы было исследование эффектов холина на фоне предварительного выключения регуляторной активности кальмодулина с помощью его ингибитора W-7 (10 мкМ). Блокатор кальмодулина не оказывал собственного действия на передачу и не влиял значимо на тормозной эффект холина в отношении вызванной секреции АХ, хотя тормозное действие холина в условиях ингиби-рования кальмодулина было менее выражено, чем при действии только холина (рис. 2Б).
Эффекты блокатора СаМКП К^62
В последней серии изучали возможную активацию и участие собственно СаМКП в тормозных эффектах холина. Для этого использовали избирательный блокатор СаМКП - К^62 (3 мкМ). При перфузии нервно-мышечного препарата раствором, содержащим К^62, в течение 30-40 мин мы не обнаружили значимых сдвигов ни амплитуды МПКП, ни изменений квантового состава ПКП по ходу коротких залпов. Так, амплитуда МПКП в контроле составляет 0.91 ± 0.05 мВ (п = 20), при действии К^62
118 | АСТА ЫАТиИАЕ | ТОМ 9 № 4 (35) 2017
0.85 ± 0.04 мВ (п = 23, p > 0.05), а на фоне холина в присутствии К^62 - 0.83 ± 0.06 мВ (п = 25). Однако на фоне действия К^62 на моторные синапсы аппликация холина не вызвала достоверного снижения амплитуды и квантового состава ПКП в залпе по сравнению с контролем (рис. 3).
Это показывает, что обнаруженное нами ранее подавление выброса АХ при действии холина на пре-синаптические альфа7-нХР предполагает, наряду с другими процессами [4], активацию СаМКИ и ее участие в торможении секреции медиатора.
В настоящее время в терминалях центральных и периферических синапсов выявлена активация пресинаптической СаМКП как за счет входов наружного [8], так и выброса внутриклеточного кальция [9], и возможность ее разнонаправленного влияния на секрецию медиаторов и комедиаторов [9, 10]. При активации альфа7-нХР эндогенным либо экзогенным холином в синапсах ЦНС наблюдается модуляция вызванного выброса медиатора. Недавно в синапсах гиппокампа описана генерация кальциевого сигнала при воздействии холина на пресинаптические альфа7-нХР, приводящая к возрастанию амплитуды возбуждающих постсинаптических потенциалов, однако эти эффекты не сопровождались активацией СаМКП и сохранялись в присутствии блокатора К^ 62 [11]. Ранее нами впервые было показано, что в периферических синапсах мыши активация альфа7-нХР холином приводит к торможению вызванной секреции медиатора АХ, и это торможение можно полностью предотвратить блокированием рианоди-новых рецепторов или SK-каналов [4]. Настоящая работа существенно дополняет эти представления. Оказалось, что в механизмах ауторегуляции секреции АХ с участием холина и альфа7-нХР участвует также и СаМКИ. Выявленная нами вовлеченность СаМКИ в ауторегуляцию секреции АХ позволяет добавить эту киназу к уже описанной совокупности ферментов, способных по-разному участвовать в передаче сигнала при активации альфа7-нХР в разных типах клеток [3, 11]. Таким образом, при исследовании роли альфа7-нХР в регуляции клеточных процессов необходимо учитывать возможность активации СаМКИ.
До сих пор единственным примером участия СаМКИ в работе нервно-мышечных синапсов грызунов была обнаруженная нами недавно активация
Номер ПКП в залпе
Рис. 3. Изменение квантового состава по ходу короткого ритмического залпа ПКП с частотой 50 Гц в контроле, при действии 3 мкМ К^-62 и под действием холина (100 мкМ) на фоне К^62. По оси ординат -квантовый состав ПКП, по оси абсцисс - порядковый номер ПКП в коротком залпе
и вклад фермента в усиление секреции АХ при входе кальция по L-типу кальциевых каналов [12]. В данной работе впервые описан качественно отличный способ активации и участия СаМКИ в работе тер-миналей, когда активация альфа7-нХР сопровождается вовлечением СаМКИ в торможение секреции АХ. Роль популяции СаМКИ, расположенной в непосредственной близости от альфа7-нХР и внутри-терминальных кальциевых депо, может заключаться в усилении и продлении обеспечиваемого работой ри-анодиновых рецепторов кальциевого сигнала, необходимого для активации калиевых каналов SK-типа.
Таким образом, в моторных нервных термина-лях мыши впервые выявлен каскад реакций, запускаемый действием холина на пресинаптические альфа7-нХР, приводящий к подавлению секреции АХ. Показано, что в этом каскаде задействованы не только выброс депонированного кальция и каль-ций-активируемые К+-каналы SK-типа, но и активность Са2+-зависимого фермента СаМКИ. •
Работа поддержана РФФИ (грант № 13-04-00413a).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Albuquerque E.X., Pereira E.F., Alkondon M., Rogers S.W. // Physiol. Rev. 2009. V. 89. № 1. P. 73-120.
2. Cheng Q., Yakel J.L. // Biochem. Pharmacol. 2015. V. 97. № 4. P. 439-444.
3. King J.R., Nordman J.C., Bridges S.P., Lin M.K., Kabbani N. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 33. P. 20060-20070.
4. Гайдуков А.Е., Богачева П.О., Тарасова Е.О., Балезина О.П. // Acta Naturae. 2014. Т. 6. № 4. С. 117-122.
5. McLachlan E.M., Martin A.R. // J. Physiol. 1981. V. 311. P. 307-324.
6. Papke R.L., Porter Papke J.K. // Br. J. Pharmacol. 2002. V. 137. № 1. P. 49-61.
7. Гайдуков А.Е., Марченкова А.А., Балезина О.П. // Бюл. эксп. биол. мед. 2012. Т. 153. № 4. С. 400-405.
8. Zhong C., Talmage D.A., Role L.W. // PLoS One. 2013. V. 8. № 12. e82719.
9. de Jong A.P., Verhage M. // Curr. Opin. Neurobiol. 2009 V. 19. № 3. P. 245-253.
10. Shakiryanova D., Klose M.K., Zhou Y., Gu T., Deitcher D.L., Atwood H.L., Hewes R.S., Levitan E.S.// J. Neurosci. 2007.
V. 27. № 29. P. 7799-7806.
11. Cheng Q., Yakel J.L. // J. Neurosci. 2014. V. 34. № 1. P. 123144.
12. Тарасова Е.О., Гайдуков А.Е., Балезина О.П. // Нейрохи-мия. 2015. Т. 32. № 2. С. 123-130.
120 | ACTA NATURAE | ТОМ 9 № 4 (35) 2017
