CC BY
86
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Биохимия ♦
УДК 636.5.082.474: 591.3
Соотношение транспортных белков церулоплазмина, трансферрина и состояние «красной крови» при использовании некоторых естественных метаболитов у цыплят кросса «Шейвер 2000»
И.С. Ярцева, аспирант (ine98@yandex.ru), Т.О. Азарнова, доктор биологических наук (Azarena@list.ru),
Е.Н. Индюхова, аспирант (zxcv33980@yandex.ru), А.А. Антипов, кандидат ветеринарных наук (axis83@mail.ru), М.С. Найденский, доктор сельскохозяйственных наук, С.Ю. Зайцев, доктор биологических наук, доктор химических наук (s.y.zaitsev@mail.ru)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «<Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина» (Москва).
Комплекс естественных метаболитов — коламина, янтарной кислоты и серина, обладая выраженными антиок-сидантыми свойствами, положительно повлиял на транспорт железа и меди у цыплят суточного возраста, что подтвердилось более продуктивным эритропоэзом в их организме. При этом антиокислительная активность сыворотки крови возросла не только за счет увеличения активности внутриклеточных ферментов антиоксидант-ной защиты, но и благодаря пропорциональному увеличению соотношения внеклеточных транспортных белков — церулоплазмина и трансферрина. Вышеуказанное позволило снизить интенсивность липопероксидации билипид-ных мембранных структур клеток организма эмбриона за счет нивелирования свободно-радикальных реакций в условиях оксидативного стресса.
Ключевые слова: антиоксиданты, выводимость, се-рин, трансферрин, церулоплазмин, цыплята, эта-ноламин, эритропоэз, янтарная кислота Сокращения: АОА — антиокислительная активность, АОЗС — антиоксидантная защитная система, БАВ — биологически активные вещества, МДА — малоновый диальдегид, ОШ — основания Шиффа, ПОЛ — пере-кисное окисление липидов, СОД — супероксиддисмута-за, СОЭ—скорость оседания эритроцитов, ТФ—трансферрин, ФАД — флавинадениндинуклеотид, ЦТК — цикл трикарбоновых кислот, ЦП — церулоплазмин
Введение
Несмотря на усовершенствование технологических процессов, современное птицеводство связано с рядом стрессовых воздействий на организм сельскохозяйственной птицы, что приводит к снижению ее естественной резистентности и продуктивности. Доказано, что промышленная инкубация яиц неминуемо сопряжена c развитием оксидативного стресса, обусловленного, например, дезинфекцией яиц парами формалина, овоскопированием, переносом в выводные шкафы и др., что приводит к избыточной генерации свободно-радикальных частиц и накоплению продуктов липопероксидации в виде цитотоксич-ных веществ — диеновых и триеновых конъюгатов, МДА, ОШ и др. [10]. В этой связи, становится очевидной высокая значимость профилактики свободно-радикальных патологий уже на стадии инкубации яиц, в частности, с использованием экологически безопасных БАВ, в том числе тех, синтез которых значительно снижается при стрессе, или организм не способен их синтезировать вовсе, а расход таковых в этот период увеличивается в разы.
Известно, что объективная оценка физиологического состояния и интенсивности обменных процессов в организме во многом может быть дана при исследовании системы крови. Система крови, сформировавшаяся в процессе эволюции как специальный механизм объединения различных функциональных структур, принимает непосредственное участие в специфических и неспецифических реакциях организма, влияя на его резистентность и реактивность. Кровь реагирует на различные воздействия, которым подвергается организм, и служит критерием его состояния [3]. Способность эмбриона к поддержанию гомеостаза — важная характеристика его возможности реализовать адаптивный потенциал в ответ на нарушение проокисдантного и антиоксидантного баланса под влиянием стрессовых факторов.
Доказано, что возникшему в результате инкубации окислительному стрессу противостоит антиоксидантная система крови, компонентами которой являются, в частности, ЦП и ТФ.
ЦП функционально связан с кроветворной системой: это один из важнейших антиоксидантов среды, катализирующий окисление Fe2+ в Fe3+ молекулярным кислородом. Кроме того, из упомянутых ранее обзорных статей следует, что окисление железа не единственная и, возможно, не самая главная способность ЦП. Он выполняет различные функции: участвует в острофазных реакциях; регулирует уровень биогенных аминов в организме, в частности, кола-мина и серина. ЦП транспортирует медь и регулирует ее оборот в крови и органах (данный элемент способствует включению железа в структуру гема, являясь важным фактором эритропоэза). Биосинтез ЦП происходит в гепа-тоцитах. Установлено, что ЦП включается в обмен железа
путем мобилизации его из железозапасающих органов, таких как печень и селезенка. Ионы железа встраиваются в апотрансферрин в трехвалентном состоянии. Этому процессу способствует ЦП, который функционирует как феррооксидаза, окисляя двухвалентное железо до трехвалентного: Fe(П) « Fe(Ш) ^ трансферрин ^ синтез гема ^ гемоглобин. Таким образом, ЦП способствует кроветворению благодаря феррооксидазной активности, а также участвует в окислении ионов Fe2+ и их последующем встраивании в апо-форму трансферрина. Доказано, что ЦП также обладает сравнительно небольшой СОД-активностью, он связывает почти 95 % всей меди плазмы крови и характеризуется другим широким спектром оксидазной активности [8].
ТФ принимает непосредственное участие в процессах эритропоэза и гемопоэза. Он относится к бета-глобулинам, синтезируется в печени и зависит от ее функционального состояния, потребности в железе и его резервов в организме. При снижении концентрации железа синтез ТФ возрастает. Функция этого белка состоит в транспортировке и препятствии накоплению в плазме свободных токсических ионов железа, которые способны инициировать свободнорадикальные патологии. Поэтому при ослаблении или отсутствии защитных механизмов избыток свободного железа может играть негативную роль, образуя токсические перекисные радикалы, которые повреждают молекулы и мембраны клеток различных тканей. При разрушении эритроцитов в селезенке, печени и костном мозге железо, высвобождаемое из гема, ТФ транспортирует в костный мозг; часть железа включается в состав ферри-тина и гемосидерина [4]. ТФ обладает антиоксидантными свойствами, по мере насыщения его ионами железа ^е3+] АОА белка снижается. Суммарная АОА системы ЦП:ТФ пропорциональна величине их отношения. АОА сыворотки крови — это интегральный показатель, отражающий ее способность противодействовать развитию свободнорадикальных реакций [9]. Следовательно, оценка состояния антиоксидантной системы по данным показателям может служить объективным критерием для определения резервных адаптационных возможностей организма и обеспечивать своевременную коррекцию прогностически неблагоприятных состояний у развивающегося эмбриона.
Отношение связанного в ТФ железа (сывороточное железо] к содержанию ТФ представляет собой коэффициент (процент] насыщения ТФ железом. Снижение процента насыщения ТФ железом (следствие снижения концентрации железа и роста концентрации ТФ] указывает на анемию, обусловленную недостатком поступления этого микроэлемента. При значительном увеличении процента насыщения ТФ железом в плазме появляется низкомолекулярное железо, которое может откладываться в печени и поджелудочной железе, вызывая повреждение их структуры [4]. В связи с этим, мы считаем актуальным исследование уровня некоторых ключевых транспортных белков, участвующих в антиоксидантной защите организма, а также гематологических показателей у цыплят при использовании коламина, янтарной кислоты и серина.
Коламин — моноэтаноламин, является компонентом фосфолипидов, плазмалогенов, кефалинов, имеет возможность превращения как в холин, так и лецитин. Превращаясь в холин, способен через ФАД поддерживать работу митохондриальной дыхательной цепи, препятствуя ее энергопотерям [1, 6]. Известно, что для эффективных прев-
ращений метаболиту необходимы энергетические субстраты. В ряде предшествующих экспериментов в качестве такого субстрата нами была подобрана янтарная кислота, которая может участвовать в биологическом окислении, энергетическом ЦТК, отдельных важнейших синтезах (гема и т. д.) [5]. Третьим компонентом был выбран серин, который в организме способен подвергаться прямому или непрямому дезаминированию с образованием пировиноградной кислоты, которая в дальнейшем способна включаться в ЦТК. Также серин входит в состав еще одного класса фосфолипидов — фосфатидилсерина [7].
Цель исследования
Установить эффективность использования комплекса, включающего в себя коламин, янтарную кислоту и серин, для профилактики оксидативного стресса у эмбрионов кур, с целью оптимизации их внутреннего гомеостаза, путем активизации тех компонентов антирадикальной защиты, действие которых связано со стимуляцией кроветворения в их организме.
Материалы и методы
Исследования проведены в условиях ФГУП ППЗ «Птичное» на яйцах и цыплятах кур кросса «Шейвер 2000». Опытные группы обрабатывали аэрозольно перед инкубацией и на 19-е сутки инкубирования, контрольные группы обработке препаратами не подвергали. Кровь у цыплят брали во время контрольных убоев, спустя сутки после вывода.
Содержание ЦП и ТФ оценивали посредством имму-нотурбидиметрии, АОА — с помощью потенциометрического метода с использованием медиаторной системы. Коэффициент насыщения ТФ железом рассчитывали по формуле: К (%) = сывороточное железо / ТФ*100. Содержание железа определяли колориметрическим тестом с феррозином, уровень гемоглобина — капиллярным электрофорезом. Гематокрит оценивали посредством метода, основанного на разделении плазмы и эритроцитов центрифугированием. Использовали гематокритную трубку, представляющую собой стеклянную пипетку разделенную на 100 равных частей. Эритроциты подсчитывали под микроскопом в определенном числе квадратов сетки камеры Горяева и пересчитывали на 1 мкл крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Микроскопию мазков крови и фотографирование клеток крови проводили с использованием микроскопа Motic Educator. СОЭ определяли по методу Вестергрена. Содержание МДА, ОШ, активность СОД и пероксидазы оценивали посредством колориметрического метода. Расчеты по биоконтролю инкубации выполняли на компьютерной программе Microsoft Excel, статистическую обработку результатов — по методу Стьюдента (достоверными считали различия при р<0,05). В процессе экспериментов соблюдали этические нормы. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №14-16-00046).
Результаты
У цыплят опытной и контрольной групп взяли кровь для клинического и биохимического анализов по общепринятым методикам (табл. 1).
Как видно из табл. 1, содержание эритроцитов у цыплят опытной группы достоверно возросло в 2 раза, гемогло-бина—на 8,3 %, сывороточного железа—на 5,9 %, меди —
Соотношение транспортных белков церулоплазмина, трансферрина и состояние «красной крови» при использовании некоторых естественных метаболитов у цыплят кросса «Шейвер 2000»
1. Клинико-биохимические показатели крови цыплят суточного возраста (п=5)
Группа
контрольная опытная
Эритроциты, 1012/л 1,59±0,11 3,22±0,13**
Гемоглобин, г/л 92,4±0,87 100,1±0,76**
Гематокрит, % 24,45±0,80 27,32±0,54*
Fe, мкмоль/л 0,017±0,001 0,018±0,001
Си, мкмоль/л 0,0010±0,0003 0,0011±0,0002
ТФ, г/л 1,7±0,05 0,9±0,03**
Коэффициент насыщения, % 1 2
ЦП, мг/дл 1,8±0,04 1,9±0,05
ЦП/ТФ, разы 1,1 2,1
СОЭ, мм/ч 3,8±0,1 3,6±0,2
Примечание. Здесь и далее *— р<0,05; **— р<0,01; ***— р<0,001
на 10 %, гематокрит увеличился на 11,7 %. Увеличение концентрации микроэлементов связано, очевидно, с более эффективным их усвоением из компонентов яиц вследствие стимулирующего воздействия композиции растворов препаратов на развитие желудочно-кишечного тракта у эмбрионов [2]. При этом содержание ТФ у цыплят опытной группы было в 1,9 раза ниже, чем в контроле, что свидетельствует об оптимизации метаболизма железа в крови и о снижении свободно-радикальных реакций в печени. Доказано, что содержание ТФ возрастает при наличии в плазме большого количества токсических форм железа, способных инициировать процессы липо-пероксидации. При этом коэффициент насыщения в опытной группе был в 2 раза выше, чем в контроле, что также характеризует оптимизацию процесса переноса ионов железа у подопытных цыплят. Следует отметить, что увеличение данного показателя не свидетельствует о повышении содержания низкомолекулярного железа, так как в печени увеличение такового зарегистрировано не было.
В свою очередь тенденцию к повышению содержания ЦП на 5,6 % в опытной группе можно рассматривать как адаптационную реакцию организма в ответ на различные негативные воздействия, что позволяет подавить процессы ПОЛ и усилить активность ферментов анти-оксидантной защиты [9].
Кроме того, установлена тенденция к снижению СОЭ на 5,3 %, что, очевидно, также связано с увеличением адаптационных возможностей организма при развитии реакций оксидативного стресса.
Отдельно следует отметить, что естественные метаболиты не оказали отрицательного воздействия на состояние клеток крови, о чем свидетельствуют гематологические исследования и фотографии мазков крови (рис. 1, 2).
В мазках крови цыплят контрольной и опытной групп не отмечено патологических форменных элементов (см. рис. 1, 2), однако концентрация эритроцитов в опытной группе была достоверно выше.
Указанные положительные изменения были связаны со снижением свободно-радикального окисления и, соответственно, процессов липопероксидации у подопытных цыплят (табл. 2).
Интенсивность процессов липопероксидации в опытной группе достоверно ниже, чем в контроле, что сви-
Рис. 1. Фотография мазка крови Рис. 2. Фотография мазка крови цыпленка контрольной группы. цыпленка опытной группы. Окраска по Романовскому—Гимзе. Окраска по Романовскому—Гимзе. Об. 7, ок. 20 Об. 7, ок. 20
детельствует о мембранопротекторных свойствах комплекса выбранных БАВ.
Результаты исследования показателей ПОЛ и АОЗС свидетельствуют о том, что ОАО достоверно возросла на 28 %, уровень вторичного продукта липопероксидации в виде МДА снизился на 11,8 %, а конечного — ОШ — на 25 %. При этом повысилась антиоксидантная ферментативная защита организма цыплят суточного возраста, что выразилось в увеличении активности пероксидазы на 20,8 % и СОД в 1,7 раза. Подобная положительная динамика подтверждает тот факт, что рост антиокси-дантной защиты организма пропорционален не только величине отношения ЦП/ТФ, которое в опытной группе было выше, чем в контроле, но и активации других факторов антиоксидантной защиты.
Вышеперечисленное повлияло на снижение эмбриональной смертности в процессе инкубации яиц, что, в свою очередь, положительно отразилось на показателях биоконтроля инкубации (табл. 3). Обработка инкубационных яиц растворами естественных метаболитов способствовала увеличению вывода цыплят на 9,38 % и выводимости яиц на 9,26 % по сравнению с контролем.
Выводы
Таким образом, исследуемые естественные метаболиты за счет протекции реакций биологического окисления, а также увеличения антиоксидантных возможностей организма, обусловленных повышением соотношения ЦП/ТФ и активизации ОАО, определили снижение интенсивности процессов липопероксидации, подтвердив наше предположение о наличии мембранопротекторных свойств композиции изучаемых БАВ. Скорректированный препаратами в опытной группе антиоксидантный фон обеспечил оптимизацию системы «красной крови», что выразилось в увеличении количества эритроцитов, содержании гемоглобина, гематокрита и сывороточного железа. Указанное определило стабилизацию физиологического гомеостаза в организме эмбрионов, их высокую жизнеспособность в период инкубации и получение высококачественного кондиционного молодняка, более устойчивого к воздействию стресс-факторов.
3. Показатели биоконтроля инкубации, % (п =306)
Партия инкубационных яиц Выводимость Вывод
Контрольная 81,27± 1,67 75,00±1,86
Опытная 90,53±1,26*** 84,38±1,56***
2. Показатели ПОЛ и АОЗС (п=5)
Группа ОАО, % Пероксидаза, ед.опт.пл./л*с СОД, акт/мг гемоглобина ОШ, отн.ед/мл МДА, мкмоль/л
Контрольная 36±1,82 24± 2,00 1,0±0,15 0,4±0,018 1,7±0,181
Опытная 64±2,35** 29±1,22** 1,7±0,13*** 0,3±0,014*** 1,5±0,13***
Библиография
1. Азарнова, Т.О. Научно-практические аспекты профилактики оксидативного стресса, как способа оптимизации условий инкубации и акселерации эмбрионов кур: дис. ... доктора биол. наук: защищена 06.06.2013: утверждена 07.02.2014 / Т.О. Азарнова. — М.: МГАВМиБ, 2013. — 309 с.
2. Азарнова, Т.О. Некоторые аспекты трансовариального питания эмбриона и стимуляции развития их пищеварительного тракта / Т.О. Азарнова, И.С. Ярцева, С.Ю. Зайцев, М.С. Найденский, А.А. Антипов // Международный вестник ветеринарии. — 2012. — № 4. — С. 54-57.
3. Горизонтов, П.Д. Стресс и система крови / П.Д. Горизонтов, О.И. Белоусова, М.И. Федотова. — М.: Медицина, 1983. — 240 с.
4. Данилов, И.П. Клиническое значение маркеров метаболизма железа: ферритин, трансферрин, гепсидин / И.П. Данилов, Л.А. Смирнова, Ж.М. Козич и др. // Здравоохранение. — 2011. — № 9. — С. 30-35.
5. Кондрашова, М.Н. Регуляция янтарной кислотой энергетического обеспечения и функционального состояния ткани / М.Н. Кондрашова. — Пущино: ОНТИ, 1979. — 34 с.
6. Марри, Р. Биохимия человека. Т. 1. / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейе. — М.: Мир, 2009. — 129 с.
7. Подобед, Л.И. Протеиновое и аминокислотное питание сельскохозяйственной птицы: структура, источники, оптимизация / Л.И. Подобед. — Днепропетровск: Печатный дом, 2010. — 240 с.
8. Санина, О.Л. Биологическая роль церулоплазмина и возможности его клинического применения. Обзор литературы. / О.Л. Санина, Н.К. Бердинских // Вопр. мед. химии. — 1986. — Т. 32. — Вып. 5. — С. 7-14.
9. Чепкий, Л.П. Соотношение церулоплазмин-трансферрин и трансферрин-метгемогло-бин в прогнозировании послеоперационных осложнений у больных с внутричерепными внемозговыми краниобазальными опухолями / Л.П. Чепкий, Е.П. Сидорик, М.И. Долгова и др. // Нейрохирургический журнал. — 2001. — №3. — C. 65-73.
10. Betteridge, D.J. What is oxidative stress? / D.J. Betteridge // Metabolism. — 2000. — V. 49. — N. 2. Supl. — P. 3-8.
SUMMARY
I.S. Yartseva, T^. Azarnova, E.N. Indyukhova, A.A. Antipov, M.S. Naydensky, S.Yu. Zaitsev
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin (Moscow).
Ratio of the Transport Proteins Сeruloplasmin, Transferrin, and the Status of the «Red-blood» when Using Some Natural Metabolites in Chickens Cross «Shaver 2000». The complex of natural metabolites — of ethanolamine, succinic acid and serine, having expressed antioxidante properties had a positive impact on the transport of iron and copper in chickens day age, which is reflected in more productive erythropoiesis in the body of chickens. This antioxidant activity of blood serum has increased not only due to the increase of intracellular enzymes of antioxidant protection, but also because the proportional increase in the ratio of extracellular transport proteins: ceruloplasmin and transferrin. The above has helped to reduce the intensity of lipoperoxi-dation silipigni membrane structures of the body cells of the embryo through the leveling of free-radical reactions in the conditions of oxidative stress.
«Российский ветеринарный журнал.
Мелкие домашние и дикие животные» —
научно-практическое издание для специалистов в области ветеринарной медицины и биотехнологии.
Главный редактор — д-р вет. наук, профессор кафедры анатомии, физиологии и хирургии РУДН — С.А. Ягников Издается с 2005 г. при поддержке «УМО высших учебных заведений РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии», входит в Перечень ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий
Подписка на журнал осуществляется через редакцию и каталог Почта России. Издательский дом «Логос Пресс», 127055, Москва, а/я 9. Http://logospress.ru/, e-mail: info@logospress.ru/
Тел/факс: +7 (495) 220-48-16.
Представляем вашему вниманию издание для владельцев и заводчиков мелких домашних животных — журнал «PetСовет»
Издание призвано донести до читателя лучшие традиции классической российской ветеринарной школы и инновационные подходы к содержанию домашних питомцев.
Концепция проекта: создание объективного источника информации для владельцев мелких домашних животных, отражающего мнение профессионалов.
Цель проекта: обеспечение заводчиков и владельцев животных-компаньонов материалами, подготовленными практикующими ветеринарными врачами ведущих ветеринарных клиник России, а также профессиональными кинологами и фелинологами.
Задача проекта: отражение в журнале объективной информации о современных методах и средствах содержания домашних любимцев, безопасности лекарственных средств и эффективности кормов.
Целевая аудитория издания —
владельцы и заводчики мелких домашних животных Территория распространения — Российская Федерация Периодичность — ежеквартально
Распространение:
крупные питомники Российской Федерации (79 регионов), ведущие клиники РФ, профильные выставки, проводимые в РФ
Редакция журнала «PetCовет» приглашает вас к сотрудничеству!
Российский университет дружбы народов / Издательский дом «Логос Пресс» / Ветеринарный центр «МедВет»
